이 프로토콜은 자동화된 플랫폼 Lustro를 활용하여 효모의 광유전학 시스템의 고처리량 특성 분석을 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
광유전학은 유전적으로 인코딩된 빛에 민감한 단백질을 활용하여 세포 행동을 정밀하게 제어합니다. 그러나 원하는 기능을 달성하기 위해 이러한 시스템을 최적화하려면 여러 설계-구축-테스트 주기가 필요한 경우가 많으며, 이는 시간과 노동 집약적일 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 당사는 광 자극과 실험실 자동화를 결합한 플랫폼인 Lustro를 개발하여 광유전학 시스템의 효율적인 고처리량 스크리닝 및 특성 분석을 가능하게 합니다.
Lustro는 조명 장치, 진탕 장치 및 플레이트 리더가 장착된 자동화 워크스테이션을 사용합니다. Lustro는 로봇 팔을 사용하여 이러한 장치 사이의 마이크로웰 플레이트 이동을 자동화하여 광유전학적 균주를 자극하고 반응을 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Lustro를 사용하여 신생 효모 Saccharomyces cerevisiae의 유전자 발현 조절을 위한 광유전학 시스템을 특성화하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜은 조명 장치와 자동화 워크스테이션의 통합을 포함하여 Lustro의 구성 요소 설정을 다룹니다. 또한 조명 장치, 플레이트 리더 및 로봇을 프로그래밍하기 위한 자세한 지침을 제공하여 실험 프로세스 전반에 걸쳐 원활한 작동과 데이터 수집을 보장합니다.
서론
광유전학은 빛에 민감한 단백질을 활용하여 세포의 거동을 고정밀도로 제어하는 강력한 기술입니다 1,2,3. 그러나, 광유전학적 구성물의 프로토타이핑과 최적의 조명 조건을 식별하는 것은 시간이 많이 소요될 수 있으며, 이는 광유전학 시스템을 최적화하기 어렵게 만든다 4,5. 광유전학 시스템의 활성을 신속하게 스크리닝하고 특성화하는 고처리량 분석법은 구성물의 프로토타이핑 및 기능 탐색을 위한 설계-구축-테스트 주기를 가속화할 수 있습니다.
Lustro 플랫폼은 광유전학 시스템의 고처리량 스크리닝 및 특성화를 위해 설계된 실험실 자동화 기술로 개발되었습니다. 마이크로플레이트 리더, 조명 장치 및 진탕 장치를 자동화 워크스테이션(6)과 통합합니다. Lustro는 마이크로웰 플레이트(그림 1 및 보충 그림 1)에서 세포의 자동 배양과 광 자극을 결합하여 다양한....
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프로토콜
이 연구에 사용된 효모 균주는 재료 표에 문서화되어 있습니다. 이들 균주는 22°C 내지 30°C의 온도 범위 내에서 강력한 성장을 나타내며 다양한 표준 효모 배지에서 배양할 수 있습니다.
1. 자동화 워크스테이션 설정
- 자동화된 워크스테이션에 마이크로웰 플레이트를 이동할 수 있는 로봇 그리퍼 암(RGA, 재료 표 참조)을 장착합니다(그림 1).
- RGA 액세스를 제공하는 자동 플레이트 잠금 메커니즘을 사용하여 마이크로플레이트 히터 셰이커(재료 표 참조)를 자동화된 워크스테이션(그림 1(1))에 설치합니다.
- 마이크로플레이트 리더를 자동화된 워크스테이션 옆에 배치하여(그림 1(2)) RGA 접근성을 보장합니다.
- 편리한 RGA 액세스를 허용하는 마이크로플레이트 조명 장치(그림 1
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결과
그림 4A 는 광 유도성 분할 전사 인자에 의해 제어되는 형광 리포터를 발현하는 광유전학 균주에 대한 시간 경과에 따른 형광 값을 보여줍니다. 실험에 사용된 다양한 조명 조건은 조명이 켜져 있는 시간의 백분율을 나타내는 듀티 사이클의 변화에 의해 반영됩니다. 전체 형광 수준은 광 자극의 듀티 사이클에 비례하는 것으로 관찰됩니다. 그림 4B 는 동일한 실험에 해당하는 OD700 값을 보여줍니다. 다양한 조명 조건에서 광학 밀도 판독값의 일관성은 실험 기술이 다양한 조명 조건에서 균주의 성장 속도에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 시사합니다.
시간 경과에 따른 형광 및 광학 밀도를 측정함으로써 광유전학 시스템이 단일 시점에서만 출력을 캡처하는 기술과 비교하여 다양한 광 자극 프로그램에 어떻게 반응하는지 더 깊이 이해할 수 있습니다. 이 시간 경과 데이터는 다.......
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토론
여기에 제시된 Lustro 프로토콜은 배양, 조명 및 측정 프로세스를 자동화하여 광유전학 시스템의 고처리량 스크리닝 및 특성 분석을 가능하게 합니다6. 이는 조명 장치, 마이크로플레이트 리더 및 진탕 장치를 자동화 워크스테이션에 통합함으로써 달성됩니다. 이 프로토콜은 효모 S. cerevisiae 에 통합된 다양한 광유전학적 구조를 스크리닝하고 광 유도 프로그램을 비교하기 위한 Lustro의 유용성을 구체적으로 보여줍니다.
이 프로토콜에서 강조하는 몇 가지 중요한 단계는 Lustro를 효과적으로 활용하는 데 필수적입니다. 조사 중인 광유전학적 구조의 동역학에 부합하는 맞춤형 조명 프로그램의 신중한 설계가 필요합니다. 또한 플레이트 리더의 정확한 교정은 신뢰할 수 있는 측정값을 얻는 데 매우 중요합니다. 조명 프로그램과의 적절한 동기화를 보장하기 위해 필요한 조정을 포함하여 로봇에 대한 실험의 철저한 모의 실행은 스크립트가.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 R35GM128873과 국립과학재단(National Science Foundation)의 보조금 2045493(M.N.M.에 수여)의 지원을 받았습니다. Megan Nicole McClean 박사는 Burroughs Wellcome Fund의 Scientific Interface에서 Career Award를 수상했습니다. ZPH는 게놈 과학 교육 프로그램 5T32HG002760에 대한 NHGRI 교육 보조금의 지원을 받았습니다. 우리는 McClean 연구소 구성원들과의 유익한 토론을 인정하며, 특히 원고에 대한 의견을 제공해 준 Kieran Sweeney에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰 유리 바닥판 #1.5 커버 유리 | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T 느릅나무(히터 셰이커) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS(대체 조명 장치) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96(조명 장치) | Bugaj, et al. 자연 프로토콜. 2019 | ||
| 로봇 그리퍼 암 | Tecan | ||
| Spark (플레이트 리더) | Tecan | ||
| 합성 완전한 미디어 | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (사용자 알림 앱) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 매트&알파; ura3Δ 0::5' Ura3 상동성, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 상동성 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' Ura3 상동성, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 상동성 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' Ura3 상동성, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' 상동성 his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD 한천 | SigmaAldrich | Y1500 |
참고문헌
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Tre....
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재인쇄 및 허가
