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방법 논문

유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells)에서 현탁액의 신장 오가노이드 생성

3.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65698

⸱

2023년 9월 1일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Zhejiang University School of Medicine, 3Hubei Normal University, 4National Clinical Research Center of Kidney Diseases, Jinling Hospital, Nanjing University School of Medicine, 5Clinical Laboratory, The Children’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, National Clinical Research Center for Child Health

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 현탁 배양 조건을 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)에서 신장 오가노이드를 생산하기 위한 포괄적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 연구의 주요 초점은 초기 세포 밀도와 WNT 작용제 농도의 결정에 있어 신장 오가노이드 연구에 관심이 있는 연구자에게 도움이 됩니다.

초록

신장 오가노이드는 다양한 접근법을 통해 유도만능줄기세포(iPSC)에서 생성할 수 있습니다. 이러한 오가노이드는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 잠재적인 치료 응용 분야에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이 글에서는 iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하는 단계별 절차를 제시하며, 이는 PS(Posterior Primitive Streak)에서 시작하여 중간 중배엽(IM)까지 이어집니다. 이 접근법은 동물성 성분이 없는 정의된 배지인 APEL 2 배지에 의존합니다. 4일 동안 고농도의 WNT 작용제(CHIR99021)를 보충한 후 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9)/헤파린과 저농도 CHIR99021를 추가로 3일 동안 보충합니다. 이 과정에서는 성공적인 신장 오가노이드 생성에 매우 중요하기 때문에 iPSC를 시작할 때 최적의 세포 밀도와 CHIR99021 농도를 선택하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜의 중요한 측면은 낮은 점착 플레이트의 현탁 배양으로, IM이 사구체, 근위 관형 및 원위 관형 구조를 포함하는 네프론 구조로 점진적으로 발전할 수 있도록 하며, 모두 시각적으로 이해할 수 있는 형식으로 제공됩니다. 전반적으로, 이 상세한 프로토콜은 다양한 iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하는 효율적이고 구체적인 기술을 제공하여 성공적이고 일관된 결과를 보장합니다.

서론

신장은 기능 단위에 따라 생리적 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 노폐물을 배출하는 네프론은 체액의 구성을 조절할 수 있습니다. 유전적 돌연변이 또는 기타 고위험 요인에 의해 발생하는 만성 신장 질환(CKD)은 결국 말기 신장 질환(ESKD)으로 진행됩니다1,2. ESKD는 네프론의 재생 능력이 제한되어 있기 때문인 것으로 보인다. 따라서 신대체 요법이 필요합니다. 인간 iPSC의 유도 분화는 신장 발달을 연구하고, 환자별 질병을 모델링하고, 신독성 약물 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있는 환자별 3D 신장 오가노이드의 체외 생성을 가능하게 합니다 3,4.

배아 발달 과정에서 신장은 원시 줄무늬(PS)와 구별되는 중간 중배엽(IM)에서 유래합니다. 고전적인 WNT 신호전달 경로는 FGF(FGF9, FGF20) 및 BMP(JNK를 통한 Bmp7 신호전달)5,6,7의 조정된 참여로 IM의 추가적인 분화를 유도할 수 있다. 그들은 신장 전구 세포 (NPC)의 두 가지 중요한 세포 집단을 생산합니다 : 요관 새싹 (UB)과 메타 네프릭 중간엽 (MM)은 각각 수집 덕트와 네프론을 형성합니다 8,9. 각 네프론은 근위 세뇨관 및 원위 세뇨관과 같은 사구체 및 세뇨관 세그먼트와 Henle10,11의 고리로 구성됩니다. 위에서 언급한 이론에 따르면, 현재 발표된 프로토콜은 신장 오가노이드를 유도하기 위해 신호 캐스케이드 및 성장 인자 자극을 모방합니다 5,12.

