방법 논문

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

DOI:

10.3791/65729

⸱

2023년 10월 20일

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽 기질 세포(MSC)는 재생 의학에서 널리 사용되어 온 성체 만능 줄기세포입니다. 체세포 유래 MSC는 제한된 기증, 품질 변화 및 생물학적 안전성으로 인해 제한됨에 따라 지난 10년 동안 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)에서 MSC를 생성하려는 노력이 크게 증가했습니다. hiPSC를 MSC로 분화하기 위한 과거와 최근의 노력은 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양의 사용이라는 두 가지 배양 방법론을 중심으로 이루어졌습니다. 이 프로토콜은 hiPSC에서 MSC를 유도하는 두 가지 대표적인 방법을 설명합니다. 각 방법은 시간, 비용, 세포 증식 능력, MSC 마커의 발현, 체외 분화 능력 등 장단점을 나타냅니다. 이 프로토콜은 두 방법 모두 hiPSC에서 성숙하고 기능적인 MSC를 도출할 수 있음을 보여줍니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 용이한 것이 특징인 반면 EB 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽 기질 세포(Mesenchymal stromal cell, MSCs)는 중배엽 유래 성체 만능 줄기세포이다1. MSC는 거의 모든 결합 조직에 존재한다2. MSC가 1970년대에 처음 발견되고 1987년 Friedenstein et al.3,4,5에 의해 골수에서 성공적으로 분리된 이래, 다양한 인간 체세포(태아 및 성인 포함) 조직이 뼈, 연골, 힘줄, 근육, 지방 조직 및 조혈 지지 기질과 같은 MSC를 분리하는 데 사용되었습니다 1,2,6,7 . MSC는 많은 체세포 계통으로 분화할 수 있는 높은 증식 능력과 가소성을 보여주며 손상되고 염증이 있는 조직으로 이동할 수 있습니다 2,8,9. 이러한 특성으로 인해 MSC는 재생 의학의 잠재적 후보가 될 수 있다10. 그러나, 체세포 조직 유래 MSC(st-MSCs)는 제한된 기증, 제한된 세포 증식 능력, 품질 변화 및 기증자로부터 병원체의 전염 가능성에 대한 생물학적 안전성 우려에 의해 제한된다11,12.

인간 유도만능줄기세포(Human induced pluripotent stem cell, hiPSCs)는 전사인자(transcription factor)(Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)로 재프로그래밍하는 성체 세포에서 유래하며, 이는 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 유사한 기능을 갖는다13,14. 그들은 자가 재생이 가능하며 MSC를 포함한 모든 유형의 체세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. st-MSC와 비교하여 iPSC-MSC는 무제한 공급, 저렴한 비용, 더 높은 순도, 품질 관리의 편리성, 규모 생산 및 유전자 변형이 용이하다는 장점이 있습니다 15,16,17.

iPSC-MSC의 이러한 장점으로 인해 iPSC에서 MSC를 구동하는 다양한 방법이 보고되었습니다. 이러한 분화 방법은 두 가지 배양 방법론, 즉 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양(monolayer cultures)의 사용(11,18,19,20)을 중심으로 이루어졌다. 여기에서, 두 가지 방법론 각각에 대한 대표적인 접근법을 특징지었다. 또한, 시간, 비용, 증식 능력, MSC 바이오마커 발현 및 체외 분화 능력에 기반한 두 가지 대표적인 접근법 간의 비교도 이루어졌습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hiPSC 유지 보수

  1. hiPSC의 해동
    1. 액체 질소에서 세포를 꺼내고 37°C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다. 해동 셀을 3mL의 iPSC 유지 배지로 준비한 15mL 튜브로 옮깁니다(재료 표). 매체를 부드럽게 섞는다.
    2. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 제거하고 10μM Y-27632를 사용하여 1mL의 iPSC 유지 배지에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다(세포를 위아래로 2-3회 피펫팅).
    3. 세포 현탁액을 GFR(growth factor reduction)-세포외 기질 겔(1:100)과 10μM Y-27632가 미리 첨가된 2mL의 iPSC 유지 배지로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다(약 4 x 104 cells/cm2).
    4. 매일 iPSC 유지 배지를 교체하여 37°C, 5% CO2 에서 5-6일(80%-90% 합류) 동안 세포를 배양합니다.
  2. hiPSC의 통과
    1. 6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다. DPBS로 hiPSC를 한 번 씻으십시오.
    2. 700-800 μL의 0.48 mM EDTA 용액을 첨가하고 실온(RT)에서 1분 동안 배양한 다음 분해 용액을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.
    3. 세포가 시트로 분해될 때(세포를 단일 세포로 분해하지 않음) 10μM Y-27632와 함께 1mL의 iPSC 유지 배지를 추가하여 분해를 종료합니다. 세포를 위아래로 2-3회 조심스럽게 피펫팅합니다.
    4. 세포 현탁액을 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)과 10μM Y-27632가 미리 첨가된 2mL의 iPSC 유지 배지로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다.
      참고: 통과 비율은 1:6에서 1:20(약 4 x 104 cells/cm2)이며 평균 응집 크기는 약 50-200μm입니다.
    5. 매일 iPSC 유지 배지를 교체하여 37°C, 5% CO2 에서 80%-90% 밀도(5-6일)까지 세포를 배양합니다.

