이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근에서 단일 섬유 분리 및 도트 블로팅 기술을 사용하여 미오신 중쇄(MHC) 동형에 따른 섬유 유형 분류를 보여줍니다. 확인된 MHC I 및 II 섬유 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 발현의 섬유 유형별 차이에 대해 추가로 분석할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기에 설명된 기술은 도트 블로팅(dot blotting)을 사용하여 개별 근육 섬유의 세그먼트에서 특정 미오신 중쇄(MHC) 동형을 식별하는 데 사용할 수 있으며, 이하 MyDoBID(Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type)에 의한 Myosin 중쇄 검출이라고 합니다. 이 프로토콜은 인간의 골격근을 동결 건조시키고 단일 근육 섬유의 세그먼트를 분리하는 과정을 설명합니다. MyDoBID를 사용하여 유형 I 및 II 섬유는 각각 MHCI 및 IIa 특이적 항체로 분류됩니다. 그런 다음 분류된 섬유는 각 생검을 위해 섬유 유형별 샘플로 결합됩니다.
각 샘플의 총 단백질은 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 및 UV 활성 겔 기술에 의해 결정됩니다. 섬유 유형의 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 검증됩니다. 여러 웨스턴 블롯에서 표적 단백질 검출을 향상시키기 위해 단백질 로딩 정규화를 수행하는 것의 중요성도 설명합니다. 단일 섬유 웨스턴 블롯과 비교하여 분류된 섬유를 섬유 유형별 샘플로 통합하면 시료의 다양성, 시료 처리량 증가, 투자 시간 단축 및 비용 절감 조치의 이점이 있으며, 균질화된 근육 시료를 사용하여 자주 간과되는 중요한 섬유 유형별 정보를 유지할 수 있습니다. 프로토콜의 목적은 동결 건조된 인간 골격근 샘플에서 분리된 유형 I 및 유형 II 섬유를 정확하고 효율적으로 식별하는 것입니다.
이러한 개별 섬유는 이후에 결합되어 유형 I 및 유형 II 섬유 유형별 샘플을 생성합니다. 또한, 프로토콜은 웨스턴 블로팅에 의해 IIx 섬유로 확인된 MHCI 및 MHCIIa에 대해 음성인 섬유에 대한 마커로 Actin을 사용하여 IIx 유형 섬유의 식별을 포함하도록 확장됩니다. 그런 다음 각 섬유 유형별 샘플을 사용하여 웨스턴 블로팅 기법을 사용하여 다양한 표적 단백질의 발현을 정량화합니다.
서론
골격근은 세포(섬유)가 느린 경련(유형 I)인지 빠른 경련(유형 II)인지에 따라 달라지는 뚜렷한 세포 대사 및 수축 특성을 가진 이질적인 조직입니다. 섬유 유형은 수축 시간, 단축 속도 및 피로 저항을 포함하여 여러 면에서 서로 다른 미오신 중쇄(MHC) 동형을 검사하여 식별할 수 있습니다1. 주요 MHC 동형에는 유형 I, 유형 IIa, 유형 IIb 및 유형 IIx가 포함되며 대사 프로파일은 산화(유형 I 및 IIa) 또는 해당작용(IIx, IIb)입니다1. 이러한 섬유 유형의 비율은 근육 유형과 종에 따라 다릅니다. IIb형은 설치류 근육에서 널리 발견됩니다. 인체 근육은 IIb형 섬유를 포함하지 않으며 주로 MHC 동형 I형 및 IIa 섬유로 구성되며 IIx 섬유의 비율은 적습니다2. 단백질 발현 프로파일은 섬유질 유형에 따라 다르며 노화3, 운동4,5 및 질병6에 따라 변경될 수 있습니다.
다양한 골격근 섬유 유형에서 ....
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프로토콜
인간 근육 샘플은 국소 마취 (Xylocaine) 및 수동 흡입을 위해 수정 된 Bergstrom 바늘을 사용하여 무균 조건에서 70-74 세의 n = 3 (남성 2 명, 여성 1 명)의 vastus lateralis에서 얻었다11,12. 샘플은 빅토리아 대학교 인간 연구 윤리 위원회(HRETH11/221)에서 승인하고 헬싱키 선언13에 따라 수행된 이전 연구의 하위 집합이었습니다. 참가자는 이 연구에 참여하기 위해 서면 동의서를 제공했습니다. 이 프로토콜에 필요한 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다. 또한 일반적인 프로토콜 문제를 해결하는 문제 해결 전략 목록이 표 1에 나와 있습니다.
1. 동결 건조
- 생검된 근육 샘플을 드라이아이스에 냉동 상태로 유지하면서 체중을 측정하고 저울에 빈 냉동 튜브를 올려 놓습니다.
- 최소 10mg의 습식 냉동 티슈를 빠르게 계량합니다. 가중치를 소수점 이하 한 자리까지 기록합니다.
- 뚜껑....
