유리체 망막 림프종의 진단 및 모니터링을 위한 유리체 및 수성 체액 검체의 Cell-Free DNA 추출

요약

유리체 및 수액에서 cell-free DNA를 추출하여 유리체 망막 림프종 진단을 위한 분자 연구를 수행하는 절차가 여기에 확립되어 있습니다. 이 방법은 샘플의 세포 구성 요소에서 DNA를 동시에 추출하거나 보조 테스트를 위해 비축할 수 있는 기능을 제공합니다.

초록

유리체 망막 림프종(VRL)은 종종 원발성 중추신경계 미만성 거대 B세포 림프종으로 분류되는 공격성 림프종을 나타냅니다. VRL을 진단하기 위해 유리체액과 최근에는 수액과 같은 표본을 수집합니다. 이러한 검체에 대한 VRL 진단 테스트에는 세포학, 유세포 분석 및 분자 테스트가 포함됩니다. 그러나 세포 병리학 및 유세포 분석은 세포 DNA를 사용한 분자 검사와 함께 온전한 전체 세포를 필요로 합니다. 문제는 유리체와 수액이 일반적으로 세포성이 낮고 많은 세포가 수집, 저장 및 처리 중에 파괴된다는 사실에 있습니다. 더욱이, 이러한 시편은 유리체액의 높은 점도와 유리체 및 수액의 부피가 적기 때문에 분자 테스트에 추가적인 어려움을 초래합니다. 본 연구는 유리체 및 수성 검체에서 cell-free DNA를 추출하는 방법을 제안한다. 이 접근법은 세포 DNA 추출을 보완하거나 이러한 검체의 세포 구성 요소를 세포학 및 유세포 분석을 포함한 다른 진단 방법에 활용할 수 있도록 합니다.

서론

유리체 망막 림프종(VRL)은 원발성 중추신경계 미만성 거대 B세포 림프종 ^1,2,3과 관련된 공격적인 림프종입니다. VRL은 일반적으로 중추 신경계에 관여하기 때문에 치명적이다 ^1,2. ^드물기는 하지만1,4, VRL은 종종 후포도막염 및 기타 유리체 망막 질환과 유사한 증상을 나타낸다 ^4,5. 따라서 포도막염 증상을 보이는 환자는 VRL을 확인하거나 배제하기 위한 진단이 필요합니다.

최근에는 VRL 진단에 대한 합의된 기준이 발표되었는데, 여기에는 임상 검사와 실험실 결과의 조합이 포함된다⁶. VRL을 진단하는 데 일반적으로 사용되는 검체에는 유리체액(vitreous humor)이 있으며, 최근에는 수액(aqueous humor)⁷이 있다. 유리체액은 유리체 절제술(pars plana vitrectomy)이라고 불리는 수술을 통해 얻을 수 있으며, 이를 통해 눈의 후방 분절에 접근할 수 있다⁸.

제시된 프로토콜에서, 수성 체액 및 유리체 체액 표본 모두 세포 및 cfDNA 추출을 위해 수집되었습니다. 환자를 마취하고 각막 림부로부터 약 4mm 떨어진 곳에 투관침을 배치한 후, 각막 림부에서 1mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여 약 100-200μL의 수액 샘플을 얻었다. pseudophakic 환자의 경우, 무균 공기를 주입에 도입하여 희석되지 않은 유리체를 얻었고, 더 많은 양의 희석되지 않은 유리체(최대 3.5mL)를 수집할 수 있었습니다. phakic 환자에서, 대략 500 내지 1000 μL의 희석되지 않은 유리체를 제거한 후 균형 잡힌 염 용액을 주입하였다. 몇몇 경우에, 2차적으로 희석된 유리체(500 내지 2,000 μL)를 주입액으로 전환하고 유리체 스커트 내에 유리체를 배치하여 이 샘플을 수득하였다. 가장 희석된 유리체 분획은 수술 종료 시 카세트 백(보충 그림 1)을 보존하여 수집했습니다. 이 백이 병리학 부서에 도착하면, 후속 DNA 추출을 위해 이 백에서 유체를 원뿔형 튜브로 배출하여 묽은 유리체를 얻었습니다.

