Assessment of Mitochondrial oxygen consumption using a plate reader-based fluorescent assay(플레이트 리더 기반 형광 분석을 사용한 미토콘드리아 산소 소비량 평가)

Summary

산소 소비량 평가는 미토콘드리아 기능에 대한 필수 정보를 제공합니다. 형광판 리더가 있는 인광 프로브를 사용하면 특수 장비 없이 정확하고 재현 가능한 데이터를 쉽게 얻을 수 있습니다. 이 분석을 통해 모든 실험실에서 분리된 미토콘드리아의 산소 소비량을 측정하고 호흡 조절 비율을 계산할 수 있습니다.

Abstract

미토콘드리아는 세포 호흡, ATP 생성, 세포사멸 조절, 대사 경로의 중앙 허브 역할을 포함한 많은 중요한 기능을 수행합니다. 따라서 미토콘드리아 기능을 실험적으로 평가하면 다양한 인구 집단 또는 질병 상태 간의 차이에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한 분리된 미토콘드리아가 실험을 진행할 수 있을 만큼 건강한지 평가하는 것이 중요합니다. 서로 다른 샘플에서 미토콘드리아 기능을 비교하는 데 자주 사용되는 한 가지 특성은 산소 소비율입니다. 산소 소비량과 온전한 세포 또는 조직에서 분리된 미토콘드리아의 호흡 조절 비율 계산은 세 가지 목적을 모두 수행할 수 있습니다. 덤불도마뱀의 간에서 분리한 미토콘드리아를 용액의 산소 농도 변동에 민감한 인광 프로브와 함께 사용하여 형광판 판독기를 사용하여 산소 소비량을 측정했습니다. 이 방법은 빠르고 효율적일 뿐만 아니라 소량의 미토콘드리아로 특수 장비 없이도 수행할 수 있습니다. 여기에 설명된 단계별 프로토콜은 연구자에 대한 미토콘드리아 기능 평가의 접근성을 높입니다.

Introduction

미토콘드리아는 진핵 세포에서 발견되는 대략 박테리아 크기의 세포 기관입니다. 그들은 DNA를 포함하고 외부 및 내부 막의 두 개의 막을 가지고 있기 때문에 독특한 세포 기관입니다. 미토콘드리아의 외막과 내막은 막간 공간으로 분리되어 있으며, 내막은 기질(matrix)이라고 하는 가장 안쪽 구획 주위의 크리스테(cristae)라는 구조로 접힙니다. 이러한 크리스테는 내막의 표면적을 증가시켜 크리스테를 사용하는 여러 프로세스가 동시에 발생할 수 있도록 합니다. 미토콘드리아는 세포사멸(apoptosis)을 조절하고 여러 대사 경로를 수용하는 등 많은 세포 기능에 관여하지만, ATP 생성에서 미토콘드리아의 중요한 역할은 세포 생존에 필수적입니다. 실제로 세포 에너지의 90%는 미토콘드리아¹에서 파생됩니다. ATP 생산은 미토콘드리아 막 전위(Δψ)라고 하는 외막과 내막에 걸쳐 전기화학적 차이를 생성하는 것을 포함하며, 이는 H⁺ 이온이 매트릭스에서 막간 공간으로 펌핑될 때 발생합니다. ATP 생산은 궁극적으로 미토콘드리아 호흡계(ETC)를 통한 전자 이동을 통해 환원 등가물을 산화하는 동안 활용됩니다. 최종 전자 수용체는 분자 산소(O₂)입니다. 산소가 소비됨에 따라 H⁺ 농도 차이는 최대치까지 증가하며, 이 시점에서 H⁺ 이온은 ATP 합성효소 복합체를 통과하여 막간 공간에서 매트릭스로 농도 구배를 내려갑니다. H⁺ 이온의 이동은 ATP 합성효소에 구조적 변화를 일으키고, ADP는 무기 인산염과 근접하여 반응하여 ATP를 생성합니다. 마지막으로, ATP는 미토콘드리아 기질에서 세포질로 전위되며, 인산염의 가수분해 중에 방출되는 많은 양의 자유 에너지로 인해 저장되거나 반응을 촉진하는 데 사용될 수 있습니다. 이 모든 과정을 산화적 인산화라고 하며, 산소가 소비되기 때문에 미토콘드리아가 호흡한다고 합니다².