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결과
도트 블로팅을 사용한 개별 MHCI, MHCIIa 및 MHCIIx 근육 섬유 식별
MyDoBID의 특징은 주어진 광섬유에서 다양한 MHC 및 Actin 신호 강도 강도를 분류하는 것입니다(그림 4A). 섬유 유형은 MHCI 및 IIa 동형의 존재 유무에 의해 식별되었습니다(그림 4B). 6개의 섬유는 MHC 또는 액틴 검출이 나타나지 않았으며, 이는 수집된 섬유가 없음을 나타냅니다. 이 특정 도트 블롯의 결과는 22개의 유형 II 섬유, 7개의 유형 I 섬유 및 3개의 잠재적인 유형 IIx 섬유의 식별이었습니다. 2개의 미확인 샘플과 6개의 샘플이 '섬유질 없음'으로 분류되었습니다(그림 4B, C). 검출 가능한 MHCI 또는 MHCIIa 신호가 없지만 Actin에 대해 양성인 섬유는 제거 과정을 통해 잠.......
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토론
섬유 수집
수년간의 경험을 바탕으로 대부분의 연구원은 이 기술을 마스터할 수 있습니다. 그러나 연습을 통해 다운스트림 분석을 위한 더 빠르고 효율적인 섬유 수집이 가능합니다. 풀링을 위해 품질의 단일 섬유 세그먼트 30개를 분리할 수 있으려면 샘플당 50개의 섬유 세그먼트를 수집하는 것이 좋습니다. 섬유 수집 비디오를 주의 깊게 연구하고 두 번의 연습 세션(세션당 ~50개의 섬유)을 수행한 후 합리적인 기준을 달성하는 것이 좋습니다. 수집된 모든 섬유는 섬유 유형을 식별하기 위해 MyDoBID를 거치며, 이를 통해 기술이 얼마나 효과적으로 수행되고 있는지 알 수 있습니다. 이는 광섬유 샘플에서 감지된 낮은 수의 '광섬유 없음' 또는 '희미한' MHC 신호로 볼 수 있습니다(프로토콜 섹션 5.1 참조).
근육은 MHCI와 MHCIIa가 모두 존재하는 하이브리드 섬유 또는 MHCIIa 및 IIx .......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구에 사용된 MHC I(A4.840) 및 MHCIIa(A4.74)에 대한 항체는 H. M. Blau 박사에 의해 개발되었으며 MHCIIx(6H1)에 대한 항체는 Dr. C. A. Lucas에 의해 개발되었으며 National Institute of Child Health and Human Development의 후원 덕분에 Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)에서 획득했으며 아이오와 대학교에서 유지 관리했습니다. 생명과학부(아이오와주 아이오와시티). 이 연구를 위해 인체 근육 샘플을 제공한 Victoria L. Wyckelsma에게 감사드립니다. 그림 1의 이미지 대부분은 BioRender.com 에서 가져온 것입니다.
자금:
이 연구는 외부 자금 지원을 받지 않았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1x 변성 완충액 | 레시피에 따라 제조 | 구성 요소는 Sigma-Aldrich 또는 다른 화학 유통 회사에서 공급받을 수 있습니다 | 1X 변성 완충액은 3X 변성 완충액 1을 1X Tris-HCl (pH 6.8)로 3 V / V로 희석하여 만듭니다. -20 °C에서 보관하십시오. |
| 3x Denaturing buffer | 레시피에 따라 제조 | 구성 요소는 Sigma-Aldrich 또는 다른 화학 분배기에서 출처를 찾을 수 있습니다. | 3x denaturing buffer는 다음을 포함합니다: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. -20 °C에서 보관하십시오. |
| 95% 에탄올 | N/A | 100% 에탄올은 모든 회사에서 공급할 수 있으며 | 초순수 H2O로 95%로 희석합니다. |
| 액틴 토끼 다클론 항체 | Sigma-Aldrich | A2066 | BSA 버퍼로 1/1,000을 희석합니다. |
| 분석 저울 | Mettler Toledo | 모델 번호: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | 제품명은 Miser Antibody Extender Solution NC입니다. |
| Beaker (100 mL) | N/A | /A | |
| 벤치탑 원심분리기 | Eppendorf | 5452 | 모델 이름: Mini Spin. |
| 차단 버퍼: 워시 버퍼에 5% 탈지유. | 디플로마 | 스토어 구매 | |
| BSA 버퍼: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: 바이오-라드 연구소(Bio-Rad Laboratories). NaN3 : 시그마-알드리치 | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | 소 혈청 알부민(BSA), 인산염 완충 식염수(PBS) 및 아지드화나트륨(NaN3). 4 °C에 보관하십시오. |
| 카세트 개방 레버 | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | 프리캐스트 겔 카세트를 여는 데 사용됩니다. |
| Chemidoc MP 이미저 | Bio-Rad Laboratories | 모델 번호: Universal hood III | 염색 방지 젤 이미징 기능이 있는 모든 이미징 시스템. |
| Criterion 블로터 | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | 아이스팩, 전사 트레이, 롤러, 카세트 홀더 2개, 여과지, 폼 패드 및 케이블이 있는 뚜껑이 포함되어 있습니다. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | 제품명: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| 전기영동 완충액 1x Tris Glycine SDS(TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | 초순수 H2O로 10개 중 1개를 희석합니다. |