유리체액의 세포병리학(cytopathology)은 종종 황금 표준(gold standard)으로 간주된다⁹. 그러나 여러 연구에서 처리 및 최소 세포성으로 인해 제한된 감도가 입증되었습니다^10,11,12. 유세포 분석은 클론 B-세포를 식별하는 데 도움이 될 수 있지만 낮은 세포성과 거대 림프종 세포의 취약성으로 인해 제한될 수도 있습니다^13,14,15. 세포병리학과 유세포분석 모두 온전한 전체 세포를 필요로 합니다. 이러한 세포의 대부분은 수집, 저장 및 처리 중에 파괴됩니다. 온전한 세포에서 추출한 DNA(세포 DNA)를 사용하여 분자 검사를 수행할 때도 이와 동일한 한계가 있습니다. 또한 이러한 모든 시험에 대해 제한된 유리체 표본을 분할하면 각 시험에 사용할 수 있는 재료의 양이 줄어듭니다.

cell-free DNA(cfDNA)는 온전한 세포를 필요로 하지 않는 또 다른 DNA 공급원입니다. 유리체 표본의 cfDNA는 VRL ^16,17 및 포도막 흑색종¹⁸의 검출에 사용되었습니다. 이 프로토콜에서는 유리체 및 수성 유체에서 세포 및 cell-free DNA를 추출하여 VRL을 검출합니다.

프로토콜

본 프로토콜은 휴먼 케어 가이드라인을 따르며 미시간 대학교 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. IRB로부터 이에 대한 사전 동의를 받았습니다. 관련된 환자에 대한 관련 포함 또는 제외 기준은 없습니다.

1. 세포 성분과 cell-free 성분의 분리

참고: VRL 진단 테스트를 위해 유리체(희석되지 않은, 주입을 시작하기 전에 채취한 유리체 절제술의 액체), 카세트 백 내의 희석된 유리체(그림 1) 및 수액(눈의 전방에서 나온 액체)의 세 가지 유형의 샘플을 받을 수 있습니다.

1. 점성이 매우 높은 희석되지 않은 유리액의 경우 피펫팅을 용이하게 하기 위해 3-5mL PBS로 희석하십시오.
2. 카세트 백(보충 그림 1) 내에 희석된 유리체의 경우 50mL 코니컬 튜브(유체 45mL당 1개)로 유체를 배출합니다.
3. 수액은 부피가 매우 적습니다(<200μL). 세포의 최대 회수율을 보장하기 위해 샘플을 1.5mL 튜브로 옮기고 샘플이 수집된 원래 500μL 미세 원심분리 튜브를 동일한 부피의 PBS로 헹구고 1.5mL 튜브에 추가합니다.
4. 유리체 또는 수성 유체를 실온에서 3,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
5. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오.

2. 세포 성분에서 DNA 추출

1. 적당량의 세포 용해 용액(작은 펠릿의 경우 300μL, 큰 펠릿의 경우 1mL 이상)을 추가합니다( 재료 표 참조). 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
2. 완전히 용해되면 단백질 침전물 용액의 총 부피의 1/3(300μL 용해물의 경우 100μL)을 추가합니다( 재료 표 참조).
3. 20-30초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 실온에서 3,000 x g 에서 3분간 돌립니다.
4. 300μL의 이소프로판올을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 이전 단계의 상층액을 이소프로판올 튜브로 조심스럽게 피펫팅합니다.
5. 1.5μL의 20mg/mL 글리코겐(300μL 용해용)을 추가합니다( 재료 표 참조).
6. 반전으로 잘 혼합한 다음 샘플을 -20°C 냉동고에 1시간에서 하룻밤 동안 넣어 DNA 침전을 돕습니다.
7. 실온에서 3,000 x g 에서 5분 동안 1.5mL 튜브를 원심분리합니다. 이소프로판올을 피펫으로 분리합니다.
8. 0.5mL의 70% 에탄올을 넣고 튜브를 뒤집어 펠릿을 세척합니다.
9. 실온에서 3,000 x g 에서 1분 동안 회전시키고 에탄올을 디캔팅합니다. 에탄올 세척을 한 번 반복하십시오.
10. 깨끗한 거즈에 튜브를 뒤집어 용액을 배출하고 펠릿 또는 디캔트를 건조시킵니다. 마이크로 원심분리기에서 DNA를 빠르게 회전시키고 미세한 팁의 일회용 피펫 팁으로 남은 에탄올 한 방울을 피펫팅합니다(튜브에 잔류 에탄올이 남아 있지 않으면 DNA가 건조되고 5-10분 안에 수화될 준비가 되어야 함).
11. 45μL의 DNA 수화 용액( 재료 표 참조)을 건조된 DNA 펠릿에 추가합니다.
12. 튜브를 50°C의 가열 블록에 넣고 1-2시간 동안 용해되도록 합니다. 수화 과정을 가속화하기 위해 DNA를 위아래로 피펫화합니다.
    알림: 샘플이 너무 점성이 있는 경우 DNA 수화 용액을 더 추가합니다.

