Method Article

핵산 비율의 신속한 탐색을 위해 최적화된 마우스 배아 줄기 세포 기반 역 Poly-transfection 기술

DOI:

10.3791/65766

⸱

December 8th, 2023

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜은 2i 및 LIF 배지를 사용한 배양 중 마우스 배아 줄기 세포의 역 다중-transfection 방법을 설명합니다. 이 방법은 기존의 forward transfection 프로토콜보다 더 높은 생존력과 효율성을 제공하는 동시에 plasmid 비율의 one-pot 최적화를 가능하게 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

상대적으로 단순하고 사용하기 쉽기 때문에 포유류 세포주와 핵산의 일시적인 transfection은 생물 의학 연구의 중심이 되었습니다. 가장 널리 사용되는 세포주는 부착성 2차원 배양에서 transfection을 위한 강력한 프로토콜을 가지고 있지만, 이러한 프로토콜은 종종 연구가 덜 된 세포주 또는 비정형적이고 transfection하기 어려운 형태를 가진 세포주에는 잘 변환되지 않습니다. 재생 의학에 널리 사용되는 배양 모델인 2i/LIF 배지에서 성장한 마우스 만능 줄기 세포를 사용하는 이 방법은 더 높은 transfection 효율을 달성할 수 있는 최적화되고 신속한 역transfection 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 활용하여 3-plasmid poly-transfection을 수행하고, plasmid delivery에서 정상보다 높은 효율을 활용하여 확장된 범위의 plasmid 화학량론을 연구합니다. 이 reverse poly-transfection 프로토콜은 one-pot 실험 방법을 허용하여 사용자가 여러 co-transfection이 아닌 단일 웰에서 plasmid 비율을 최적화할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜은 전달된 유전 회로의 전체 기능에 대한 DNA 화학량론의 효과에 대한 신속한 탐색을 촉진함으로써 배아 줄기 세포 형질 주입의 시간과 비용을 최소화합니다.

Introduction

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DNA와 RNA를 포유류 세포로 전달하는 것은 생물의학 연구의 핵심 기둥 역할을 합니다1. 외인성 핵산(NA)을 포유류 세포에 도입하는 일반적인 방법은 일시적인 형질주입(transfection) 2,3을 이용하는 것입니다. 이 기술은 NA를 수용 세포로 전달할 수 있는 상업적으로 이용 가능한 transfection 시약과 혼합하는 데 의존합니다. 전형적으로, NA는 2차원 표면에 부착된 세포가 transfection 복합체를 받는 forward transfection을 통해 전달됩니다. 가장 일반적으로 확립된 세포주에 대한 전방 transfection은 견고하고 프로토콜이 잘 알려져 있지만, 비단층 형태를 가진 더 많은 틈새 세포 유형은 쉽게 transfection되지 않아 전달할 수 있는 NA의 양과 이를 받는 세포의 수가 제한됩니다.

만능줄기세포(PSC)는 무한정 분열하여 모든 유형의 체세포를 생산할 수 있는 능력을 감안할 때 발달을 이해하는 데 매력적인 모델이자 재생 의학의 도구로 사용됩니다. 마우스 PSC(mPSC)의 경우, 2개의 억제제와 LIF(2....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. mPSC 배양을 위한 시약 준비

  1. N2 보충제를 준비합니다.
    1. 비멸균 조건에서는 화학 안전 흄 후드에 다음 원액(단계 1.1.1.1)을 준비합니다. 각 화학 물질의 고체 분말을 사전 칭량된 50mL 원뿔형 튜브에 추가합니다. 분말을 첨가한 후 각 튜브의 무게를 측정하고 적절한 양의 용매를 추가하여 아래 농도를 달성합니다. 한 배치의 용지에 대해 나열된 최소 양을 준비합니다.
      알림: 다음 시약은 위험하므로 현지 화학 안전 지침에 따라 취급해야 합니다. 취급 시 적절한 PPE를 확인하고 흡입을 방지하기 위해 화학 흄 후드에서 이러한 화학 물질의 고체 분말 형태로만 작업하십시오.
      1. 0.518mg/mL의 물에 최소 0.05mL의 셀렌산나트륨, 160mg/mL의 물에 0.5mL의 푸트레신, 0.6mg/mL의 100% 에탄올에 0.165mL의 프로게스테론(재료 표 참조).
      2. 용액을 -20°C에서 최대 2년 동안 보관할 수 있습니다.
    2. 생물안전 작업대(BSC)에서 DMEM-F12 58.035mL에 다음을 추가합니다.
      1. 0.518mg/mL 셀렌산나트륨 용액 0.05mL, 160mg/mL 푸트레신 용액 0.5mL, 0.6mg/mL....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

