여기에서 우리는 브라질 보건 시스템의 수요를 충족시키기 위해 후속 전갈 해독제 생산을 위한 독을 제공하는 것을 목표로 대규모 Tityus serrulatus Lutz and Mello, 1922(브라질 황색 전갈) 사육을 위한 성공적인 유지 관리 및 독 추출 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
전갈 독은 여러 열대 및 아열대 국가의 공중 보건 문제입니다. 티 티우스 세룰라투스 Lutz and Mello, 1922 (브라질 노란 전갈)는 브라질에서 연간 약 150,000 건의 독 발병 사례에 책임이 있으며, 그 중 10 %는 생명을 위협하는 독 효과를 되돌리기 위해 해독 치료가 필요합니다. 그러므로, 수천 마리의 T. serrulatus 개체는 독 추출을 위해 통제된 포로 조건에서 유지되며, 이후 전갈 해독제의 국가 공급 생산에 사용됩니다. Instituto Butantan은 브라질의 주요 해독제 제조 실험실로, 브라질 보건 시스템에 약 70,000 바이알의 전갈 해독제를 제공합니다. 따라서 사육 프로토콜과 독 추출 방법론은 표준화된 대규모 독 생산의 성공을 위한 핵심 포인트입니다. 이 기사의 목적은 사육 루틴과 독 추출 절차를 포함하고, 우수 제조 관행을 따르고, 동물 복지를 보장하는 T. serrulatus 사육의 포획 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이러한 관행을 통해 최대 20,000마리의 동물을 사육할 수 있으며, 해독제 제조 수요에 따라 매월 3,000마리에서 5,000마리의 전갈을 착유하여 평균 90%의 양성 추출을 달성할 수 있습니다.
서론
전갈은 거미류에 속하는 절지동물로, 약 2,621 종의 전갈로 구성됩니다 1,2. 이 동물들은 지리적 범위가 넓으며 남극 대륙1을 제외한 모든 대륙에 존재합니다. 전갈에 의한 독은 전 세계적으로 매년 수천 명의 이환율 또는 사망을 초래합니다3. 2019년에는 이 동물로 인해 120만 건 이상의 사고와 연간 3,500건의 사망이 발생한 것으로 추정됩니다. 브라질에서는 발병 건수가 기하급수적으로 증가하여 2017년 이후 연간 100,000건 이상에 도달했습니다 4,5,6. 환경 파괴 및 기후 변화와 관련된 적절한 하수 처리와 정기적인 쓰레기 수집 및 처리 없이 지난 수십 년 동안 브라질에서 관찰된 통제되지 않은 도시화는 T. serrulatus와 같은 침입성 전갈의 확산을 위한 조건을 제공하여 인간과의 접촉을 증가시켜 유해한 사고를 초래했습니다 4,7,8. 브라질에는 약 178 종의 전갈이 있지만 의학적으로 중요한 쏘임은 Tityus 속에 의해 발생하며 4 종 (T. serrulatus, T. bahiensis, T. stigmurus 및 T. obscurus)이 의학적으로 우려되며 Tityus serrulatus는 가장 심각한 사례와 사망에 책임이 있습니다 7,9.
Instituto Butantan은 브라질의 주요 해독제 제조 실험실로, 브라질 보건 시스템에 약 70,000 바이알의 전갈 해독제를 공급하고 있습니다. 간단히 말해서, 해독제 제조와 관련된 단계에는 말에 독 유래 항원을 접종하고, 풍부한 항체 혈장을 수집 및 정제하여 전갈 해독제 5mL 바이알을 만드는 것이 포함됩니다. 각 바이알은 해독제 mL당 최소 1mg의 전갈 독을 중화할 수 있습니다. 절지동물 생물체는 전갈 해독제의 원료를 공급하는 산업 센터의 필수적인 부분입니다.