| 여과지, 0.34mm 두께 | 의 Whatmann | 3030917 | 벌크 크기 3MM, 100매, 315 x 335mm 포장. |
| 미세조직 절개 겸자 | Dumont | F6521-1EA | Jeweler' S 겸자 번호 5. |
| 플랫 플라스틱 트레이/뚜껑 | N/A | N/A | 멤브레인을 놓을 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 표면이 완전히 평평한지 확인하십시오. |
| 동결 건조 시스템 | Labconco 7750030 | Freezone 4.5 L, 유리 챔버 시료 스테이지 포함. | |
| 냉동고 -80 oC | N/A | N/A | -80°C의 일정한 온도를 가진 모든 냉동고; C가 적합합니다. |
| 겔 방출기는 | Bio-Rad | Slide를 멤브레인 아래로 밀어 멤브레인을 모으거나 이동시킬 1653320 | |
| 회색 연필 | N/A | N/A | |
| 이미지 랩 소프트웨어 | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures는 소프트웨어 버전 5.2.1을 참조하지만 다른 버전도 사용할 수 있습니다. |
| 인큐베이터 | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | 37 °로 설정할 수 있는 모든 인큐베이터; C로 충분합니다. |
| 램프 | N/A | N/A | |
| 자석 교반기 벼룩 | N/A | N/A | |
| 멤브레인 롤러 | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Transfer 번들 팩에서 구매할 수 있습니다. 그러나, 이 제품을 사용할 수 없다면, 멤브레인 위로 굴러갈 수 있을 만큼 충분히 긴 매끄러운 표면의 원통형 튜브로 충분합니다. |
| 마이크로 원심분리기 튜브 (0.6 밀리리터) | N/A | N/A | |
| 마우스 IgG HRP 보조 | Thermo Fisher Scientific | 31430 | 염소 안티 마우스 IgG(H+L), RRID AB_228341. 블로킹 버퍼에서 20,000분의 1로 희석합니다. |
| 마우스 IgM HRP 보조 | Abcam | ab97230 | 염소 안티 마우스 IgM 뮤 체인. 마우스 IgG와 동일한 희석액으로 사용하십시오. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) 1차 항체 | DSHB | A4.840 | 희석 범위: BSA 완충액에서 200분의 1에서 500분의 1. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) 1차 항체 | DSHB | A4.74 | 희석 범위: BSA 완충액에서 200분의 1에서 500분의 1. |
| Myosin Heavy Chain IIx(MHCIIx) 1차 항체 | DSHB | 6H1 | 희석 범위: BSA 완충액에서 200분의 1에서 500분의 1 |
| 니트로 셀룰로오스 멤브레인 0.45 µ 엠 | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | 웨스턴 블로팅용. |
| 페트리 접시 뚜껑 | N/A | N/A | |
| 플라스틱 핀셋 | N/A | N/A | |
| 파워 팩 | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | 제품명: 기본 전원 공급 장치. |
| 단백질 래더 | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 - 180 kDa. |
| PVDF 멤브레인 0.2 &마이크로; m | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| 토끼 HRP 2차 | Thermo Fisher Scientific | 31460 | 염소 항토끼 IgG (H+L), RRID AB_228341. 희석은 마우스 2차 항체와 동일합니다. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| 가위 | N/A | N/A | |
| 실체현미경 | Motic | SMZ-168 | |
| 스트리핑 버퍼 | Thermo Fisher Scientific | 21059 | 제품 이름: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| 티슈(보푸라기 없음) | Kimberly-Clark professional | 34120 | 제품명: Kimwipe. |
| 전송 버퍼 (1x Tris Glycine 버퍼 (TG), 20% 메탄올) | TG: Bio-Rad Laboratories 메탄올 : Merck | TG 버퍼 : 1610771 메탄올 : 1.06018 | 초순수 H2< / sub>O로 10x TG 버퍼를 1x로 희석합니다. 20 % 메탄올의 최종 농도에 100 % 메탄올을 첨가합니다. 4 °C에 보관하십시오. |
| 트랜스퍼 트레이 | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-활성화 프리캐스트 젤 | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | 젤 유형: 4– 15% Criterion TGX 염색 무료 단백질 겔, 26 웰, 15 &L. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| 세척 버퍼 (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific 트윈 20: 시그마 | BIOA0027-4L | 1x TBST 레시피: 10x Tris-buffered saline(TBS)을 초순수 H2O로 1x로 희석하고 Tween 20을 첨가하여 최종 농도 0.1%를 만듭니다. 버퍼를 4°C로 저장합니다. |
| 세척 용기 | Sistema | Store에서 구입 | 대략적인 치수에 맞는 모든 타파웨어 용기로 충분합니다. |
참고문헌
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and huma....
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재인쇄 및 허가