Δψ의 축적 및 강도,_O2 감소량(산소 소비량이라고 함), ATP의 생성은 모두 세포 건강의 지표로 사용될 수 있습니다. Δψ 측정, 총 ATP 함량 및 생산, 산소 소비량과 같은 미토콘드리아 기능 연구는 기존의 생화학적 방법 또는 플레이트 기반 분석의 형광 및 발광으로 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, 미토콘드리아 막 전위는 미토콘드리아에 특이적으로 결합하는 테트라메틸로다민 에틸 에스테르와 같은 형광 염료를 사용하여 여러 샘플 간에 비교할 수 있습니다. ATP 생성은 ATP 농도와 상관관계가 있는 변화 반응을 발광 단백질에 추가하여 모니터링할 수 있습니다. OXPHOS 중 산소 소비율 또는 절대 호흡 속도의 정량화는 미토콘드리아 기능과 에너지 대사의 불균형의 원인을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 산소 소비량 평가는 호흡 조절 비율(RCR)을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. RCR 값은 미토콘드리아의 주요 기능인 ADP의 유입에 반응하여 ATP를 만드는 미토콘드리아의 능력을 설명합니다. RCR 값은 고립된 미토콘드리아의 전반적인 상태를 나타내며 다른 실험 치료에 대한 반응을 비교할 수 있습니다. RCR 값의 차이는 미토콘드리아 기능 장애를 나타내거나 둘 이상의 소스에서 분리된 서로 다른 미토콘드리아 간의 생물학적 차이를 나타낼 수 있습니다. 고립된 미토콘드리아의 기능을 측정하는 또 다른 중요한 척도는_O2의 몰당 합성된 ATP의 몰 또는 P/O 비율³으로 정의되는 미토콘드리아 효율입니다.

미토콘드리아 매개변수를 측정하여 수집할 수 있는 정보의 양과 이 정보를 활용할 수 있는 다양한 사례를 감안할 때 기능 데이터를 효율적으로 수집하는 능력은 다양한 연구 분야에서 유용할 수 있습니다. 미토콘드리아 산소 소비량 측정은 측정을 수행하는 데 필요한 샘플 크기에 의해 제한될 수 있는 Clark 전극을 사용하는 매우 구체적인 기기로 수십 년 동안 수행되어 왔으며, 최근에는 미토콘드리아 호흡 및 기타 여러 매개변수를 측정할 수 있지만 비용이 많이 들 수 있는 정교한 기기를 사용하여 수행되었습니다. 이 프로토콜은 산소에 민감한 인광 프로브(MitoXpress)^4,5를 사용하는 적응형 대체 접근 방식입니다. 프로브 신호는 시간 분해 형광 모드의 플레이트 리더로 감지되어 시간이 지남에 따라 지속적으로 측정됩니다. 인광은 형광에 비해 흡수된 광자와 방출된 광자 사이의 에너지 차이가 더 크므로 신호의 변화를 지속적으로 모니터링하는 데 더 적합합니다. 이를 통해 미토콘드리아 대사에 중점을 두거나 고도로 전문화된 장비를 구입할 수 있는 실험실뿐만 아니라 거의 모든 실험실에서 이러한 측정을 수행할 수 있습니다. 우리가 사용하는 모델 시스템은 3 개의 나무 도마뱀, 2 개의 부모 종 및 1 개의 도입 된 미토콘드리아입니다 (한 부모 종의 핵 DNA와 다른 부모 종의 미토콘드리아를 포함하는 잡종). 이 도마뱀은 서로 다른 핵 및 미토콘드리아 DNA 공급원을 가진 잡종에 대한 신진대사 및 에너지 결과가 있다는 가설을 세웠기 때문에 선택되었습니다. 우리는 더 많은 연구자와 연구 분야에서 이러한 유형의 분석에 대한 접근성을 높일 수 있는 다중 모드 플레이트 리더와 함께 상업적으로 이용 가능한 분석 키트를 활용했습니다.

Protocol

도마뱀은 CO₂ 질식으로 안락사된 후 동물 실험실 복지국(Office of Animal Laboratory Welfare)과 Elon의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 설명된 정책에 따라 즉시 참수되었습니다.

1. 미토콘드리아^{분리 6}

알림: 모든 용액을 차갑게 유지하고(표 1) 이 단계를 통해 얼음 위에 샘플을 보관하십시오.

