여기서는 형광 표지된 microRNA의 풍부함에 대한 체외 평가를 통해 microRNA 패키징의 역학을 연구하고 세포외 소포체(EV)로 내보낼 수 있는 간단한 프로토콜을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
세포외 소포체(EV)는 다양한 세포에서 분비되는 세포 통신의 중요한 매개체입니다. 이러한 EV는 단백질, 지질 및 핵산(DNA, mRNA, microRNA 및 기타 비암호화 RNA)을 포함한 생체 활성 분자를 한 세포에서 다른 세포로 셔틀하여 수용 세포에서 표현형 결과를 초래합니다. 다양한 EV 화물 중에서 microRNA(miRNA)는 EV의 명확한 조절 장애와 풍부함으로 인해 미세 환경을 형성하고 수용 세포를 교육하는 역할로 많은 주목을 받았습니다. 추가 데이터는 많은 miRNA가 EV에 활발하게 로드된다는 것을 나타냅니다. 이러한 명백한 증거에도 불구하고, miRNA 분류의 역학 및 메커니즘에 대한 연구는 제한적입니다. 여기서는 EV-miRNA 로딩의 역학을 이해하고 miRNA 내보내기와 관련된 메커니즘을 식별하는 데 사용할 수 있는 EV-miRNA의 유세포 분석을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 EV에서 농축되고 공여체 세포에서 고갈되도록 미리 결정된 miRNA를 형광단에 접합하고 공여체 세포로 transfection합니다. 그런 다음 형광 태그가 부착된 miRNA는 qRT-PCR을 사용하여 EV에 로딩되고 세포에서 고갈되는지 확인합니다. transfection control 및 transfection된 세포 집단을 게이팅하기 위한 도구로서, 형광 표지된 세포 RNA(세포 보유 및 EV 고갈)가 포함되어 있습니다. EV-miRNA 및 cell-retained-miRNA로 transfection된 세포는 72시간 동안 형광 신호에 대해 평가됩니다. EV-miRNA에 특이적인 형광 신호 강도는 세포 보유 miRNA에 비해 빠르게 감소합니다. 이 간단한 프로토콜을 사용하여 이제 miRNA 로딩의 역학을 평가하고 miRNA를 EV에 로딩하는 다양한 요인을 식별할 수 있습니다.
서론
MicroRNA(miRNA)는 전사 후 유전자 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 작은 비암호화 RNA의 가장 특징적인 하위 집합 중 하나입니다. 대부분의 miRNA의 발현과 생물발생은 핵에서 일차 miRNA(pri-miRNA)의 전사로 시작되는 일련의 조정된 사건을 따릅니다. 마이크로프로세서 복합체에 의해 precursor-miRNA(pre-miRNA)로 핵 처리된 후, pre-miRNA는 세포질로 내보내지고, 여기서 RNase III 엔도뉴클레아제에 의해 추가 처리를 거쳐 21-23개의 뉴클레오티드 성숙 miRNA 듀플렉스로 다이서됩니다1. 처리된 성숙한 miRNA의 가닥 중 하나가 표적 메신저 RNA(mRNA)에 결합하여 표적의 분해 또는 번역 억제를 유도합니다2. 여러 다양한 표적 mRNA를 동시에 조절하는 miRNA의 다원성 역할에 기초하여 miRNA 발현이 엄격하게 조절되는 것은 놀라운 일이 아닙니다3. 실제로, 부적절한 표현은 다양한 질병 상태, 특히 암의 원인이 됩니다. miRNA의 비정상적인 발현은 질병 특이적 시그니처를 나타낼 뿐만 아니라 예후 및 치료 잠재력의 표적으로 부상했습니다 4,5,....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고: 이 기술을 사용하기 위한 전제 조건으로, 선택적으로 내보낸 miRNA의 식별 및 검증이 필요합니다. EV로 분류된 miRNA 화물에 따라 세포주가 다르기 때문에 사용 전에 관심 세포주 및 관련 EV에서 miRNA를 평가하는 것이 좋습니다. 또한 리포펙타민 기반 transfection은 프로토콜의 중요한 단계 중 하나입니다. 실험을 설정하기 전에 transfection 효율을 미리 결정하는 것이 좋습니다.
1. 형광단 접합 EV-miRNA를 이용한 배양 및 transfecting 세포에서 세포 성장
- 200,000 내지 400,000 세포를 적절한 배양 배지에서 6-웰 플레이트의 삼중 웰에 플레이트한다. 균일한 세포 분포를 보장하기 위해 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다. 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 약 24-48시간 동안 배양합니다.