지난 몇 년 동안 인간 iPSC를 신장 오가노이드 5,6,7,12로 분화하기 위한 많은 프로토콜이 개발되었습니다. Takasato et al.7은 FGF9로 대체하기 전에 CHIR(WNT 작용제) 치료 기간을 최적화했습니다. 프로토콜에 따르면 4일 동안 CHIR에 노출된 후 3일 동안 FGF9에 노출되는 것이 iPSC에서 IM을 유도하는 가장 효과적인 방법입니다. 트랜스웰 필터는 절차에서 배양 형식으로 활용되었습니다. 그러나 이 방법은 초보자에게는 어렵습니다. 따라서 Kumar et al.13은 문화권 형식을 변경하려고 시도하고 문화권을 일시 중단하기로 결정했습니다. 그들은 7일째에 부착 세포를 해리하여 네프론과 같은 구조를 포함하는 배아체(EB)로 조립할 수 있도록 낮은 부착 플레이트에 파종했습니다. 그러나 이러한 방법의 배치 효과는 특히 다른 iPSC에서 분명했습니다. 또한, 다른 문헌에서는 CHIR의 농도가 7 μM에서 12 μM까지 다양하다고 보고했습니다 5,13,14.

우리는 세포 밀도와 CHIR의 농도가 다양한 iPSC의 오가노이드 생성에 영향을 미칠 수 있다고 추측했으며, 이는 실험에서 여러 번 검증되었습니다. 본 프로토콜은 Kumar et al.13 의 연구 방법을 약간 수정하여 사용자에게 단계별 절차를 제공했습니다. 접근 방식의 일정과 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

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프로토콜

본 연구에 사용된 iPSC는 상업적 출처에서 얻은 것입니다. 세포는 시판되는 기저막 매트릭스-코팅 플레이트 상에 mTeSR 배지로 유지하였다( 재료 표 참조). 표 1 은 연구에 사용된 모든 배지 조성물을 포함하고 있다.

1. 분화 및 후방 원시 줄무늬(PS) 유도를 위한 iPSC 도금

  1. 멤브레인 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트에서 2mL DPBS로 iPSC를 세척합니다. 피펫을 사용하여 DPBS를 흡인합니다.
  2. 시중에서 판매되는 세포 분리 용액( 재료 표 참조) 1mL를 추가하여 iPSC를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
  3. iPSC에 mTeSR 1mL를 추가하고 세포가 플라스틱 표면에서 들어 올려졌는지 확인합니다.
  4. 실온(RT)에서 3분 동안 400 x g 에서 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 재현탁시키고 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
  5. 멤브레인 매트릭스로 코팅된 24웰 또는 6웰 플레이트에 다양한 세포 밀도를 파종하고 10μM Rho 키나아제 억제제(Y-27632)가 보충된 mTeSR로 배양합니다( 재료 표 참조). 37°CCO2 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
    참고: PS를 유도하기 위해 최적의 CHIR99021 농도와 적절한 세포 밀도는 iPSC 라인에 따라 다릅니다. 밀도 범위(예: 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.4 * 10 제곱센티미터당3 개의 단일 셀)와 7μM-12μM의 CHIR99021 농도 범위를 파종합니다. 같은 날에 각 밀도와 각 CHIR의 분화를 시작합니다. 24웰 플레이트에서 최적의 CHIR99021 농도와 적절한 세포 밀도를 찾은 다음 6웰 플레이트에서 배양을 확장합니다. 여기서는 6웰 플레이트를 기반으로 하는 프로토콜을 제공합니다.
  6. 다음날 mTeSR을 흡인하고 2mL의 DPBS로 세포를 세척합니다.
  7. 2mL의 I단계 배지(8-12μM CHIR99021를 포함하는 줄기세포 분화 배지)(표 1)를 추가합니다(Day 0 참조).
  8. 37°C 인큐베이터에서 4일 동안 배양한 후 이틀에 한 번씩 단계 I 배지를 새로 고칩니다.

2. 신성 중간 중배엽(IM) 유도

  1. 4일째에 스테이지 I 배지를 제거하고 2mL의 DPBS로 세척합니다.
  2. 2mL의 II기 배지(200ng/mL FGF9, 1μg/mL 헤파린 및 1μM CHIR99021를 포함하는 줄기세포 분화 배지)를 세포에 추가합니다(표 1).
  3. 37°C 인큐베이터에서 배양하고 7일까지 2일마다 배지를 새로 고칩니다.