Instituto Butantan의 절지동물 생물 서식지는 원래 절지동물 연구소로 명명되었으며 1967년에 설립되었습니다. 그러나 1995년이 되어서야 실험실은 독이 있는 절지동물10,11을 수용하는 전용 시설로 이전했습니다. 그 당시, 전갈은 온도가 조절되지 않은 12m2의 방에 보관되어 약 13 개의 인클로저에 분포되어 있으며, 각 인클로저에는 최대 300 마리의 동물이 있습니다 10. 수년에 걸쳐 독에 대한 수요가 증가하고 그에 따라 독 추출 공정의 개선과 함께 동물의 수를 늘려야 할 필요성으로 인해 2016년에 큰 변화가 발생했습니다. 연구소는 부탄탄 연구소의 산업 중심지에 통합되었으며 절지동물 생물체로 이름이 변경되었습니다. 또한 2016년에 Bioterium은 새로운 특수 목적 시설로 이전했습니다. 새로운 전갈 방은 24m2의 면적을 차지하며 그림 1과 같이 각각 최대 300마리의 동물을 수용하는 약 48개의 폴리프로필렌 인클로저를 포함합니다. 그 결과 총 10,000명에서 20,000명의 개체가 통제된 포로 조건 하에서 유지되고 있으며 연중 내내 변동이 있습니다. 전갈은 엄격한 사육 프로토콜에 따라 신중하게 관리되어 높은 생산 수요를 충족하고 동물 관리에 대한 모범 사례와 윤리 기준을 준수하면서 복지를 보장합니다. 독 추출을 위해 그림 2A와 같이 두 개의 공기 흐름 캐비닛을 수용하는 특정 공간이 설계 및 구성되었습니다. 이 캐비닛은 기술자가 추출 절차 중에 독 입자를 흡입하는 것을 방지하기 위한 안전 조치 역할을 합니다. 합성 앞치마와 FFP2 마스크를 포함한 개인 보호 장비(PPE)는 오염을 방지하고 안전을 보장하기 위해 기술자에게 필수입니다.
그림 1: 절지동물 생물체(Arthropods Bioterium)의 전갈이 있는 방의 일반적인 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 작업 영역 (A) 절지동물 생물체의 독 추출실의 일반적인 모습. (B) 공기 흐름 캐비닛 작업 표면. 모든 재료와 장비는 공기 흐름 캐비닛 작업 표면 상단에 준비 및 배치됩니다. 검은색 화살표는 전기 자극기 장치를 나타내고 빨간색 화살표는 겸자를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
절지동물 생물 서식지에 있는 T. serrulatus 전갈의 약 90%는 이 동물에 대한 감시 및 통제 프로그램의 일환으로 시 보건 요원이 수집한 다양한 장소에서 유래합니다. 전갈은 도시 지역에서 포획된 다음 협력 프로그램의 일환으로 Instituto Butantan으로 보내집니다. T. serrulatus 전갈은 단유전학(parthenogenetic)으로, 이성의 존재 없이 수정되지 않은 난자에서 자손을 낳은 결과로 출생이 일어난다는 것을 의미한다12. 이러한 유형의 번식으로 인해 일부 동물은 우리 시설에서 사육 상태로 태어나 아래에 설명된 것과 유사한 사육 프로토콜에 따라 성체 단계에 도달할 때까지 유지됩니다. 성체 단계에 도달하면 독 추출 루틴에 추가됩니다. 도착하자마자 전갈은 초기 검사를 받고 건강 상태가 양호한 전갈은 최대 350 마리의 개체가 포함 된 집단 인클로저에 보관됩니다. 각 인클로저에 대해 매일 통제 양식이 작성되어 먹이를 주는 날짜와 제공되는 먹이의 유형(귀뚜라미 또는 바퀴벌레), 물 공급, 청소 절차, 죽은 동물의 수 및 인클로저 내부에 남아 있는 살아있는 동물의 수에 대한 데이터를 제공합니다.
미리 계획된 일정에 따라 동물에게 전기 자극을 가하고 그 결과 수백 마리의 독을 동결 건조하여 동결 건조된 독을 생산합니다. 이 공정에서 얻은 표준화된 독은 제조 공정의 일부로 말 면역에 사용될 뿐만 아니라 활성 물질 및 최종 제품의 품질 관리를 위한 참조 물질을 제공합니다.
Instituto Butantan의 절지동물 생물 서식지에서와 같이 우수한 제조 관행과 동물의 윤리적 사용에 따라 그렇게 많은 수의 전갈을 보관하고 독을 추출할 수 있는 시설은 전 세계에 거의 없습니다. 따라서 우리의 목표는 전갈 해독제 생산에 필요한 양의 독을 성공적으로 제공하는 T. serrulatus 사육에 사용되는 전갈 유지 관리 프로토콜 및 독 추출 절차를 설명하는 것입니다.