3. Cell-free DNA 추출

1. 1.5단계의 상층액의 양은 가변적입니다. 상층액의 모든 밀리리터에 대해 70μL의 컨디셔닝 버퍼( 재료 표 참조)를 추가합니다.
2. 볼텍싱으로 클리어링 비드를 잘 섞습니다. <14mL의 cell-free 상층액을 처리하는 경우 10μL의 클리어링 비드를 추가하고, 14-40mL를 처리하는 경우 20μL를 추가합니다.
3. 샘플/비드 혼합물을 와류로 잘 혼합합니다. 실온에서 3,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
4. 펠릿을 방해하지 않고 10μL의 클리어링 비드를 사용하는 경우 100μL, 20μL의 클리어링 비드를 사용하는 경우 200μL를 남기고 상층액을 피펫팅합니다.
5. 동일한 부피의 소변 펠릿 분해 완충액( 재료 표 참조)을 펠릿에 추가하고 볼텍싱 또는 피펫팅을 통해 펠릿을 잘 재현탁합니다.
6. 재현탁 펠릿에 Proteinase K(5% (v/v))를 추가하고(예: 200μL 혼합물에 Proteinase K 10μL 추가) 부드러운 소용돌이로 잘 혼합합니다.
7. 펠릿 혼합물을 55°C에서 30분 동안 배양합니다.
8. 게놈 용해 완충액 1부피( 재료 표 참조)를 분해 혼합물(예: 210μL 게놈 용해 완충액에 210μL의 분해 혼합물)에 추가하고 와류로 혼합합니다.
9. 시중에서 판매되는 스핀 컬럼( 재료 표 참조)을 새 수집 튜브로 옮깁니다.
10. 스핀 컬럼에 200μL의 Urine DNA Prep 완충액을 추가하고 실온에서 1분 동안 ≥16,000 x g 으로 원심분리한 후 플로우 스루를 버립니다.
11. 700μL의 소변 DNA 세척 완충액을 컬럼에 추가하고 실온에서 ≥16,000 x g 에서 1분 동안 원심분리한 후 플로우스루를 버립니다.
12. 200μL 소변 DNA 세척 완충액으로 이 단계를 반복합니다.
13. 스핀 컬럼을 DNase/RNase가 없는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
14. 적절한 양의 DNA 용출 완충액(수행할 분자 테스트에 따라)을 컬럼 매트릭스에 직접 추가하고 실온에서 3-5분 동안 그대로 둡니다.
    참고: 예시 사례에서 30μL의 용출 완충액이 사용되었습니다. 추가 테스트가 필요한 경우 더 많은 용리 버퍼가 사용됩니다.
15. 실온에서 ≥16,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 cell-free DNA를 얻습니다.

결과

이러한 추출 방법은 유리체(4개) 및 수성(4개) 표본의 세포 DNA와 비교하여 cell-free DNA의 적절한 수율 및 증폭성을 보장하기 위해 제한된 수의 경우에 수행되었습니다. 이러한 샘플에서 이러한 유체의 cell-free 성분에서 얻은 DNA는 세포 성분의 수율과 유사합니다(표 1). 이러한 샘플의 세포 및 cfDNA는 VRL 관련 돌연변이 MYD88 L265P와 같은 분자 테스트를 사용하여 평가되었습니다. MYD88 L265P에 대한 대립유전자 특이적 Real-Time PCR(그림 1)은 세포 DNA와 cfDNA 모두에서 이 VRL 관련 돌연변이의 검출을 보여줍니다. 이 예에서, 질병의 부담은 더 낮은 (주기 역치(Ct))에 의해 설명되는 바와 같이, cell-free 성분에서 더 높은 것으로 나타난다. 이 데이터는 이 방법을 사용하여 유리체 및 수액에서 추출한 cfDNA가 진단 분자 테스트에도 적용할 수 있는 DNA 소스를 생성한다는 것을 보여줍니다.