3. 현탁 배양에서 신장 오가노이드 생성

참고: 0일차부터 7일차까지의 관찰 기간 동안 세포의 상태가 중요합니다. 세포가 성공적인 증식을 보이고 중요한 세포 파편 없이 쌓이면 중간 중배엽(IM)의 성공적인 유도를 보여주며 다음 단계로 진행할 준비가 되었음을 나타냅니다. 그러나 세포가 초기 세포자멸사의 징후를 보인 후 괴사 또는 파손이 뒤따른다면 CHIR99021 또는 세포 밀도의 부적절한 농도를 나타낼 수 있습니다.

  1. 7일째에 II단계 배지를 제거하고 2mL의 DPBS로 세포를 세척합니다.
  2. 세포 분리 용액 1mL를 각 웰에 추가하고 세포가 위상차 하에서 굴절될 때까지 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
  3. 2단계 배지 1mL를 세포에 피펫팅하고 혼합한 후 세포가 표면에서 들어 올려졌는지 확인합니다.
  4. 세포 현탁액을 15mL 튜브에 모으고 실온에서 3분 동안 400 x g 으로 원심분리합니다.
  5. 10μM Rho 키나아제 억제제(Y-27632)가 보충된 3단계 배지(0.1% 메틸셀룰로오스(MC), 0.1% 폴리비닐알코올(PVA)에 200ng/mL FGF9, 1μg/mL 헤파린 및 1μM CHIR99021 함유된 줄기세포 분화 배지) 2mL의 3단계 배지(2mL의 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 재현탁시킵니다)에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다( 재료 표 참조). 부드럽게 섞는다.
  6. 셀 현탁액과 시드를 1:3의 비율로 6웰 저접착 플레이트에 혼합합니다. 플레이트를 37°C 및 5% CO 2의 인큐베이터에서 궤도 셰이커(CO2 내성, 60rpm으로 회전)에 놓습니다.
  7. 24시간 후 Rho 키나아제 억제제(Y-27632)를 제거하고 III기 배지(200ng/mL FGF9, 1μg/mL 헤파린, 1μM CHIR99021, 0.1% MC, 0.1% PVA가 포함된 줄기세포 분화 배지 보충제)를 추가합니다. 2 일 동안 문화. 아래 단계에 따라 서스펜션 문화에서 매체를 변경합니다.
    1. 무균 가위로 1mL 피펫의 끝을 잘라냅니다.
    2. 6웰 플레이트를 부드럽게 흔들어 플레이트 중앙에 오가노이드를 정렬합니다.
    3. 준비된 피펫으로 오가노이드를 15mL 튜브에 흡입하고 5분 동안 그대로 둡니다.
    4. 상층액을 흡인하고 오가노이드를 튜브 바닥에 남겨 둡니다.
    5. 새 배지를 추가하여 오가노이드를 재현탁하고 6웰 저접착 플레이트에 다시 플레이트합니다.
  8. 인큐베이터에서 60rpm으로 접착력이 낮은 플레이트를 계속 흔듭니다. 12일차까지 이틀에 한 번씩 3단계 배지를 교체합니다.
  9. 12일째에 배지를 IV기 배지(0.1% MC 및 0.1% PVA를 함유한 줄기세포 분화 배지)로 변경합니다.
  10. 25일차까지 이틀에 한 번씩 배지를 교체합니다. 오가노이드는 12-25일째에 성숙한 네프론 구조로 점진적으로 발달할 수 있습니다.