1. 간을 제거하고 무게를 잰 다음 ~3mL의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(1x, -/-)로 헹굽니다.
2. 새 면도날로 L-MIB 1mL에 간을 다집니다.
3. 조직의 총 부피와 L-MIB를 2mL로 늘리고 Dounce 균질기로 간 세포를 4회 동안 기계적으로 파괴합니다.
4. 균질산염을 300 × g (37 ° C, 10 분)에서 회전시킵니다.
5. 상층액을 새 튜브에 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
6. 펠릿을 L-MIB 2mL에 재현탁하고 재균질화한 후 300× g( 37°C, 10분)에서 다시 회전합니다.
7. 스핀과 원심분리기의 상층액을 10,000 × g (37 °C, 10분)에서 결합합니다.
8. 펠릿을 ~0.350mL의 L-MIB에 재현탁합니다.
9. 미토콘드리아 함량에 대한 근사치로 사용할 총 단백질의 양(미토콘드리아 mg/L-MIB mL)을 결정합니다 ^4,5,6.

2. 산소 소비량

1. 다음 단계에서 사용된 모든 용액(표 1)을 수조에서 30°C로 예열합니다.
2. 1.9단계의 단백질 농도 분석 결과에 따라 LEB의 미토콘드리아를 6mg/mL로 희석합니다.
3. 멸균 96웰 검은색 벽의 투명한 바닥 플레이트에 분석을 설정합니다(표 2).
   1. 50μL의 샘플(L-EB 완충액 또는 미토콘드리아 샘플)을 적절한 웰에 추가합니다.
   2. 50μL의 치료제(L-EB, 글루타메이트/말레이트 또는 글루타메이트/말레이트 w/ADP)를 추가합니다.
   3. 프로브 스톡을 L-EB로 1:10으로 희석한 다음 모든 웰에 형광 프로브 100μL를 추가합니다.
   4. 주변 산소를 차단하기 위해 모든 웰에 50μL의 중광유를 부드럽게 첨가합니다.
4. 380/650nm 여기/방출에서 45분 동안 1.5분마다 플레이트 바닥에서 형광 측정값을 읽습니다. 30,000 μs의 시간 지연과 100 μs의 측정 창에서 키네틱 모드를 사용합니다.

3. 데이터 분석

1. 플레이트 리더 컴퓨터에서 원시 데이터 파일을 .xls 파일로 내보냅니다.
2. 파일을 연 다음 원시 데이터를 복사하여 새 탭에 붙여넣고 행과 열에 적절하게 레이블을 지정합니다.
3. L-EB 버퍼를 대조군 샘플에만 플롯하고 L-EB + G/M을 시간 대비 상대 형광 단위(RFU)로 플롯합니다.
   참고: 이 선은 미토콘드리아가 없기 때문에 비교적 평평해야 하므로 산소 농도의 변화를 감지해서는 안 됩니다.
4. L-EB + G/M 샘플 값을 RFU 대 시간으로 플롯합니다.
5. 판독값이 더 일관되고 컨트롤에 대해 평평해지는 위치를 결정합니다.
   참고: 여기에서 실험 샘플에 대한 데이터 분석이 시작되어야 합니다( 그림 1A에서 화살표로 표시). 반응이 평평해지고 최대치에 도달하는 데 10-15분이 걸릴 수 있습니다.
6. 3.5단계에서 설정한 시점 이후의 데이터("트리밍된" 데이터라고 함)만 포함하는 새 플롯을 만들고 최적선을 추가하여 분석할 원시 데이터를 시각화합니다.
7. 트리밍된 제어 버퍼 전용 데이터(노란색으로 강조 표시됨)의 평균 RFU 값을 계산합니다. 이 값은 아래 산소 계산에서 기준선으로 최소 RFU 값으로 사용됩니다.
8. 산소 소비율 계산 (μM O₂ / min)
   1. 3.6단계에서 원시 데이터(즉, 트리밍된 데이터)의 선형 영역을 복사하고 붙여넣어 각 시점 ^7,8,9,10에서 G/M + ADP 처리에서 미토콘드리아 샘플의 산소 농도를 확인합니다.
   2. 방정식 (1)⁵ 를 사용하여 각 시점의 산소 농도를 결정합니다. [오우₂]_a 는 공기 포화 완충액(30°C에서 235mM)의 산소 농도입니다. I(t), Ia 및 Io는 시간 t 에서 샘플 + 프로브의 형광 신호(예: 샘플 + G/M + ADP), 3.7단계에서 계산된 공기 포화 버퍼에서 프로브의 평균 신호 및 탈산소 버퍼의 최대 신호(달성 가능한 최대 신호로 설정)입니다.
      (1)
   3. 3.8.2단계에서 계산된 [O₂]_t 값을 시간에 대해 플롯하고 최적선 방정식과 함께 선형 추세선을 추가합니다.
      알림: 각 선의 기울기를 산소 소비율로 사용합니다. 모든 샘플에 대한 중복 또는 삼중을 집계하여 소비율 비교에 사용할 수 있습니다.
9. ADP가 있는 미토콘드리아 호흡과 없는 미토콘드리아 호흡을 각각 상태 3과 2를 나타내는 것으로 나누어 RCR을 계산합니다.

