여기서는 유비퀴틴 리가아제, Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 및 세레블론(CRBN)을 포함하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 본원에 예시된 생물물리학적 방법에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)이 포함된다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용
이 논문에서
요약
초록
분해를 표적으로 하는 E3 리가아제와 단백질은 다단계 공정에서 이종 이작용 분자에 의해 복합체를 형성하도록 유도될 수 있습니다. 관련된 상호 작용의 역학 및 열역학은 유비퀴틴화의 효율성과 결과적으로 단백질의 분해에 기여합니다. 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량계(ITC)와 같은 생물물리학 기술은 이러한 상호 작용의 최적화에 사용할 수 있는 귀중한 정보를 제공합니다. 두 가지 모델 시스템을 사용하여 삼원 복합체 형성의 협력성과 결합 역학에 대한 '후크 효과'의 영향을 이해하기 위한 생물물리학 분석 도구 키트를 확립했습니다. 한 사례에서, Brd4BD2와 VHL 사이의 삼원 복합체 형성을 유도하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTAC) 분자를 평가하였다. 이종 이작용 분자 MZ1은 Brd4BD2 단백질(SPR KD = 1nM, ITC K D = 4nM)과 VHL 복합체(SPRKD = 29nM, ITC K D = 66nM) 모두에 대해 nM 친화도를 갖습니다. 이 시스템을 위해 삼원 복합체 형성의 협력성을 입증하는 발표된 결과를 재현하는 강력한 SPR, BLI 및 ITC 분석이 개발되었습니다. 다른 경우에는 46.0kDa 단백질, PPM1D 및 세레블론[CRBN(319-442)] 사이의 삼원 복합체를 유도하는 분자를 연구했습니다. 이종 이작용 분자인 BRD-5110은 PPM1D에 대해 SPR KD = 1nM이지만 잘린 CRBN(319-442) 복합체(SPR KD= ~ 3μM)에 대한 결합은 훨씬 약합니다. 이 경우 SPR에서 CRBN에 대한 바인딩이 포화 상태가 아니므로 "후크 효과"가 발생했습니다. SPR, BLI 및 ITC에 대한 처리량 및 시약 요구 사항을 평가하고 PROTAC 프로젝트에 적용하기 위한 일반적인 권장 사항을 제공했습니다.
서론
세포 내 단백질의 폴리유비퀴틴화는 유비퀴틴 리가아제 계열의 효소를 포함하는 엄격하게 조절되는 과정입니다 1,2. 이 경로의 말단 효소는 유비퀴틴 분자를 단백질 결합 파트너에 공유 결합하는 E3 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)이다3. 이러한 단백질 결합 파트너의 폴리유비퀴틴화는 프로테아좀4에 의한 단백질 분해를 표적으로 합니다. 이 시스템은 질병에 관여하는 단백질의 분해를 유도하기 위해 치료적으로 활용된 단백질 항상성 과정의 일부이다5. Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 또는 세레블론(CRBN)과 같은 E3 유비퀴틴 리가아제 간의 상호작용을 유도하는 소분자는 일반적으로 분해 표적이 되는 단백질에 결합하는 탄두에 유연한 링커에 의해 연결된 E3 리가아제 결합 탄두로 구성됩니다. 이러한 이종이기능성 분자는 일반적으로 키메라 또는 PROTACS6를 표적으로 하는 단백질 분해라고 합니다.
PROTACS의 개발에는 세포 내 단백질의 분해를 유....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 단백질은 문헌 프로토콜18에 따라 우수한 수율과 순도(>80%)로 대장균에서 과발현되었습니다. 비오틴화는 BirA-촉매 반응18을 사용하여 수행하였다. 모든 저분자는 100% DMSO에서 1mM 원액으로 준비되었습니다. 여기에 설명된 절차에는 특수 실험실 안전 장비나 예방 조치가 필요하지 않습니다. 표준 실험실 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다(예: 실험실 가운, 보안경 및 장갑).
이 연구에 적용된 단백질은 다음과 같습니다.
VHL: ElonginB의 C-말단에 Avi-tag가 있는 비오틴화된 VHL(53-213)/ElonginB(1-104)/ElonginC(17-112) 복합체.