4. 신장 오가노이드의 면역형광 염색

  1. 신장 오가노이드를 15mL 튜브에 모으고 2mL PBS로 세척합니다.
  2. 5-10분 동안 굳힌 후 신장 오가노이드를 갓 준비한 2% PFA에 4°C에서 20분 동안 고정합니다.
  3. PFA를 제거하고 0.3% Triton X-100(0.3% PBST)이 함유된 1mL PBS로 오가노이드를 세척하고 셰이커(회전 속도가 60rpm을 초과하지 않음)에서 8분 동안 골고루 흔든 다음 5분 동안 그대로 둔 다음 상층액을 제거합니다. 세 번 반복합니다.
    참고: 오가노이드는 4°C에서 0.3% PBST에서 2-4주 동안 보관할 수 있습니다.
  4. 고정 오가노이드를 10% 당나귀 혈청과 함께 PBST(차단 완충액)( 재료 표 참조)에 4°C에서 밤새 배양합니다.
  5. 1차 항체( 재료 표에 나열됨)를 차단 완충액에 1:300의 비율로 희석합니다.
  6. 1차 항체가 있는 오가노이드를 4°C에서 교반하면서 밤새 배양합니다.
    NOTE: 사구체와 세뇨관이 하나의 오가노이드에서 동시에 염색될 수 있는지 확인하십시오.
  7. 오가노이드를 1mL 0.3% PBST로 세척하고 셰이커(회전 속도가 60rpm을 초과하지 않음)에서 8분 동안 골고루 흔든 다음 5분 동안 그대로 둔 다음 상층액을 제거합니다. 세 번 반복합니다.
  8. 오가노이드를 2차 항체( 재료 표에 나열됨)와 DAPI로 교반하면서 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 4.7단계를 반복합니다.
    참고: 2차 항체와 DAPI는 모두 차단 용액, 2차 항체(1:400) 및 DAPI(1:1000)에 희석되어 있습니다.
  9. 염색 후 오가노이드를 메탄올(각각 25%, 50%, 75%, 100%씩 5분 동안 5분)로 탈수한 다음 벤질 알코올과 벤질 벤조에이트(BABB, 1:2 비율)를 5분 동안 투과시킵니다( 재료 표 참조).
  10. 투명화된 오가노이드를 유리 바닥 접시에 담고( 재료 표 참조) 공초점 현미경으로 검사합니다.
    알림: 이미징 시 유리 접시 바닥에 있는 페트리 접시를 선택하고 침투할 때 BABB를 페트리 접시에 직접 넣어 접시 바닥을 촉촉하게 유지합니다.

5. 시험관 내 덱스트란 흡수 분석

  1. 25일째에 오가노이드를 100μg/mL의 형광 표지 덱스트란( 재료 표 참조)과 함께 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다.
  2. 4시간 후 새로운 배지로 전환하고 광시야 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 배양 이미지를 캡처합니다.

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결과

IM의 생성은 GSK3 억제제 CHIR99021 사용하여 표준 WNT 신호 전달을 활성화한 후 FGF9/헤파린을 활성화하여 달성됩니다. 0일차부터 4일차까지 iPSC는 빠르게 팽창하여 능형형 또는 삼각형 모양을 취합니다. 합류점은 90%-100%에 도달하고 7일까지 고르게 축적됩니다. 현탁 배양 시 응집체는 7일째에 해리된 후 자발적으로 네프론 구조를 형성합니다. 현탁 배양을 통해 생성된 신장 오가노이드는 관형 구조를 나타내며 응집 18일 후 명시야 이미지에서 쉽게 관찰할 수 있습니다(그림 2 및 그림 3).

일반적으로 iPSC의 24웰 플레이트의 웰에서 시작하는 한 번의 분석은 200-300개의 오가노이드를 생성합니다. 이 중 80%-90%는 네프론과 유사한 구조를 포함합니다(그림 2). hiPSC-B1 iPSC 라인의...

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토론

iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하기 위한 자세한 프로토콜이 설명되었으며, 여기에는 기저 배지, 초기 세포 밀도 및 CHIR99021 농도에 대한 약간의 변형이 포함됩니다. 다양한 실험에서 성공적인 신장 오가노이드 생성을 위한 중요한 요소는 중간 중배엽(IM)과 7일째 세포 상태의 초기 분화인 것으로 밝혀졌습니다. 더욱이, 상이한 iPSC 라인은 세포 증식 및 분화 잠재력의 변화를 나타내어 최적의 세포 밀도 및 CHIR99021 농도가 다양해졌습니다 5,13,14. 따라서 각 iPSC 라인에 대한 이상적인 조건을 결정하는 것은 환자 특이적 iPSC에서 상당한 수의 신장 오가노이드를 생산하는 데 필수적입니다.

최적의 조건을 식별하려면 대규모 생산을 위해 배양을 6웰 플레이트로 확장하기 전에 24웰 플레이트를 사용하...

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공개 사항

저자들은 잠재적인 이해 상충을 보고하지 않았습니다.