순방향 및 역방향 transfection은 모두 세포막과 incoming transfection 시약-DNA 복합체 사이의 상호 작용에 의존하여 NA를 수용 세포에 전달할 수 있습니다. 이러한 기법이 다른 점은 전달 시 세포의 상태입니다 - DNA는 일반적으로 기존의 순방향 transfection에서 부착 세포 단층으로 전달되는 반면, 역방향 transfection은 대신 단일 세포 현탁액에서 시약-DNA 복합체가 세포와 만나도록 하는 데 의존합니다. 이러한 차이는 세포가 균일하고 평평한 단층으로 성장하지 않고 대신 mPSC와 같이 더 돔형 또는 콜로니와 유사한 형태를 채택하는 상황에서 특히 중요할 수 있습니다. 전통적인 transfection에 대한 추가적인 변형이 채택될 수 있는데, 예를 들어 co-transfection 대신 poly-transfection을 수행하는 것이 좋습니다. 이 변형은 주어진 처리에서 각 DNA 종의 상대적 분포를 변경하여 연구자들이 표현형과 플라스미드 투여량 사이의 관계를 신속하게 탐구할 수 있도.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

transfection 프로토콜이 널리 채택되는 주요 이유는 재현성과 접근성입니다. 그러나 이러한 프로토콜은 실험 컨텍스트 전반에 걸쳐 최적화가 필요합니다. 새로운 세포주를 처음으로 transfection하려고 할 때 필요한 표준 검사는 위에 언급되지 않았습니다. 첫째, 시중에서 판매되는 시약은 만능이 아니며 세포 유형에 따라 NA 전달 생존력의 효율성이 다르기 때문에 transfection 시약의 선택이 중요합니다. 또한 NA 및 transfection 시약의 이상적인 양과 최적의 비율을 찾으려면 테스트가 필요합니다. transfection 시약 공급업체에서 권장하는 최적화 단계를 따르는 것만으로도 NA와 transfection 시약의 이상적인 양에 도달하는 경우가 많습니다.

주어진 transfection이 실패했을 때, 가장 먼저 고려해야 할 사항은 사용된 시약의 적합성입니다: NA가 검증되고 염기서열분석이 이루어졌는지, transfection 전에 세포가 최적으로 생존 가능.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 지면의 제약으로 인해 이 연구에서 인용되지 않은 이 분야에 대한 많은 기여와 이러한 기회를 제공한 자금 지원 기관에 감사를 표하고자 합니다. 저자들은 이 연구를 지원한 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)와 캐나다 보건 연구소(CIHR)의 자금 지원을 인정합니다. KM은 NSERC의 CGS-M 장학금과 브리티시 컬럼비아 대학교의 Killam 박사 장학금을 받았습니다. N.S.는 Michael Smith Health Research BC Scholar Award를 수상했습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아쿠아타제 MilliporeSigmaSCR005
아포트랜스페린 MilliporeSigmaT1147-500MG
B27 보충제 써모피셔 사이언티픽 
베타-메르캅토에탄올ThermoFisher Scientific 
BSA 분획 V (7.5%)Gibco15260-037
CHIR99021 MilliporeSigmaSML1046-25MG
DMEM-F12MilliporeSigmaD6421-24X500ML
유세포 분석 표준화 비드SpherotechURCP-38-2K
젤라틴 MilliporeSigmaG1890
GlutaMAX 보충제 써모피셔 사이언티픽 
인슐린 Gibco12585-0014
리포펙타민 2000 Invitrogen11668-019트랜스펙션 시약
Neurobasal mediaThermoFisher Scientific 
21103049 옵티멤 인비트로젠31985-070
PD0325901 MilliporeSigmaPZ0162-25MG
프로게스테론MilliporeSigmaP8783화학적 위험 - 현지 안전 지침을 참조하고, 적절한 PPE를 착용했는지 확인하고, 화학 흄 후드에서만 고체 분말 형태로 작업
PutrescineMilliporeSigmaP6780화학적 위험 - 현지 안전 지침을 참조하고, 적절한 PPE를 착용했는지 확인하고, 화학 흄 후드
에서만 고체 분말 형태로 작업하십시오.재조합 mLIF BioTechne8878-LF-500/CF
나트륨 셀렌산염 MilliporeSigmaS5261-25G화학적 위험 - 현지 안전 지침을 참조하고, 적절한 PPE가 착용되었는지 확인하고, 고체 분말 형태로만 화학 연기 후드에서만 작업
Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific 
175040442198502335050061하십시오 하십시오. 25200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  2. Fus-Kujawa, A., et al. An overvie....

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Reverse Poly TransfectionMouse Embryonic Stem CellsNucleic Acid RatiosPlasmid DeliveryTransient TransfectionGene DosageFlow CytometryPluripotent Stem CellsDNA StoichiometryLipofectamine Transfection

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