2. EB 형성을 통한 hiPSC와 MSC의 분화

참고: 이 방법은 이전 문헌 21,22,23,24에서 파생되었습니다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법의 특징은 표 1에 요약되어 있다.

  1. 배지의 제조
    1. α-MEM에 1%(v/v) GlutaMAX, 10%(v/v) FBS, 10ng/mL FGF2 및 5ng/mL TGFβ를 보충하여 MSC 분화 배지를 준비합니다.
    2. α-MEM에 1%(v/v) GlutMAX, 10%(v/v) FBS 및 1ng/mL FGF2를 보충하여 MSC 유지 배지를 준비합니다.
  2. hiPSC의 준비
    1. 37°C, 80%-90% 밀도까지 5% CO2 까지 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트의 iPSC 유지 배지에서 hiPSC 라인(해동 후 최소 2-3회 통과).
  3. 0일차: EB 형성
    1. 6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다. DPBS로 hiPSC를 한 번 씻으십시오.
    2. 700-800 μL의 0.48 mM EDTA 용액을 첨가하고 RT에서 1분 동안 배양한 다음 분해 용액을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.
    3. 세포가 시트로 분해되면(세포를 단일 세포로 분해하지 않음) 2mL의 iPSC 유지 배지(10μM 암석 억제제 및 1:100 GFR- 세포외 기질 겔 포함)를 추가하여 분해를 종료합니다.
    4. 세포를 6웰 낮은 부착 플레이트로 옮깁니다. 조직 배양 플레이트 2웰과 낮은 부착 플레이트 1웰의 비율로 세포를 파종합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 의 셰이커(60rpm/분)에서 24시간 동안 배양하여 구형 EB를 형성합니다.
  4. 1일차-7일차: EB 감별
    1. 파스퇴르 피펫을 사용하여 EB를 원심 분리기 튜브로 옮기고 (EB를 파괴하지 않고) EB가 RT에서 5-10 분 동안 자연적으로 침전되도록합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다.
    2. EB를 2mL의 MSC 분화 배지가 있는 6웰 로우 부착 플레이트로 옮깁니다. 37 ° C, 5 % CO2 에서 7 일 동안 셰이커에서 EB를 배양하고 배지를 한 번 변경하십시오.
  5. 8일차-17일차: EB 접종
    1. 파스퇴르 피펫을 사용하여 EB를 원심 분리 튜브로 옮기고(EB를 파괴하지 않고) EB가 5-10분 동안 자연적으로 침전되도록 합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다.
    2. EB를 2mL의 MSC 유지 배지가 있는 GFR-세포외 기질 겔 코팅된 6웰 플레이트로 옮깁니다. 세포 접착 후 정기적인 배지 교체로 90% 밀도(~10일)까지 배양합니다.
  6. 18일차-27일차: MSC의 성숙 및 확장
    1. EB 유래 배양액을 37°C에서 해리 용액으로 5-10분 동안 처리합니다(세포 유형에 따라 분해 시간이 달라짐).
    2. 세포의 일부가 단일 세포로 분해되면 MSC 유지 배지 2mL를 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화되지 않은 나머지 세포를 DPBS로 한 번 씻고 다시 소화합니다. 모든 세포가 단일 세포로 분해될 때까지 여러 번 반복합니다. 셀 현탁액을 250 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
    3. 젤라틴 코팅 배양 플레이트(약 2 x 105 cells/cm2)에 세포를 파종합니다. MSC 유지 배지에서 90% 밀도가 될 때까지 배양하고 배지를 정기적으로 교체합니다. 이 시점에서 이 세대의 세포를 통로 0(P0)으로 지정합니다.
    4. MSC를 순수하고 성숙하게 만들기 위해 약 6일 동안 1:3 분할 비율로 세포를 두 번 계속 통과시킵니다. 대부분의 세포는 섬유아세포와 같은 형태(방추형)를 나타냅니다.