- transfection할 각 웰에 대해 제조업체의 지침에 따라 microcentrifuge 튜브에 있는 100μL의 무혈청 배지에 transfection 시약을 희석합니다.
참고: 이 설정 전에 관심 세포주에 대한 최적의 지질 농도를 결정해야 합니다. - transfection할 각 웰에 대해 형광단 접합 EV-....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기서는 세포에서 EV로의 miRNA 방출을 조사하기 위한 강력한 도구로 유세포 분석을 활용합니다. 이 프로토콜을 사용하여 cell-miRNA 및 EV-miRNA로 transfection된 세포의 유세포 분석 분석은 EV-miRNA에 해당하는 형광 신호의 순차적 감소를 나타내는 반면 cell-miRNA에 해당하는 신호는 세포에 유지되는 것으로 나타났습니다. 형광단 접합이 EV로의 miRNA 방출을 방해하지 않도록 하기 위해 miR-451a를 두 개의 개별 형광단(즉, Alexa fluor 488 및 Alexa fluor 750)에 접합하고 세포 머무름을 평가했습니다. 결과는 transfection 후 개별 형광단 신호 검출 간의 변동성이 최소화되었음을 나타내며 이 접근법의 신뢰성을 검증합니다(그림 3A,B).
RNA 분해를 포함하여 세포에서 형광 표지된 miR-451a의 손실을 설명할 수 있는 여.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
새로 확립된 프로토콜은 EV-miRNA의 transfection 후 EV로 miRNA 방출의 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 세포분석기의 기능에 따라 여러 EV-miRNA 및 cell-miRNA를 동시에 분석할 수 있습니다. 또한 유세포 분석 분석은 EV miRNA 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있지만 한계가 없는 것은 아닙니다. 그러나 보다 포괄적인 이해를 위해 다른 기술과 함께 사용할 때 일부 제한 사항을 극복할 수 있습니다.
EV 생물학에서 새롭게 떠오르는 관심 분야는 miRNA를 EV로 선택적으로 내보내는 것을 이해하는 것입니다15,16. 이 프로토콜은 miRNA의 선택적 내보내기를 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공하지만, 중요한 과제 중 하나는 능동 내보내기와 수동 내보내기를 구별하는 것입니다. 충분히 높은 농도에서 miRNA를 과발현.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
Purdue University의 유세포 분석 핵심 시설 책임자인 Jill Hutchcroft 박사의 지원과 조언에 감사드립니다. 이 연구는 R01CA226259 및 A.L.K.의 R01CA205420, A.L.K.에 대한 미국 폐 협회 혁신상(ANALA2023) IA-1059916, 퍼듀 공유 자원 시설 보조금 P30CA023168, 미국 국무부가 H.H.에 수여하는 플래그십 풀브라이트 박사 장학금의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisher | 05-408-129 | |
| 15mL Falcon 튜브 | Corning | 352097 | |
| 6웰 투명 평면 처리된 바닥 표면 처리된 조직 배양 플레이트 | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | 입자 감지를 위한 게이팅 및 매개변수 설정 |
| Attune Nxt 유세포 분석기 | ThermoFisher Scientific | N/A | EV의 형광 분석용 |
| BD Fortessa 세포 분석기 | BD Biosciences | N/A | 세포의 형광 분석용 |
| 세포 배양 인큐베이터 | N/A | N/A | 37 의 온도 유지; &데그; C 및 5% CO2 |
| Cell Culture medium | 관심 | 세포주에 대한 | 해당 없음 관심 |
| 세포주에 | N/A | N/A | 관심 있는 miRNA의 EV 및 세포 풍부도에 대해 테스트 및 평가된 모든 세포주. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | 관심 세포주에 의해 유지되도록 미리 결정되고 선택적으로 EV로 내보내지지 않는 miRNA |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | 통합 DNA 기술 (IDT) | EVs 로 선택적으로 분류되도록 미리 결정된 miRNAs | |
| 형광 현미경 | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific 혈구계 | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA 역전사효소 | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | ||
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| 파라포름알데히드, PBS Fisher | AAJ61899AK | ||
| 시약 저장용기 비멸균 | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| 트립신 0.25% | 피셔 | ||
| 초원심분리기 | N/A | N/A |
참고문헌
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