감사의 글

우리는 과거와 현재의 모든 Mao 및 Hu Lab 구성원이 흥미로운 토론과 프로젝트에 큰 기여를 한 것에 대해 매우 감사합니다. 국립아동보건임상연구센터(National Clinical Research Center for Child Health)의 큰 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidan Hu), 중국 저장성 자연과학재단(No. LQ22C070004 Lidan Hu), 장쑤성 자연과학재단(보조금 번호. BK20210150 Gang Wang에게).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96웰 세포 배양 플레이트, 평면 바닥NESTCat #701003
AccutaseSTEMCELL TechnologiesCat #07920
항체
벤질 알코올Sigma-AldrichCat #100-51-6
벤질 벤조에이트 Sigma-AldrichCat #120-51-4
생물 안전 캐비닛하이얼고양이 #HR40  figure-materials-1  A2
비오틴 anti-human LTL (1:300)Vector LaboratoriesCat #B-1325
혈액 단핵 세포 hiPS-B1 (iPSc, female)N/AN/A
이산화탄소 레벨 쉐이커HAMANYCat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)STEMCELL TechnologiesCat #72054
Costar 다중 6웰 세포 배양 플레이트CorningCat #3516
Costar 초저 부착 6웰 플레이트CorningCat #3471
CryoStor CS10STEMCELL TechnologiesCat #07930
DAPI 염색 솔루션CoolaberCat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647Thermo 과학적인고양이 #D22914
DMEM/F-12 HEPES 자유로운서비스bio고양이 #G4610
당나귀 반대로 양 IgG H& L (Alexa Fluor 647)AbcamCat #ab150179
당나귀 세럼 stosteMeilunbioCat #MB4516-1
D-PBS (칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 제외)Solarbio 생명 과학고양이 #D1040
드라이 배스 인큐베이터상하이 JingxinCat #JX-10
Dylight 488- 염소 안티 마우스 IgG (1:400)Earthox고양이 #E032210
Dylight 488-염소 안티 토끼 IgG (1:400)어스톡고양이 #E032220
다일라이트 549-염소 안티 마우스 IgG (1:400)어스캣 #E032310
다이라이트 549-염소 안티 토끼 IgG (1:400)어톡고양이 #E032320
다일라이트 649-염소 안티 래빗 IgG (1:400)어톡캣 #E032620
실험 모델: 세포주
Forma Steri-Cycle CO2 인큐베이터Thermo SCIENTIFICCat #370
Geltre LDEV-FreeGibcoCat #A1413202
Glass Bottom Culture DishesNESTCat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)Santa Cruz BiotechnologyCat #sc-20607
Heparin Solution (Cell Culture supplement)STEMCELL TechnologiesCat #07980
인간 재조합 FGF-9STEMCELL TechnologiesCat #78161
도립 현미경OLYMPUSCat #CKX53
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경OLYMPUSCat #FV3000
메틸 셀룰로오스Sigma-AldrichCat #M7027
마이크로 원심분리기HENGNUO고양이 # 2-4B
마우스 anti-human CD31 (1:300)BD Biosciences고양이 # 555444
마우스 anti-human ECAD (1:300)BD Biosciences고양이 # 610182
마우스 anti-human Integrin beta 1 (1:300)AbcamCat #ab30394
마우스 anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)Thermo Scientific고양이 # 39795
Mowiol 4-88 ( Polyvinylalcohol 4-88)Sigma-AldrichCat #81381
mTeSR1 5X SupplementSTEMCELL TechnologiesCat #85852
mTeSR1 기초 매체STEMCELL TechnologiesCat #85851
Nunc CryoTube 바이알Thermo SCIENTIFICCat #377267
기타
토끼 anti-human GATA3 (1:300)세포 신호 전달 기술고양이 #5852S
토끼 안티 휴먼 LRP2 (1:300)사파이어 생명 과학고양이 #NBP2-39033
토끼 안티 휴먼 Synaptopodin (1:300)AbcamCat #ab224491
토끼 안티 휴먼 WT1 (1:300)AbcamCat #ab89901
Rabbit 안티 마우스 PDGFR (1:300)AbcamCat #ab32570
재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA)YEASEN고양이 #20901ES03
양 항 인간 NPHS1 (1:300)R & D SystemsCat #AF4269
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL TechnologiesCat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)Gene TexCat #GTX85902
Versene (1X)GibcoCat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL TechnologiesCat #72304
스 톡스 스 스

참고문헌

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