3. 단층 배양을 통한 MSC와 hiPSC의 차별화

참고: 이 방법은 이전 문헌 25,26,27,28에서 파생되었습니다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법의 특징은 표 1에 요약되어 있다.

  1. 배지의 제조
    1. α-MEM을 1%(v/v) GlutMAX, 10%(v/v) FBS 및 1ng/mL FGF2로 보충하여 MSC 유지 배지를 준비합니다.
  2. hiPSC의 준비
    1. 37°C에서 5% CO2 가 50%-60% 밀도가 될 때까지 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트의 iPSC 유지 배지에서 hiPSC 라인(해동 후 최소 2-3회 통과).
  3. 0일차-13일차: 직접 단층 배양에 의한 분화
    1. 6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다.
    2. MSC 유지 배지 2mL를 직접 첨가하고 37°C, 5%CO2 에서 14일 동안 배양하고 배지를 매일 교체합니다.
  4. 14일차-35일차: 반복 통과에 의한 MSC 성숙
    1. 단층 배양액을 37°C에서 해리 용액으로 5-10분 동안 처리합니다(세포 유형에 따라 분해 시간이 달라짐).
    2. 세포가 단일 세포로 분해되면 2mL의 MSC 유지 배지를 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화되지 않은 나머지 세포를 DPBS로 한 번 씻고 다시 소화합니다. 모든 세포가 단일 세포로 분해될 때까지 여러 번 반복합니다. 셀 현탁액을 250 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
    3. 젤라틴으로 코팅된 배양 접시(약 2 x 105 cells/cm2)에 세포를 파종합니다. MSC 유지 관리 배지에서 90%의 밀도가 될 때까지 배양하고 배지를 정기적으로 교체합니다. 이 시점에서 이 세대의 세포를 통로 0(P0)으로 지정합니다.
    4. MSC를 순수하고 성숙하게 만들기 위해 약 18일 동안 1:3 분할 비율로 세포를 6회 계속 통과시킵니다. 대부분의 세포는 섬유아세포와 같은 형태(방추형)를 나타냅니다.

4. 유세포 분석에 의한 hiPSC 유도 MSC의 표면 항원 분석

참고: 골수 유래 MSC의 표면 항원과 유사하게, hiPSC를 유도하는 MSC는 CD105, CD73 및 CD90을 발현하지만, CD45, CD34는 발현하지 않는다29. 또한 hiPSC를 음성 대조 세포로 사용할 수 있습니다. 유세포 분석에 의한 hiPSC 유도 MSC 및 hiPSC의 표면 항원 분석은 그림 2에 나와 있습니다.

  1. hiPSC 구동 MSC를 37°C에서 해리 용액으로 2-3분 동안 처리합니다. hiPSC를 0.48mM EDTA 해리 시약으로 처리하고 RT에서 1분 동안 배양한 다음 해리 시약을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.
  2. 세포가 단일 세포로 분해되면 배지(MSC에 MSC 유지 배지, iPSC에 iPSC 유지 배지)를 추가하여 분해를 종료합니다.
  3. 셀 현탁액을 350 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
  4. 차가운 DPBS로 세포를 한 번 세척하고 350 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
  5. 10 x 106 cells/mL의 차가운 10% FBS-DPBS(v/v) 용액에서 세포를 계수하고 재현탁시키고 100μL/튜브의 세포 현탁액(1 x 106 세포/튜브)을 1.5mL 원심분리 튜브에 분배합니다.
  6. 5μL의 인간 Fc 수용체 차단 용액을 100μL의 세포 현탁액에 추가합니다. 비특이적 차단을 수행하기 위해 RT에서 5-10분 동안 배양합니다.
  7. 350 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액으로 세포를 두 번 세척합니다.
  8. 2% FBS-DPBS(v/v) 용액의 차가운 100μL에 세포를 재현탁시킵니다.
  9. 100μL 세포에 5μL(1 테스트)의 anti-CD34-FITC와 5μL의 anti-CD45-APC를 추가합니다.
    서스펜션. 다른 100μL 세포 현탁 튜브에 5μL(1 테스트)의 anti-CD73-APC, 5μL의 anti-CD90-FITC의 90 μL(1 테스트) 및 5 μL의 anti-CD105-PE를 추가합니다. 5μL의 인간 IgG1 동형 대조군 FITC, 인간 IgG1 동형 대조군 PE 및 인간 IgG1 동형 대조군 APC를 세 번째 100μL 세포 현탁 튜브에 추가합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 15-20분 동안 배양합니다. 한편, 단일 염색 구슬을 준비합니다.
  10. 차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액으로 세포를 두 번 세척합니다.
  11. 300μL의 차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액을 추가하여 세포를 재현탁시키고 200 메쉬 스크린 필터를 통해 필터링합니다.
  12. 유세포 분석을 사용하여 샘플을 분석합니다. isotype control 항체로 염색된 세포 현탁액을 분석하고 게이트를 설정합니다. 그런 다음 표적 항체로 염색된 세포 현탁액을 분석합니다.