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프로토콜
무척추동물과 관련된 의정서는 부탄탄연구소의 동물의 사용 및 관리 위원회의 승인에서 면제된다. 그러나 여기에 설명된 전갈의 유지는 윤리적 기준을 따르며 종의 필요에 따라 동물 복지가 존중됩니다.
1. 주거
- 전갈을 공동 폴리프로필렌 용기에 넣어 최대 350마리의 동물을 담을 수 있는 인클로저(높이 35cm, 너비 35.5cm, 길이 72cm)로 보관합니다.
- 조명이 켜진 상태에서 24시간, 조명이 꺼진 상태에서 0.5시간의 조명 주기로 10°C(±14°C)의 제어된 온도 하에서 동물 인클로저가 수용되는 방을 유지하십시오.
- 각 컨테이너의 인클로저 바닥(바닥)에 모든 면의 가장자리에 마스킹 테이프로 고정된 크래프트 종이를 깔아 동물이 종이 아래로 들어갈 수 없도록 합니다(그림 3A).
- 4개의 판지 트레이(계란 트레이)를 수직 기판으로 사용하고 용기의 한쪽 면에 쌓고 각 트레이 사이에 단단한 판지 시트를 놓습니다(그림 3B,C).
- 동물의 수원으로 적신 면이 들어 있는 얕은 폴리프로필렌 트레이(물 트레이)를 인클로저의 반대쪽에 놓습니다(그림 3B).
- 공기 흐름을 증가시키기 위해 용기를 뚜껑 없이 보관하십시오. 약 10cm의 접착식 플라스틱 테이프 스트립을 인클로저 내부 표면 상단과 상단 모서리에 놓아 동물이 컨테이너에서 탈출하지 못하도록 벽을 매끄럽게 만듭니다(그림 3A).
그림 3: 하우징 및 인클로저 준비 . (A) 화살표는 가장자리에 마스킹 테이프로 고정된 하단의 크래프트 종이를 나타냅니다. 점선은 인클로저의 내부 표면 상단에 놓인 접착식 플라스틱 테이프를 나타냅니다. (B) 수직 기판(용기의 한쪽에 쌓인 계란 트레이)과 반대쪽에 놓인 얕은 폴리프로필렌 트레이(물 트레이). (C) 수직 기판 세부 사항 : 두 개의 트레이 사이에 단단한 판지 시트로 채워진 계란 트레이. (D) T. serrulatus 의 자연적으로 어둡고 습한 서식지를 시뮬레이션하여 층으로 배치된 판지 시트와 계란 트레이. (E) 기질에 수용된 동물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 위생 수칙
알림: 위생 루틴은 전체 유지 관리와 부분 유지 관리의 두 가지 유지 관리 절차로 나뉩니다. 첫 번째는 동물에게 먹이를 준 후 2 일 후에 또는 독 추출을 위해 인클로저를 선택할 때 수행됩니다. 동물에게 먹이를 주지 않을 때 부분 유지 보수가 수행됩니다.
- 완벽한 유지 보수
- 섹션 1에 설명된 대로 새 기질(계란 트레이, 판지 및 크래프트 종이)과 깨끗한 물 트레이가 있는 깨끗한 인클로저를 준비합니다.
- 긴 집게를 사용하여 인클로저에서 물받이를 제거합니다. 물받이에 전갈이 있으면 제거하고 깨끗한 인클로저에 넣으십시오.
- 모든 계란 트레이와 판지 시트에 대해 2.1.2단계에서 설명한 것과 동일한 절차를 반복하여 모든 전갈을 제거하고 깨끗한 인클로저에 넣습니다.
- 트레이를 제거한 후 인클로저 바닥에 남아 있는 모든 전갈을 제거하고 깨끗한 인클로저에 넣습니다. 사체를 확인하고 적절하게 폐기하십시오. 남아 있는 살아있는 먹이(곤충)를 모두 모아 울타리에서 제거합니다.
- 인클로저에서 모든 일회용 기질(계란 트레이, 판지 시트 및 크래프트 종이)을 제거하고 적절하게 폐기하십시오. 위생을 위해 재사용 가능한 품목(물받이 및 폴리프로필렌 용기)을 보내십시오.