Results

산소 소비율과 미토콘드리아 RCR은 인광 산소 감지 프로브와 표준 형광 플레이트 리더가 있는 분석 키트를 사용하여 세 가지 도마뱀의 미토콘드리아에서 측정되었습니다. 이전 연구에서는 이 키트의 프로브가 산소 소비와 직접적인 상관관계가 있음을 확인했으며, 여기서 인광은 분자 산소에 의해 소멸되고 미토콘드리아 호흡으로 인해 산소 수치가 감소함에 따라 형광 신호가 증가합니다 ^7,11. RFU 값은 대조군 샘플과 실험 샘플 모두에 대해 시간이 지남에 따라 기록된 후 분석됩니다. 대조군 웰(완충액만, 글루타메이트/말레이트로 처리된 완충액, 글루타메이트/말레이트 + ADP로 처리된 완충액)에 대한 RFU 판독값을 시간과 비교하여 실험 샘플 웰의 형광 변화가 미토콘드리아의 존재로 인한 것임을 확인했습니다. 또한 글루타메이트/말레이트 + ADP 제어는 데이터 수집 중 산소의 기준량을 허용합니다. 분리된 미토콘드리아를 포함하는 실험 샘플도 대조군과 동일한 그래프에 표시되었습니다.

그림 1A 는 대조군의 상대적으로 평평한 RFU 값과 달리 분리된 미토콘드리아 샘플에서 시간이 지남에 따라 RFU가 증가한다는 것을 보여줍니다. 반응이 평형을 이루는 데 시간이 걸리기 때문에 대조군 샘플 판독값이 잡음이 없고 평준화되지 않을 때까지 처음 10개 정도의 판독값이 데이터 세트에서 제거됩니다(보충 표 S1 및 보충 그림 S1). 다음으로, 글루타메이트/말레이트 + ADP로 처리된 미토콘드리아 샘플의 나머지 값은 방정식 (1)(프로토콜 단계 3.2 참조)을 사용하여 각 시점의 산소 농도로 변환된 다음 시간 대비 플롯됩니다. 그림 1B 는 그림 1A (교차)에서 볼 수 있는 실험 샘플의 결과를 보여주며, 여기서^R2 값이 1에 매우 가깝고 선의 기울기를 계산할 수 있습니다. 선의 기울기는 산소가 소비됨에 따라 해당 샘플의 총 산소 농도가 감소하기 때문에 음수입니다. 산소 소비율을 얻기 위해 ADP 없이 글루타메이트/말레이트로 처리된 동일한 미토콘드리아 샘플에 대해 이와 동일한 프로세스를 반복합니다(보충 표 S2 및 보충 그림 S2). 그런 다음, 각각 상태 3과 2를 나타내는 ADP가 있거나 없는 미토콘드리아 호흡을 사용하여 각 샘플 유형에 대한 RCR을 계산할 수 있습니다(보충 그림 S2). 나란히 비교했을 때, 세 가지 다른 유형의 나무 도마뱀 사이의 평균 RCR은 미토콘드리아가 내향된 잡종의 RCR이 부모 유형보다 현저히 낮다는 것을 나타냅니다(그림 1C). 잡종 도마뱀 미토콘드리아는 두 부모 유형의 산소 소비율이 중간 수준이었습니다(그림 2).