5. hiPSC 유도 MSC의 골형성 분화

참고: hiPSC를 구동하는 MSC는 골형성 분화 전위가 있습니다(그림 3A, B). 골형성 분화를 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.

  1. α-MEM에 10% FBS, 100nM 덱사메타손, 10mM 베타-글리세로포스페이트 및 100μM 아스코르브산을 보충하여 골형성 유도 배지를 준비합니다.
  2. 1 x 105 MSC를 젤라틴으로 코팅된 48웰 플레이트에 파종하고 60%-70%가 합류할 때까지 배양합니다.
  3. 배지를 제거하고 0.3mL의 골형성 유도 배지를 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 14 일 동안 골형성 유도 배지에서 세포를 3 일마다 배지를 교체하여 배양합니다.
  4. 배지를 제거하고 DPBS로 한 번 씻으십시오.
  5. 4% PFA 0.3mL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  6. PFA를 제거합니다. RT에서 10분 동안 0.3mL의 DPBS로 세포를 헹구고 3회 반복합니다.
  7. DPBS를 제거하고 Alizarin red 염색액 0.2mL를 첨가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
  8. 염색액을 제거하고 0.3mL DPBS로 세포를 상온에서 10분 동안 헹구고 3회 반복합니다.
  9. 광학 현미경으로 칼슘 침착의 염색을 관찰합니다.

6. hiPSC 구동 MSC의 지방 분화

참고: hiPSC 구동 MSC는 지방 분화 전위를 가지고 있습니다(그림 3C, D). 지방 분화를 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.

  1. α-MEM에 10% FBS, 1μM 덱사메타손, 1μM IBMX, 10μg/mL 인슐린 및 100μM 인도메타신을 보충하여 지방 생성 유도 배지를 준비합니다. α-MEM에 10% FBS와 10μg/mL 인슐린을 보충하여 지방 생성 유지 배지를 준비합니다.
  2. 젤라틴으로 코팅된 48웰 플레이트에 1 x 105 MSC를 파종하고 세포 밀도가 90%에 도달할 때까지 배양합니다.
  3. 배지를 제거하고 0.3mL의 지방 유도 배지를 추가합니다. 지방 유도 배지에서 세포를 37 ° C, 5 % CO2 에서 4 일 동안 계속 배양합니다.
  4. 배지를 제거하고 0.3mL의 지방 유지 배지를 추가합니다. 지방 생성 유지 배지에서 세포를 37 ° C, 5 % CO2 에서 3 일 동안 계속 배양합니다.
  5. 지방 세포 분화 및 성숙이 이루어질 때까지 6.3 및 6.4 단계를 2-3회 반복합니다.
  6. 배지를 제거하고 DPBS로 한 번 씻으십시오.
  7. 4% PFA 0.3mL를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. PFA를 제거하고 DPBS로 2회 헹굽니다.
  8. 제조업체의 지침에 따라 Oli Red O 염색제를 바르고 광학 현미경으로 지질 방울을 관찰합니다.

7. hiPSC 구동 MSC의 연골 분화

참고: hiPSC 구동 MSC는 연골 분화 전위를 가지고 있습니다(그림 3E, F). 연골 분화에 대한 프로토콜은 다음과 같습니다.

