Method Article

광변환을 사용한 폐 전이에서 종양 세포 전파 추적

DOI:

10.3791/65732

⸱

July 7th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 2Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 4Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 5Montefiore Einstein Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 6Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 7Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 8Department of Cancer and Cellular Biology, Lewis Katz School of Medicine, Fox Chase Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폐 전이의 선택적 광전환을 위한 수술 프로토콜과 함께 폐 전이에서 종양 세포 재확산을 연구한 후 3차 장기에서 재분해된 종양 세포를 식별하는 방법을 제시합니다.

Abstract

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암의 전신 확산인 전이는 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 전이는 일반적으로 원발성 종양의 세포가 퍼져나가 종자 전이가 되는 단방향 과정으로 생각되지만, 기존 전이의 종양 세포도 "전이에서 전이" 또는 "전이에서 전이로의 파종"으로 알려진 과정을 통해 3차 부위에 새로운병변을 일으키고 재파종할 수 있습니다. 전이-전이 파종은 전이 부담을 증가시키고 환자의 삶의 질과 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 따라서 이 현상의 이면에 있는 과정을 이해하는 것은 전이성 암 환자의 치료 전략을 개선하는 데 매우 중요합니다.

전이에서 전이로의 파종에 대해서는 알려진 바가 거의 없는데, 이는 부분적으로 물류 및 기술적 한계 때문입니다. 전이-전이 파종에 대한 연구는 주로 염기서열 분석 방법에 의존하는데, 이는 전이-전이 파종 사건의 정확한 시기나 이를 촉진하거나 예방하는 요인을 연구하는 연구자에게는 실용적이지 않을 수 있습니다. 이는 전이-전이 파종 연구를 촉진하는 방법론이 부족하다는 것을 강조합니다. 이 문제를 해결하기 위해 폐 전이의 선택적 광전환을 위한 쥐 수술 프로토콜을 개발하여 폐에서 3차 부위로 재분해하는 종양 세포의 특이적 표시 및 운명 추적을 가능하게 합니다. 우리가 아는 한, 이것은 게놈 분석이 필요하지 않은 폐에서 종양 세포 재확산 및 전이-전이 파종을 연구하는 유일한 방법입니다.

Introduction

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전이는 암 관련 사망의 주요 원인이다1. 전이성 암은 원발성 종양의 세포가 몸 전체로 퍼져 멀리 떨어진 장기에서 임상적으로 검출 가능한 종양으로 증식할 때 발생한다 2,3.

전이는 일반적으로 종양 세포가 원발성 종양에서 퍼져 멀리 떨어진장기를 식민지화하는 단방향 과정으로 생각되지만4 임상 및 실험적 증거가 증가함에 따라 더 복잡하고 다방향적인 과정이 작용하고 있음을 시사한다. 순환 종양 세포는 원발성 종양(아직 제자리에 있는 경우)을 재파종할 수 있으며5,6,7,8,9 기존 전이성 병소의 종양 세포는 3차 부위로 이동하여 새로운 병변을 일으킬 수 있는 것으로 나타났다 10,11,12,13

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Protocol

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이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee의 사전 승인을 포함하여 척추동물 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

수술 전에 광전환/광전환 단백질을 발현하는 암세포를 사용하여 마우스에서 폐 전이를 생성해야 합니다. 폐 전이 생성에 대한 몇 가지 프로토콜이 발표되었습니다 26,27,28.

1. 수술 준비

  1. 마우스 준비(제모 및 삽관), 수술 및 회복을 위한 고유한 작업 영역을 준비합니다.
  2. 오토클레이브의 모든 수술 기구를 멸균합니다.
    참고: 이 수술에는 팁 전용 기술이 사용되므로 핫 비드 멸균기를 사용하여 후속 절차를 위해 기구를 다시 멸균할 수 있습니다.
  3. 가열된 수술 플랫폼을 켜고 37-40°C에 도달하여 안정화되도록 합니다.
  4. 5% 이소플루란으로 마취를 유도한 후 이소플루란을 3%로 ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에 설명된 수술 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 간단히 말해서 쥐를 마취하고 왼쪽 흉부에서 머리카락을 제거합니다. 그런 다음 마우스를 삽관하고 환기시켜 흉강이 열려 있는 동안 마우스가 산소를 공급받을 수 있도록 합니다. 흉곽을 노출시키기 위해 연조직을 제거하고 6번째 또는 7번째 늑간근을 절개합니다. 늑간 틈새에 견인기를 삽입하고 방출하여 인접한 갈비뼈를 벌리고 왼쪽 폐와 그 위에 광전환 가능한 전이를 노출시킵니다. 그런 다음 폐와 전이를 청색광에 노출시켜 노출된 병변을 광변환합니다. 광변환 후 견인기를 제거하고 갈비뼈를 다시 봉합하고 그 위에 놓인 피부를 닫습니다. 마지막으로, 흉강에서 과도한 공기를 제거하여 폐에 가해지는 압력을 완화하고 쥐가 독립적이고 자발적인 호흡을 재개할 수 있도록 합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 다양한 광전환성/광전환성 단백질에 적용할 수 있습니다.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문에서는 폐에서 종양 세포의 선택적 광변환을 위한 수술 프로토콜을 설명합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 폐의 종양 세포를 선택적으로 표시하고 나중에 전신에서 종양 세포를 재식별하여 폐 전이에서 전이 연구를 용이하게 함으로써 그 운명을 추적할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 광변환 수술을 받은 마우스의 뇌, 간 및 광변환되지 않은 오른쪽 폐에서 광전환 세포를 시각화할 수 있었으며, 이는 이러한 세포가 광변환된 폐 전이에서 이러한 3차 부위로 재분해되었음을 나타냅니다. 광변환을 거치지 않은 쥐의 장기에서는 적혈구가 발견되지 않았는데, 이는 세포의 자연적인 자가형광이 광전환된 종양 세포와 혼동될 만큼 밝지 않다는 것을 나타낸다.