그림 1: MYD88 L265P 대립유전자 특이적 Real-Time PCR. 세포 및 cell-free DNA에 대한 MYD88 L265P 대립유전자 특이적 real-time PCR을 보여주는 대표적인 증폭 플롯(각 PCR 반응은 중복으로 수행됨). 사이클 임계값(Ct)에 대한 임계값은 녹색 선으로 표시됩니다. cfDNA(청색 및 갈색 미량)와 세포 DNA(적색 및 녹색 미량)의 증폭이 각각 중복으로 수행되어 임계값에 도달하는 지점이 표시됩니다. 배경 형광은 1.00e-003 근처에 존재합니다. 더 낮은 Ct에 의해 입증된 바와 같이 더 높은 돌연변이 부담이 cell-free 성분에 존재합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

	세포의	셀 프리(Cell-Free)
유리질 1	130.5	67.5
유리질 2	337.5	105
유리질 3	150	168
유리질 4	1816	654
수용성 1	58.5	40.5
수용성 2	153	225
수용성 3	117	454.5
수용성 4	TL	27

표 1: 세포 및 cell-free DNA 추출 수율. 형광 측정 DNA 정량을 기반으로 한 4명의 다른 개인으로부터 4개의 희석되지 않은 유리체 및 4개의 수액(전방) 체액에 대한 DNA 수율(ng). TL = 너무 낮아 정량화할 수 없습니다.

보충 그림 1: 유리체 카세트 백. 묽은 유리체액이 들어 있는 유리체 카세트 백의 예. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

유리체 망막 림프종(VRL)은 공격적인 거대 B 세포 림프종(^large B-cell lymphoma)^1,2,3으로, 증상은 다른 유리체 망막 질환과 유사할 수 있다 ^4,5. 유리체의 분자 검사, 그리고 최근에는 수액의 분자 검사가 VRL의 진단을 내리거나 배제하는 중요한 방법이 되었습니다. 그러나 이러한 유체는 부피가 매우 적고 종종 세포성이 낮습니다. 이러한 유체 내의 많은 세포는 수집, 저장 및 처리 중에 손상될 수 있다^13,14,15. 결과적으로, 이러한 표본의 DNA 수율은 종종 낮습니다. 또한 이러한 체액의 세포는 세포 병리학 및 유세포 분석을 포함한 다른 진단 방법과 공유해야 합니다. 이러한 체액 내의 cell-free DNA(cfDNA)는 온전한 세포를 필요로 하지 않는 또 다른 DNA 공급원을 제공합니다.

이 프로토콜은 유리체 또는 수성 유체의 세포 및 cell-free 구성 요소를 분리합니다. 유리체는 PBS로 희석되어 점도로 인해 피펫팅이 가능합니다. 수성 유체는 이 매우 적은 부피의 유체의 최대 회수를 보장하기 위해 처리됩니다.

이들 두 성분의 DNA 수율의 비교는 세포-무함유 성분으로부터 상당한 추가적인 핵산이 유도될 수 있음을 보여준다. MYD88 L265P 대립유전자 특이적 Real-Time PCR과 같은 cfDNA의 분자 검사는 세포 구성 요소뿐만 아니라 유리체 및 수용액의 cell-free 구성 요소에서도 VRL을 검출할 수 있음을 보여줍니다. 대부분의 경우 VRL의 상대적 양은 셀룰러보다 무셀 부품에서 더 높습니다(그림 1).

유리체 및 수성 유체의 cell-free 성분을 추출하면 폐기될 수 있는 이러한 유체 성분의 분자 평가가 가능합니다. VRL은 세포 및 무세포 성분으로 표현되기 때문에 세포 DNA와 cfDNA를 결합하여 이러한 제한된 표본에서 사용 가능한 DNA를 최대화할 수 있습니다. 대안적으로, 이러한 유체의 cell-free 성분은 분자 테스트에 사용될 수 있고, 세포 성분은 온전한 세포가 필요한 테스트, 즉 세포 병리학 및 유세포 분석에 사용될 수 있습니다. 이 접근 방식은 VRL 검출을 위한 각 테스트의 감도를 손상시킬 수 있는 각 테스트에 할당되는 이러한 유체의 별도 분취를 방지할 수 있습니다. 유리체 및 수성 표본에서 이 방법의 성공을 감안할 때, 이 방법은 분자 테스트에 사용할 수 있는 DNA의 양을 증가시키기 위해 다른 제한된 유체에서도 유용할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-프로판올 (이소프로판올)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA 클린 & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene 세포 용해 용액	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA 수화 용액	Qiagen	158916
Gentra Puregene 단백질 침전 용액	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA 소변 키트	Zymo Research	D3061	컨디셔닝 버퍼; 또한 클리어링 비드, Proteinase K 및 스핀 컬럼
Ultrapure Glycogen, 20 µ를 포함; g/&마이크로; L (20 mg/mL)	써모 피셔/인비트로젠	10814010