  1. α-MEM에 10% FBS, 100nM 덱사메타손, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 10μM 아스코르브산, 1mM 피루브산나트륨, 50μg/mL 프롤린, 0.02nM 형질전환 성장 인자 β3(TGFβ3) 및 0.5μg/mL 골 형태 형성 단백질 6(BMP-6)을 보충하여 연골아세포 유도 배지를 준비합니다.
  2. 2.5 x 105 hiPSC 구동 MSC를 수집하고 세포를 150 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다. 세포를 1mL의 α-MEM에 현탁시킨 다음 150 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  3. 상층액을 제거하고 0.5mL의 연골 유도 배지에 세포를 현탁시킵니다. 세포를 150 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  4. 뚜껑의 나사를 직접 풀고 37 ° C, 5 % CO2에서 3 일마다 연골 유도 배지를 교체하여 21 일 동안 배양합니다. 원심분리기 튜브를 부드럽게 튕겨 연골 분화 중에 매일 연골 펠릿(연골 펠릿을 파괴하지 않고)을 부유시킵니다.
  5. 상층액을 제거하고 PBS 0.5mL로 두 번 세척합니다.
  6. 4% PFA 0.3mL를 넣고 24시간 동안 고정합니다.
  7. 파라핀은 연골 펠릿을 내장한 다음 절편합니다(3μm). 톨루이딘 블루(1%) 섹션을 30분 동안 염색합니다.
  8. 광학 현미경으로 세포외 연골세포 기질을 관찰합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜(그림 1A)에 따라 hiPSC는 EB 형성 및 단층 배양 방법을 통해 MSC로 분화되었습니다. 분화 과정에서 세포는 서로 다른 대표 형태를 보였습니다(그림 1B,C).

그림 1B에서 볼 수 있듯이 hiPSC 콜로니는 분화 전에 촘촘하게 채워진 세포로 구성된 명확한 경계로 전형적인 조밀한 형태를 나타냅니다. hiPSC가 shaker에서 24시간 동안 해리 및 배양된 후 균일한 구형 EB가 형성되었습니다. MSC의 분화 배지에서 배양 1일차부터 7일차까지 EB의 부드러운 가장자리가 거칠어지고 EB의 부피가 커졌습니다. 8일째부터 17일째까지, EB를 GFR-세포외 기질 겔 코팅된 6-웰 플레이트로 옮긴 후, EB는 점차적으로 플레이트에 부착되었고, 많은 부착성 단층 세포가 EB 주위에 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는 hiPSC를 MSC로 분화하는 두 가지 대표적인 방법을 조사하였다 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. 두 방법 모두 hiPSC에서 MSC를 유도할 수 있었습니다. hiPSC 유래 MSC는 세포 형태(그림 1), 표면 항원(

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 과거와 현재의 Mao and Hu Lab의 모든 구성원이 흥미로운 토론과 프로젝트에 큰 기여를 한 것에 대해 매우 감사합니다. 국립아동건강임상연구센터(National Clinical Research Center for Child Health)의 큰 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidan Hu), 중국 저장성 자연과학재단(No. LQ22C070004 Lidan Hu)에게).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alizarin 레드 염색 키트Beyotime  생명공학C0148S
Anti-human-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-human-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-human-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-human-CD73(APC)Biolegend344006
Anti-human-CD90 (FITC)Biolegend328108
아스코르브산SolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
탄산 이산화물 레벨 쉐이커크리스탈CO-06UC6
보상 비즈BioLegend424601
CryoStor CS10STEMCELL 기술07959
DexamethasoneBeyotime  생명공학ST1254
DMEM/F12  매체ServicebioG4610
소 태아 혈청HAKATAHS-FBS-500
FGF2Stemcell78003.1
GelatinSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
human IgG1 isotype control APCBioLegend403505
인간 IgG1 동형 제어 FITCBioLegend403507
인간 IgG1 이소형형 제어 PEBioLegend403503
Human TGF-β 1스템셀78067
인간 TruStain FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime  생명공학ST1398
IndomethacinSolarbioSI9020
인슐린Beyotime  생명공학P3376
iPSC 유지 매체STEMCELL Technology85850
ITS 미디어 보충제Beyotime  생명공학C0341-10mL
Matrigel, 성장 인자 감소BD Corning354230
Oli Red O 염색 키트Beyotime  생명공학C0158S
ProlineSolarbioP0011
나트륨 피루브산ThermoFisher11360-070
TGFβ 3NovoproteinCJ44
Toluidine blue staining kitSolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme(1x) Gibco12604013
초저 부착물 6웰 플레이트Costar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632스템셀72304
&알파;-MEMHycloneSH30265
β-글리세로포스페이SolarbioG8100
트

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
  3. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
  4. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
  5. Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
  6. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  7. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  8. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  9. Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
  10. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272(2022).
  11. Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
  12. Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
  13. Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48(2018).
  14. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  15. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884(2020).
  16. Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623(2018).
  17. Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
  18. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080(2018).
  19. Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778(2022).
  20. Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
  21. Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
  22. Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330(2014).
  23. Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
  24. Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068(2015).
  25. Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49(2015).
  26. Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10(2015).
  27. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144(2015).
  28. Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
  29. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  30. Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

관련 논문