그림 1: 산소 소비량 분석 결과의 예. (A) ADP를 첨가하거나 첨가하지 않고 글루타메이트 및 말레이트(G/M)로 처리된 완충액 단독 대조 반응 및 분리된 미토콘드리아를 포함한 반응의 원시 데이터. 형광은 시간이 지남에 따라 모니터링되었습니다. 산소가 소비되면 형광이 증가합니다. 완충액 단독 반응(G/M, 원으로 표시, G/M + ADP, 삼각형으로 표시)과 G/M 처리(사각형으로 표시)를 통한 미토콘드리아는 변화가 없었습니다. G/M + ADP(더하기 기호로 표시)로 처리된 미토콘드리아는 산소를 소비했습니다. (B) A에 제시된 G/M + ADP로 처리된 미토콘드리아의 원시 데이터에서 계산된 시간 경과에 따른 산소 농도의 변화. (C) 실온에서 측정한 세 가지 다른 유형의 도마뱀의 미토콘드리아에 대한 RCR 값. 이 그림은 Haenel and Del Gaizo Moore¹²에서 재현 된 것입니다. 통계 분석은 R의 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. 약어: G = 글루타메이트; M = 말레이트; RCR = 호흡 조절 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 세 가지 유형의 도마뱀에서 미토콘드리아의 산소 소비율. 상자 그림은 산소 소비율의 중앙값을 막대로, 평균을 점으로 표시합니다. 부모 유형인 우로사우루스 그라시오수스(Urosaurus graciosus )와 우로사우루스 오르나투스(Urosaurus ornatus)는 서로 현저하게 달랐다. 도입 형태 (Hybrid)는 부모 유형보다 중간 수준이었고 어느 쪽과도 크게 다르지 않았습니다. 이 그림은 Haenel and Del Gaizo Moore¹²에서 재현 된 것입니다. 약어: Ug= Urosaurus graciosus; Uo = 우로사우루스 오르나투스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 프로토콜에 사용된 솔루션의 구성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 산소 소비량 분석을 위한 플레이트 맵. 각 샘플에 대해 최소 6개의 웰(3개의 대조 웰: L-EB만 해당, G/M 처리가 있는 L-EB, G/M + ADP 처리가 있는 L-EB, 3개의 실험 웰/샘플: L-EB 처리가 있는 미토콘드리아, L-EB + G/M 및 L-EB G/M + ADP 처리). 가능하면 각 실험 샘플을 중복 또는 삼중으로 실행합니다. 약어: G = 글루타메이트; M = 말레이트; L-EB = 도마뱀 특이적 실험용 완충액. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: 데이터 플롯. (A) 샘플과 대조군의 비교를 위한 모든 원시 데이터의 플롯. (B) 보충 표 S1 에서 강조 표시된 열의 테두리가 있는 원시 데이터의 플롯으로, 미토콘드리아 샘플이 포함된 우물에서만 RFU가 눈에 띄게 증가했음을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: 산소 소비량 및 호흡 조절 비율. (A) 최적선의 방정식을 찾아 상태 2 및 상태 3 값을 결정하기 위한 보충 표 S1의 산소 소비량 데이터 플롯. (나) State 2와 State 3을 나타내는 (A)의 선 기울기를 사용한 RCR 비율 계산. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: 원시 데이터의 대표적인 예. 강조 표시된 열은 그림 및 계산에 사용되는 데이터(즉, 잘린 데이터)입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S2: 트리밍된 데이터 및 후속 산소 소비량 계산의 대표적인 예입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