알림: 재사용 가능한 품목의 위생은 중성 세제와 결합된 0.5% 차아염소산염으로 수행됩니다. 위생 제품이나 용액을 사용한 후에는 재료를 흐르는 물로 철저하고 풍부하게 헹구어야 합니다.
- 부분 유지 보수
알림: 부분 유지 관리는 죽은 전갈 사체 및 기타 바람직하지 않은 파편을 제거하기 위해 모든 기판(계란 트레이 및 크래프트 종이)을 검사하는 것으로 구성되지만 기판을 폐기하거나 인클로저를 변경하지 않습니다.- 긴 집게를 사용하여 각 계란 트레이를 부드럽게 들어 올려 폐기물을 제거하는 검사를 수행합니다.
- 필요한 경우 하나 이상의 계란 트레이를 깨끗한 것으로 교체하십시오.
- 긴 집게를 사용하여 물받이를 깨끗한 물받이로 완전히 교체하십시오. 물받이에 있는 전갈을 인클로저의 다른 부분에 있는 계란 트레이로 옮깁니다.
3. 먹이기
- 독 추출 일정에 따라 15일마다 동물에게 먹이를 주십시오. 독 추출 7일 전과 7일 후에 착유할 동물에게 먹이십시오.
- 먹이를 위해 바퀴벌레(Phoetalia pallida)와 귀뚜라미(Gryllus sp.)를 번갈아 공급합니다.
- 동물의 에너지 섭취량에 따라 음식의 양을 계산하십시오. 울타리 안에 있는 전갈 3마리 또는 5마리당 먹이 1마리를 제공하십시오.
- 계산된 먹이 아이템의 양을 세고 울타리 안에 산 채로 넣어 유지 보수가 완료되기 전에 2일 동안 그대로 둡니다(섹션 2.1).
- 바퀴벌레를 제공할 때는 인클로저 상단에 알코올 용액과 함께 탄산칼슘을 바르십시오. 이 용액은 바퀴벌레가 미끄러져 인클로저의 측면 표면을 올라갈 수 없도록 하여 곤충이 탈출하는 것을 방지합니다.
4. 독 추출
알림: 독 추출 루틴에 사용되는 동물은 성인 또는 예비 성인입니다. 브라질 황색 전갈의 완전한 성적 성숙 (성체 단계)을 결정하기 어렵기 때문에 전체 몸 길이가 5-7cm 인 동물이 시술을 받을 수 있는 것으로 결정되었습니다.
- 각 동물에게 2-3개월마다 젖을 짜주세요.
- 독을 추출하는 날, 우리 안에 있는 모든 살아있는 동물의 수를 세고 긴 집게를 사용하여 유리 용기로 옮깁니다(그림 4).
- 공기 흐름 캐비닛 작업 표면 상단에 사용할 모든 재료와 장비를 준비하고 배열하십시오. 전기 자극기 전원 코드를 콘센트에 꽂고 전기 자극기와 공기 흐름 캐비닛을 켭니다(그림 2B).
- 다음 전기 자극기 매개 변수 설정을 사용하십시오 : 전위 (전극 간 전위 차이) : 540mV, 응력 (전기 펄스 지속 시간) : 2ms, 작용 (Telson 유기 조직의 가열을 감소시키는 데 사용되는 효능을 완화하는 간헐성) : 70 %, 사이클 (주기적 반복 조정) : 1 초 및 강도 (동물의 근육을 순환하는 전류) : 0.75 밀리암페어.
- 다음 단계에 따라 텔슨이 가만히 서 있는 방식으로 각 동물을 수동으로 제지합니다.
- 곧은 집게로 동물의 metassoma를 잡습니다 (그림 5A).
- 구부러진 집게로 텔슨을 고정합니다(그림 5B).
- 손으로 텔슨을 고정합니다(그림 5C,D).
- 구속 후 전도성 용액을 사용할 필요 없이 텔슨을 전기 자극기 도체와 직접 접촉하도록 합니다. 전기 충격은 독샘의 비자발적 근육 수축을 유발하고 결과적으로 독을 배출합니다.
- 전기 자극기 도체 가까이에 놓인 플라스틱 마이크로 튜브에 직접 독을 채취합니다(그림 6).
- 그런 다음 단계에 따라 동물을 유리 용기에 다시 풀어줍니다.