Brd4BD2: 태그가 지정되지 않은 Brd4BD2(333-460)
CRBN: N 말단에 Avi-tag가 있는 비오틴화된 CRBN(319-442)
PPM1D: N 말단에서 태그가 지정되지 않은 이중 또는 이중 His8 태그가 지정된 PPM1D(1-420)
이 연구에 적용된 소분자는 다음과 같습니다.
MZ1 (MW = 1002.6 Da)....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
VHL: MZ1 이원 복합체 및 VHL: MZ1: Brd4BD2 삼원 복합체의 특성 분석은 매우 유사한 버퍼를 사용하여 그림 2(ITC), 그림 3(BLI) 및 그림 4(SPR)에서 찾을 수 있습니다. 직교 분석에서 추출한 KD는 일관성이 있습니다. 협력성은 K D (이진) / KD (삼항)로 계산할 수 있으며, 이는 매우 양수 (ITC에서 15 또는 SPR에서 26)입니다.
CRBN:PROTAC의 특성화: PPM1D 시스템은 SPR에 의해 수행되었습니다(그림 5A-D). CRBN은 삼원 복합체 형성의 관찰을 용이하게 하기 위해 ~.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
PROTAC 분자와 단백질 결합 파트너 간의 이원 및 삼원 상호 작용에 대한 생물물리학적 특성 분석은 널리 사용되는 세포 시스템과 관련하여 독특하고 보완적인 통찰력을 제공할 수 있습니다. PROTAC 분자의 각 탄두와 단백질 결합 파트너 간의 친화도를 이해하면 이러한 상호 작용을 최적화하기 위한 의약 화학 노력을 안내하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전에 발표된 삼원 PROTAC 복합체의 결정 구조는 링커 영역의 원자가 단백질 결합 파트너(16,20) 중 하나 또는 둘 모두와 상호작용을 형성할 수 있음을 밝혀냈다. 삼원 복합 형성의 협력성을 실험적으로 결정하면 링커 최적화를 지원할 수 있습니다.
이 보고서에는 PROTAC 분자와 단백질 결합 파트너 간의 결합 친화도에 대한 정보를 제공할 수 있는 세 가지 생물물리학 기법의 활용이 설명되어 있습니다. 방법 1은 PROTAC 분.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 기타 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 MIT와 하버드의 브로드 연구소(Broad Institute of MIT and Harvard)의 치료제 개발 센터(Center for the Development of Therapeutics)의 혁신 및 기술 개발 상(Innovation and Technology Development Award)의 지원을 받았습니다. 저자들은 이 작업을 지원해 준 고위 경영진과 검토 위원회의 구성원들에게 감사의 뜻을 전한다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96-플레이트 | Greiner | 655076 | 바닥이 평평하고 BLI 실험에 사용되는 검은색 플레이트 |
| 96-웰 플레이트 | Nunc | 73520-120 | ITC 샘플 준비에 플레이트 사용 |
| 96-웰 플레이트 | Greiner | 650101 | SPR 실험을 위한 샘플 준비에 사용 |
| 자동 iTC200 마이크로 열량계 | Malvern Panalytical | ITC 실험을 수행하는 데 사용되는 기기입니다. 제품 단종. | |
| Biacore S200 | Cytiva | 29136649 | SPR 실험 수행에 사용되는 기기, |
| MZ1 | ProbeChem | VHL 및 Brd4BD2 | PC-60099 |
| Cytiva | BR100532 | Instruments와 관련된 SPR 실험을 수행하는 데 사용되는 SPR 칩 | |
| 제품 단종. | |||
| 플레이트 커버 | Malvern | PQA0001 | Nunc 96-well 플레이트(73520-120)용 |
| 커버 | Cytiva | 28975816 | Greiner 플레이트(650101)용 플레이트 커버, |
| 시리즈 S SA 센서 칩 | Cytiva | BR100531 | MZ1:VHL:BRD4 |
| Streptavidin (SA) 딥 앤 리드 바이오 센서 | Sartorius | 18-509 | BLI에 사용되는 코팅 센서 실험 |
참고문헌
- Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
- Song, L., Luo, Z. -Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