미토콘드리아 기능 측정은 질병 상태와 비질병 상태, 동일한 동물의 다른 조직 유형 또는 다른 샘플 유형과 같은 다른 샘플을 비교할 때 유용합니다. 우리는 미토콘드리아를 도입한 잡종 나무 도마뱀에 대한 대사 결과가 있다는 가설을 테스트하기 위해 나중의 비교를 사용했습니다. 미토콘드리아 기능을 실험적으로 확인하는 방법에는 Δψ의 정량화, 총 ATP 함량, ATP 생성, 호흡 조절 및 산소 소비율 등 다양한 방법이 있습니다. 분리된 미토콘드리아의 산소 소비량 측정은 Clark 전극 또는 보다 정교한 Seahorse XF와 같은 특수 장비를 사용하여 수행할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 측정을 수행하는 데 필요한 샘플 크기에 의해 제한되거나 비용이 많이 들 수 있습니다. 형광을 판독할 수 있는 다중 모드 플레이트 리더는 세포 생물학 및 생화학 실험실의 표준 장비가 되었습니다. 따라서 미토콘드리아 산소 소비량을 정량적으로 분석하기 위한 대안적인 접근 방식은 형광판 판독기가 있는 상용 키트를 사용하는 것입니다. 이 단계별 프로토콜은 산소 소비량을 측정하고 계산을 수행하는 방법을 설명합니다. 그리고 경제적으로 고립된 미토콘드리아에서. 상태 3 호흡이라고 하는 ADP가 공급되었을 때 ATP를 생성하는 미토콘드리아의 능력을 정확하게 측정하면 샘플 간의 OXPHOS를 직접 비교할 수 있으며 차이점은 기능적 차이를 나타낼 수 있습니다. 또한, State 3 호흡은 분리된 미토콘드리아의 품질을 나타내며, 이는 분리 절차가 효과가 있었는지 및/또는 샘플이 다른 분석에 사용할 수 있을 만큼 양호한지 여부를 결정할 수 있습니다. 상태 2(글루타메이트와 말레이트만, Δψ를 만들기 위해)와 상태 3 값(글루타메이트와 말레이트와 ADP, Δψ을 ATP 생산에 사용할 수 있도록)을 사용하여 계산되는 RCR 값은 비교를 위한 또 다른 정보와 분리된 미토콘드리아의 건강에 대한 정보를 제공합니다. 제시된 데이터는 이 백서에서 제공하는 방법이 고도로 전문화된 장비 없이도 서로 다른 시료 유형 간의 차이를 해독하고 산소 소비율과 RCR 값을 측정하는 데 도움이 될 수 있음을 보여주므로 이러한 유형의 측정에 보다 쉽게 접근할 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 도마뱀에서 미토콘드리아를 새로 분리하고, 산소 소비량은 제조업체의 프로토콜에 따라 MitoXpress Xtra Hs 분석을 사용하여 측정되었으며 Hynes et ^al.4 및 Will et ^al.5 에 따라 수정되었습니다.도마뱀의 총 몸무게는 3.3g에서 5.1g이며 평균 0.170g의 간 조직/도마뱀이었습니다. ~0.350mL의 농축된 조잡한 미토콘드리아를 생성했습니다. 분리된 미토콘드리아는 6mg/mL 단백질에서 산소 소비량 분석에 사용되었습니다. 프로토콜 단계 1.7에서 측정된 미토콘드리아 단백질 농도가 낮으면 샘플을 10,000 × g 에서 다시 방사하고 펠릿을 더 적은 양의 L-MIB에 재현탁시킬 수 있습니다. 또한 작은 간 샘플에 대해 또는 간 전체를 사용할 수 없을 때 4mg/mL 정도만 성공적으로 사용했다는 점에 유의해야 합니다.

분석 시작 시 샘플의 가스 및 온도 평형을 보장하기 위해 프로토콜 섹션 2에 사용된 모든 용액은 수조에서 30°C로 예열되어야 합니다. 프로토콜 섹션 3에서 용존 산소의 변화율(mM/min)은 각 샘플에 대한 산소 농도 감소 프로파일의 초기 기울기에서 외삽됩니다(프로토콜 단계 3.3; 보충 표 S1 및 보충 그림 S1). 샘플 + G/M 처리 비율은 상태 2 미토콘드리아 호흡을 나타내는 반면, G/M + ADP 처리 비율이 있는 샘플은 상태 3 미토콘드리아 호흡을 나타냅니다. 따라서 RCR은 각 샘플에 대한 상태 3 값을 상태 2 값으로 나누어 각 샘플에 대해 계산됩니다(보충 표 S2).

산소 소비량은 여기에서 입증된 바와 같이 고유한 샘플 간에 또는 하나의 샘플에서 다른 처리 간에 비교할 수 있습니다. 후자의 경우, 화학적 처리 자체가 인광 프로브와 상호 작용하지 않을 가능성을 배제하기 위해 미토콘드리아가 있거나 없는 차량 전용 제어와 같은 추가 제어가 필요할 수 있습니다. 또한 수집된 산소 소비량 및 RCR 데이터는 다른 분석법과 동일한 샘플에서 수집된 데이터와 함께 사용할 수 있습니다. 미토콘드리아가 분리되면 미토콘드리아의 기능에 대한 보다 완전한 그림을 제공하기 위해 여러 분석에 활용할 수 있습니다¹². Δψ, 총 ATP 함량 및 ATP 회전율의 측정은 결합된 분석 방법 중 일부입니다. 또한 분석과 함께 ETC, OXPHOS 및 ATP 합성효소 억제제를 사용하면 다양한 미토콘드리아 시료 유형을 더욱 완벽하게 이해할 수 있어 생성된 데이터에서 도출된 결론을 강화할 수 있습니다.