실험의 특정 측면에 세심한 주의를 기울이면 이 절차의 성공률을 높일 수 있습니다. 첫째, 폐 전이를 생성할 때 전이 생성 및 광전환/광전환 가능한 단백질에 대한 프로토콜을 고려해야 합니다. 일부 형광 단백질은 면역원성 33,34,35,36인 것으로.......

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Disclosures

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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저자는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(S10RR029545)에 도움을 준 Wade Koba, 현미경 검사에 대한 교육과 지원을 제공한 Analytical Imaging Facility의 Vera DesMarais 및 Hillary Guzik, Einstein Montefiore Cancer Center, National Cancer Institute(P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biophotonics Center, 암 연구를 위한 통합 이미징 프로그램, Henry Wellcome 경 박사후 연구원(221647/Z/20/Z) 및 METAvivor 경력 개발 상.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0-30V, 0-3A 전원 공급 장치MPJA9616 PS
12VDC, 1.2A 비조절 플러그 공급MPJA17563 PD
28G 1mL BD 인슐린 주사기BD329410
400nm 발광 다이오드 어레이 램프LedEngin Inc.897-LZPD0UA00광변환 램프, 맞춤형 (아래 개별 부품 포함)
RB-1 절단 바늘이 있는 5-0 꼰 실크 봉합사Ethicon, Inc.774B
9cm 2-0 실크 넥타이Ethicon, Inc.LA55G
Baytril 100 (enrofloxacin)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890Rx식수에 사용되는 항생제
BuprenorphineHospira0409-2012-32진통제
케이블(케이블 어셈블리) 2.5 JK-ST 72" ZIP CDMouser172-0250
클로르헥시딘 용액Durvet7-45801-10258-3클로르헥시딘 소독제 용액
압축 공기 용기FalconDPSJB-12
엑스트라 파인 마이크로 해부 가위 4" 스트레이트 샤프/샤프 24mmRoboz SurgicalRS-5912샤프 마이크로 해부 가위
광섬유 조명기O.C. White CompanyFL3000마우스 삽관 중 사용
쌍둥이 자리 소추 키트하버드 장치726067카테리 펜
Germinator 500CellPoint ScientificGER  5287-120V비드 살균기
Graefe 집게RobozRS-5135
고출력 LED - 단색 자외선 90MouserLZP-D0UA00
적외선 열램프Braintree ScientificHL-1
Isoflurane SOL 250 mL PVLCovetrus29405마취제
Isoflurane 기화기SurgiVetVCT302
잠금 장치가 있는 제이콥슨 바늘 홀더Kalson SurgicalT1-140
라벨링 테이프Fisher ScientificS68702
LED 조명 반사판 CREE MP-L SNGL 렌즈 반사판 및 반사판 LOC PINMouser928-C11395TM
긴 면 팁 애플리케이터Medline IndustriesMDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron 최대 3.4GHz / 볼 베어링 / 구리 코어 / CPU 냉각 팬CompUSA#S457-1023
마이크로 해부 가위 4" 스트레이트 블런트/블런트Roboz 수술RS-5980블런트 마이크로 해부 가위
쥐 인공호흡기Kent Scientific PS-02PhysioSuite
Nair 제모 로션AmazonB001RVMR7K제모 크림
Personnet 미니 견인RobozRS-6504견인
인산염 완충 식염수 1xFisher Scientific14190144PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.WAddgene51005Dendra2 렌티바이러스
PuralubeHenry Schein Animal Health008897눈 윤활제
설치류 삽관 스탠드Braintree ScientificRIS 100
작은 동물 폐 팽창 전구Harvard Apparatus72-9083
SurgiSuite 다기능 수술 플랫폼, 온난화 포함Kent ScientificSURGI-M02가열 수술 플랫폼
테스트 리드 48" 테스트 리드 바나나 - 블랙Mouser565-1440-48-0
테스트 리드 48" 테스트 리드 바나나 - 레드Mouser565-1440-48-2
기관 카테터 Exelint International2674622 G 카테터
상처 폐쇄 시스템 수의학 키트Clay AdamsIN015수의학 외과 스테이플링 키트
와트 기 기

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J.

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