여기서는 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도를 설명하여 혈관 주위 지방 조직 기능 및 혈관 세포와의 관계를 연구할 수 있습니다.
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방법 논문
Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
혈관 주위 지방 조직(PVAT)은 혈관을 둘러싸고 흰색, 베이지색 및 갈색 지방 세포의 표현형을 나타내는 지방 조직 저장소입니다. 최근의 발견은 혈관 항상성을 조절하고 심혈관 질환의 발병에 참여하는 PVAT의 중심적인 역할을 조명했습니다. PVAT 특성 및 규제에 대한 포괄적인 이해는 미래 치료법 개발에 매우 중요합니다. 대동맥 주위 지방세포의 1차 배양은 PVAT 기능과 대동맥 주위 지방세포와 혈관 세포 간의 누화를 연구하는 데 유용합니다. 이 논문은 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방생성 유도를 위한 경제적이고 실현 가능한 프로토콜을 제시하며, 이는 시험관 내 지방 형성 또는 지방 형성 모델링에 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 어린 마우스에서 대동맥 주위 지방 세포를 배양하기 위한 조직 처리 및 세포 분화를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 PVAT 기능 조사를 위한 벤치 측의 기술적 초석을 제공할 것입니다.
서론
성숙한 지방세포와 기질혈관분획(SVF)의 혼합물로 구성된 혈관주위 구조인 혈관주위 지방조직(PVAT)은 분비체를 통해 인접한 혈관벽과 상호작용하는 것으로 여겨진다1. 혈관 항상성의 중요한 조절자인 PVAT 기능 장애는 심혈관 질환의 발병기전과 관련이 있습니다 2,3,4. 지방 세포 조직의 SVF는 내피 세포, 면역 세포, 중피 세포, 신경 세포, 지방 줄기 및 전구 세포(ASPC)를 포함한 여러 예상 세포 집단으로 구성됩니다5,6. 지방 조직의 SVF에 존재하는 ASPC가 성숙한 지방 세포를 발생시킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있다5. SVF는 PVAT에서 성숙한 지방 세포의 중요한 공급원으로 추론됩니다. 여러 연구에 따르면 PVAT-SVF는 특정 유도 조건 6,7,8에서 ....
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프로토콜
동물 프로토콜은 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 부속 상하이 흉부 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: KS23010)의 승인을 받았으며 관련 윤리 규정을 준수했습니다. 이 실험에는 4-8주 된 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스가 선호된다.
1. 수술 도구, 완충액 및 배양 배지의 준비
- 수술 도구(예: 수술용 가위 및 표준 집게)를 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다. 미세 수술 기구를 75% 알코올로 소독합니다.
- 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)와 10% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 또 다른 10mL의 PBS를 준비합니다.
알림: 다음 섹션에서 구체적으로 언급되지 않은 경우 PBS는 일반 멸균 PBS를 나타냅니다. - Krebs Ringer HEPES BSA 완충액 준비: 1% 소 혈청 알부민(BSA), Krebs Ringer 용액에 용해된 20mM HEPES.
- 신선한 분해 용액 준비: Krebs Ringer HEPES BSA 완충액에 용해된 유형 1 콜라겐분해효소(1mg/mL) 및 dispase II(4mg/mL). 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다....
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결과
위에서 설명한 이 프로토콜을 사용하여 쥐 흉부 대동맥을 둘러싼 PVAT를 조심스럽게 분리했습니다(그림 1A-D). 멸균 가위(그림 1E,F)를 사용하여 PVAT를 세척하고 작은 조각으로 다진 후(그림 1E,F), 조직 단편을 제1형 콜라겐분해효소(1mg/mL) 및 디스파제 II(4mg/mL)를 함유한 소화액에서 분해하고 셰이커에서 37°C에서 30-45분 동안 배양했습니다(그림 1G). 절단된 조직을 70μm 세포 스트레이너를 통해 50mL 원심분리 튜브로 변형시켰습니다(그림 1H). 원심분리 후 세포 펠릿을 수집하였다(그림 1I).
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토론
우리는 마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 SVF 유래 지방세포의 분리 및 지방 유도를 위한 실용적이고 실현 가능한 접근 방식을 제안합니다. 이 프로토콜의 장점은 간단하고 경제적이라는 것입니다. 조직이 부족하면 SVF 밀도가 낮아지고 성장 상태가 좋지 않아 궁극적으로 지방 생성 효율에 영향을 미칠 수 있으므로 적절한 수의 마우스가 성공적인 분리에 매우 중요합니다. 또한 마우스 나이는 SVF의 지방 생성 잠재력이 나이가 들면서 감소하기 때문에 고려해야 할 중요한 요소입니다. 혈관 조직의 오염을 최소화하면서 PVAT를 빠르고 신중하게 분리하는 것이 중요합니다. 소화 용액은 또한 유형 1 콜라겐 분해 효소에 dispase II의 추가가 세포의 소화 속도와 수율을 향상시킬 수 있기 때문에 핵심 구성 요소입니다. 과소화는 잠재적으로 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있으므로 소화 과정에 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 멸균 기술을 따르고 프로토콜 전반에 걸쳐 적절한 배양 조건을 유지하는 것이 필수적입니다.
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공개 사항
저자는 재정적 또는 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립자연과학재단(82130012 및 81830010)과 상하이 흉부 병원의 기초 연구를 위한 육성 프로젝트(보조금 번호: 2022YNJCQ03)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 &무; M 주사기 필터 | PALL | 4612 | |
| 12-웰 플레이트 | Labselect | 11210 | |
| 15 mL 원심분리기 튜브 | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 작동 농도 |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 작동 농도 |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 작동 농도 |
| 안티-PPAR&감마; | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 작동 농도 |
| 안티-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 작업 농도 |
| 안티-알파;-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 작업 농도 |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 마우스 4-8주 남녀 | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| 세포 여과기 70 & micro; m, 나일론 | Falcon | 352350 | |
| 송아지 피부의 콜라겐 | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| 콜라겐 분해 효소, 유형 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| 덱사메타손 | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μ M |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| 태아 소 혈청 | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | 시그마-알드리치 | H4034-25G | 20 mM |
| 고포도당 DMEM | 하이클론 | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5mM |
| 인큐베이터(오비탈 셰이커 포함 | ) Shanghai longyue Instrument Eruipment Co., Ltd. | LYZ-103B | |
| 인슐린(소) | 시그마-알드리치 | 11070-73-8 | 1 μ M |
| 이소플루란 | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer의 솔루션 | 가격 | 빛 | 으로부터 보호할 PB180347 |
| 미세수술용 집게 | Beyotime | FS233 | |
| 미세수술용 가위 | Beyotime | FS217 | |
| 오일 레드 O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (인산염 완충 식염수) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 작업 농도 |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 작업 농도 |
| Rosiglitazone | 시그마-알드리치 | R2408 | 1 μ M |
| 표준 집게 | Beyotime | FS225 | |
| 외과 가위 | Beyotime | FS001 |
참고문헌
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al.
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