- 동물의 텔슨을 손에서 구부러진 집게로 옮깁니다.
- 동물을 유리 용기 바닥에 부드럽게 놓습니다.
- 유리 홀더의 각 동물에 대해 4.4-4.7단계를 수행합니다.
- 유리 용기에 담긴 모든 동물의 젖을 짜면 다시 인클로저에 넣으십시오.
- 수집된 독을 동결건조 과정까지 -20°C에서 보관하십시오.
그림 4: 유리 용기 속의 전갈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 독 추출을 위한 억제 절차 . (A) 직선 집게(검은색 화살표)로 억제된 메타소마. (B) 구부러진 집게(검은색 화살표)로 고정된 Telson. (C) 구속된 텔슨을 집게에서 손으로 옮기는 것. (D) 손으로 제지하는 텔슨. 장갑을 사용할 때 전갈이 발톱으로 재료를 잡을 수 있으므로 절차가 끝날 때 놓기 어렵고 사고 위험이 상당히 증가하므로 동물을 맨손으로 다루는 것이 좋습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 독 추출. 전기 자극기(노란색 화살표) 가까이에 놓인 플라스틱 마이크로튜브(흰색 화살표). 독 방울은 시술 중에 실온으로 유지되는 튜브에 직접 수집됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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결과
각 절차에 대해 30개의 표준 운영 절차(SOP)가 개발되어 기술자 간의 절차 반복성과 품질 매개변수 준수를 보장합니다. 추출 시술 후 평균 사망률은 약 12%로, 전기자극 루틴과 시술을 적용하여 스트레스 요인을 성공적으로 감소시키는 포로 환경을 고려할 때 낮은 것으로 간주될 수 있습니다.
동물의 건강을 유지하기 위해 상자의 한쪽 끝에는 솜과 물로 덮인 트레이를 배치하고 반대쪽에는 판지 시트와 계란 트레이를 층층이 배치하여 T. serrulatus의 어둡고 습한 자연 서식지를 시뮬레이션합니다(그림 3D,E). 기술된 기질은 제한된 공간에서 많은 수의 동물을 유지하고, 충분한 피난처와 공간을 제공하여, 그들의 복지를 보장하는 데 효과적인 것으로 입증되었다.
매년 T. serrulatus 독 생산량은 80g의 액체 독의...
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토론
설명된 방법을 적용하면 많은 수의 T. serrulatus 개체를 유지할 수 있으며 연간 독 생산에 필요한 전갈 수를 일관되게 예측할 수 있습니다. 이런 식으로, 우리는 해독제 제조 공정을 공급하기 위해 사전에 충분한 독 배치를 제공할 수 있습니다. 동시에 유지 관리, 공급 및 독 추출을 위해 미리 설정된 일정을 개발하는 것은 활동의 필수적인 부분이며 설명된 프로토콜을 준수하는 데 도움이 됩니다. 따라서 지속적인 생산을 유지하기 위해서는 루틴을 수립해야 합니다.
저자가 아는 한, 독 생산을 목적으로 전갈을 사육하는 것에 대해 과학적으로 기술된 프로토콜은 없습니다. 따라서 설명된 방법의 개발 및 적용은 이 기사에서 제시된 바와 같이 생산량 증가를 달성하기 위한 효율적이고 성공적인 프로토콜을 제시하는 것을 목표로 합니다. 여기에 제시된 독 추출을 위한 프로토콜은 많은 양의 독을 얻어야 하기 때문에 가능한 한 절차를 단순화하기 위한 목적으로 개발되었기 때문에 이전에 설...
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Carboard sheet | NA | NA | |
| Egg tray | NA | NA cardboard 36 places egg tray | |
| 전기 자극기 장치 | Instituto Butantan | ART-FV-01 | 독 추출을 위해 내부적으로 설계됨 |
| 크래프트 종이 | NA | NA | 일반 크라프트 종이 |
| 제작 테이프 | NA | NA 흰색 | 마스킹 테이프 (24mm x 50m) |
| 용기 | NA | NA 70 L 폴리 프로필렌 상자 (H – 35cm, W – 35.5cm, L - 72cm) | |
| 폴리 | NA | NA | 폴리 프로필렌 트레이 (H – 3.0cm, W – 18.5cm, L - 30 cm) |
| 접착 플라스틱 | NA | NA |
참고문헌
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