Method Article

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

DOI:

10.3791/65729

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽 기질 세포(MSC)는 재생 의학에서 널리 사용되어 온 성체 만능 줄기세포입니다. 체세포 유래 MSC는 제한된 기증, 품질 변화 및 생물학적 안전성으로 인해 제한됨에 따라 지난 10년 동안 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)에서 MSC를 생성하려는 노력이 크게 증가했습니다. hiPSC를 MSC로 분화하기 위한 과거와 최근의 노력은 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양의 사용이라는 두 가지 배양 방법론을 중심으로 이루어졌습니다. 이 프로토콜은 hiPSC에서 MSC를 유도하는 두 가지 대표적인 방법을 설명합니다. 각 방법은 시간, 비용, 세포 증식 능력, MSC 마커의 발현, 체외 분화 능력 등 장단점을 나타냅니다. 이 프로토콜은 두 방법 모두 hiPSC에서 성숙하고 기능적인 MSC를 도출할 수 있음을 보여줍니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 용이한 것이 특징인 반면 EB 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

Introduction

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중간엽 기질 세포(Mesenchymal stromal cell, MSCs)는 중배엽 유래 성체 만능 줄기세포이다1. MSC는 거의 모든 결합 조직에 존재한다2. MSC가 1970년대에 처음 발견되고 1987년 Friedenstein et al.3,4,5에 의해 골수에서 성공적으로 분리된 이래, 다양한 인간 체세포(태아 및 성인 포함) 조직이 뼈, 연골, 힘줄, 근육, 지방 조직 및 조혈 지지 기질과 같은 MSC를 분리하는 데 사용되었습니다 1,2,6,7 . MSC는 많은 체세포 계통으로 분화할 수 있는 높은 증식 능력과 가소성을 보여주며 손상되고 염증이 있는 조직으로 이동할 수 있습니다 2,8,9

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Protocol

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1. hiPSC 유지 보수

  1. hiPSC의 해동
    1. 액체 질소에서 세포를 꺼내고 37°C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다. 해동 셀을 3mL의 iPSC 유지 배지로 준비한 15mL 튜브로 옮깁니다(재료 표). 매체를 부드럽게 섞는다.
    2. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 제거하고 10μM Y-27632를 사용하여 1mL의 iPSC 유지 배지에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다(세포를 위아래로 2-3회 피펫팅).
    3. 세포 현탁액을 GFR(growth factor reduction)-세포외 기질 겔(1:100)과 10μM Y-27632가 미리 첨가된 2mL의 iPSC 유지 배지로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다(약 4 x 104 cells/cm2).
    4. 매일 iPSC 유지 배지를 교체하여 37°C, 5% CO2 에서 5-6일(80%-90% 합류) 동안 세포를 배양합니다.
  2. hiPSC의 통과
    1. 6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다. DPBS로 hiPSC를 한 번 씻으십시오.
    2. 700-8....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜(그림 1A)에 따라 hiPSC는 EB 형성 및 단층 배양 방법을 통해 MSC로 분화되었습니다. 분화 과정에서 세포는 서로 다른 대표 형태를 보였습니다(그림 1B,C).

그림 1B에서 볼 수 있듯이 hiPSC 콜로니는 분화 전에 촘촘하게 채워진 세포로 구성된 명확한 경계로 전형적인 조밀한 형태를 나타냅니다. hiPSC가 shaker에서 24시간 동안 해리 및 배양된 후 균일한 구형 EB가 형성되었습니다. MSC의 분화 배지에서 배양 1일차부터 7일차까지 EB의 부드러운 가장자리가 거칠어지고 EB의 부피가 커졌습니다. 8일째부터 17일째까지, EB를 GFR-세포외 기질 겔 코팅된 6-웰 플레이트로 옮긴 후, EB는 점차적으로 플레이트에 부착되었고, 많은 부착성 단층 세포가 EB 주위에 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는 hiPSC를 MSC로 분화하는 두 가지 대표적인 방법을 조사하였다 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. 두 방법 모두 hiPSC에서 MSC를 유도할 수 있었습니다. hiPSC 유래 MSC는 세포 형태(그림 1), 표면 항원(

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 과거와 현재의 Mao and Hu Lab의 모든 구성원이 흥미로운 토론과 프로젝트에 큰 기여를 한 것에 대해 매우 감사합니다. 국립아동건강임상연구센터(National Clinical Research Center for Child Health)의 큰 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidan Hu), 중국 저장성 자연과학재단(No. LQ22C070004 Lidan Hu)에게).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alizarin 레드 염색 키트Beyotime  생명공학C0148S
Anti-human-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-human-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-human-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-human-CD73(APC)Biolegend344006
Anti-human-CD90 (FITC)Biolegend328108
아스코르브산SolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
탄산 이산화물 레벨 쉐이커크리스탈CO-06UC6
보상 비즈BioLegend424601
CryoStor CS10STEMCELL 기술07959
DexamethasoneBeyotime  생명공학ST1254
DMEM/F12  매체ServicebioG4610
소 태아 혈청HAKATAHS-FBS-500
FGF2Stemcell78003.1
GelatinSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
human IgG1 isotype control APCBioLegend403505
인간 IgG1 동형 제어 FITCBioLegend403507
인간 IgG1 이소형형 제어 PEBioLegend403503
Human TGF-β 1스템셀78067
인간 TruStain FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime  생명공학ST1398
IndomethacinSolarbioSI9020
인슐린Beyotime  생명공학P3376
iPSC 유지 매체STEMCELL Technology85850
ITS 미디어 보충제Beyotime  생명공학C0341-10mL
Matrigel, 성장 인자 감소BD Corning354230
Oli Red O 염색 키트Beyotime  생명공학C0158S
ProlineSolarbioP0011
나트륨 피루브산ThermoFisher11360-070
TGFβ 3NovoproteinCJ44
Toluidine blue staining kitSolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme(1x) Gibco12604013
초저 부착물 6웰 플레이트Costar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632스템셀72304
&알파;-MEMHycloneSH30265
β-글리세로포스페이SolarbioG8100
트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One n....

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Induced Pluripotent Stem CellsMesenchymal Stromal CellsEmbryoid Body FormationMonolayer CultureMSC DifferentiationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationSpindle Shaped MorphologyMSC MarkersRegenerative Medicine

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