분리된 미토콘드리아에서 측정할 수 있는 또 다른 매개변수는 미토콘드리아 효율이며, 이는 O₂³ 몰당 합성된 ATP 몰의 P/O 비율로 정의됩니다. P/O 비율은 State 3 미토콘드리아가 반응에 공급된 ADP를 소진하도록 허용한 다음 ADP 기질의 부분 표본을 추가한 다음 올리고마이신을 추가하여 ATP 합성효소를 억제함으로써 이 프로토콜의 확장에서 계산할 수 있습니다. 이러한 추가 단계를 통해 미토콘드리아가 계속해서 산소를 소비하고 강력한 Δψ를 유지하여 최대 ATP를 만들 때 발생하는 상태 4를 계산할 수 있으며, 미토콘드리아의 누출에 대한 정보를 제공하며(H⁺ 이온이 ATP 합성효소를 사용하지 않고 매트릭스로 다시 교차하여 Δψ를 소멸하는 경우), 궁극적으로 미토콘드리아의 기능 장애를 나타냅니다. 또한, State 4 측정은 새로 형성된 ATP를 매트릭스에서 이동시키는 동시에 ADP 기질을 가져오는 ADP/ATP 트랜스로케이터가 작동하는지 여부와 멤브레인을 가로지르는 ADP 및 ATP의 누출이 발생하고 있는지 여부를 나타낼 수 있습니다. ATP 합성효소를 억제하는 올리고마이신을 첨가하는 것은 미토콘드리아가 실제 기능 장애로 인해 누출되는지 확인하기 위한 제어입니다. P/O 비율을 계산할 수 있도록 상태 4를 측정하는 것은 세 가지 미토콘드리아 샘플 유형 간의 비교를 위해 찾고자 했던 정보의 범위를 벗어났지만, 이는 미토콘드리아 기능에 대한 또 다른 데이터이며 이 프로토콜의 확장으로 수행될 수 있습니다. 마지막으로, 미토콘드리아는 배양 중인 세포와 마우스 또는 쥐의 다른 조직(예: 간, 심장, 척수)에서 분리할 수 있다는 점에 주목할 가치가 있습니다. MIB 및 EB 제형과 분리 프로토콜에 대한 조정이 필요할 수 있습니다 ^{4,13,14,15,16}. 또한, 제조업체의 지침에 따라 이 분석은 온전한 전체 세포를 대상으로 수행할 수 있습니다. 따라서 제시된 방법은 도마뱀이나 간 미토콘드리아에 국한되지 않으므로 다양한 과학 하위 분야에 걸친 광범위한 실험 모델에 적합할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96웰 블랙/광학 바닥 플레이트	Thermo Fisher	265301	바닥이 투명한 처리되지 않은 검은색 벽 플레이트.
ADP	Sigma	A2754	희석 100 &마이크로; M 재고는 사용 직전에 EB가 들어 있습니다.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	단백질 분석을 위해 물 속에 2 mg/mL 스톡을 만듭니다.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	PBS에 Mg2+ 또는 Ca2+ 이온이 없는지 확인하십시오.
EGTA	시그마	E3889
K2HPO4	시그마	P3786
KH2PO4	시그마	P0662
L-글루탐산	시그마	G1251
L-글루탐산 칼륨염	시그마	S372226
L-말산	시그마	M8304
L-말산 모노칼륨염	Sigma	49601
MitoXpress 산소 소비량 키트	Agilent	MX-200-4	키트에는 프로브 스톡과 HS 미네랄 오일이 포함되어 있습니다.
MOPS	Sigma	M3183
Protien Assay Dye (5x)	BioRad	500-0006	모든 단백질 분석법으로 대체할 수 있습니다.
R 버전 3.3	R Core Development Team 2016
Thermomax 마이크로플레이트 리더 EnSpire 다중 모드 플레이트 리더 및 소프트웨어	PerkinElmer		표준 형광 플레이트 리더
Trisma 베이스	Sigma	T6066	모든 버전의 Tris 베이스를 사용할 수 있습니다.