이 프로토콜은 효소 소화를 통해 치수에서 다분화능 줄기 세포의 추출, 배양 및 보존을 강조합니다. 또한 조골세포, 지방세포 및 연골세포로 분화할 수 있는 잠재력을 보여주며 공정에서 정밀도와 일관성의 중요성을 강조합니다.
방법 논문
Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth(인간 낙엽 및 영구치에서 치과용 치수 줄기 세포의 분리, 배양 및 특성화)
이 논문에서
요약
초록
재생 의학 및 치료 응용 분야에서 줄기 세포 연구는 빠르게 견인력을 얻고 있습니다. 낙엽치와 영구치 모두에 존재하는 치과용 치수줄기세포(DPSC)는 접근성, 적응성, 선천적 분화 능력으로 인해 중요한 줄기세포 공급원으로 부상했습니다. DPSC는 쉽게 구할 수 있고 풍부한 중간엽 줄기 세포 저장소를 제공하며, 특히 재생 목적에서 인상적인 다양성과 잠재력을 보여줍니다. 이러한 약속에도 불구하고, 주요 장애물은 치과 치수세포 내에서 미세한 분획으로 표현되는 DPSC를 효과적으로 분리하고 특성화하는 데 있습니다. 이 귀중한 세포 자원을 적절하게 보존하는 것도 마찬가지로 중요합니다. DPSC 분리를 위한 두 가지 주요 방법은 효소 소화(ED)와 조직 외식물로부터의 증식(OG)이며, 종종 자연 성장이라고 합니다. 이 프로토콜은 주로 DPSC 분리를 위한 효소 분해 접근법에 중점을 두고 추출, 실험실 내 처리 및 세포 보존을 포괄하는 단계를 복잡하게 자세히 설명합니다. 추출 및 보존을 넘어 이 프로토콜은 DPSC의 분화 능력을 탐구합니다. 특히, 이러한 줄기 세포가 지방세포, 조골세포 및 연골세포로 분화하도록 유도하는 데 사용되는 절차를 간략하게 설명하고 다능한 특성을 보여줍니다. 이후에 비색 염색 기법을 활용하면 정확한 시각화와 성공적인 분화를 확인할 수 있어 분리된 DPSC의 구경과 기능을 검증할 수 있습니다. 이 포괄적인 프로토콜은 치과용 치수줄기세포 추출, 배양, 보존 및 특성화의 전체 스펙트럼을 포괄하는 청사진으로 기능합니다. 이는 DPSC가 품고 있는 상당한 잠재력을 강조하며, 줄기세포 연구를 추진하고 미래의 재생 및 치료 돌파구에 대한 약속을 담고 있습니다.
서론
줄기 세포 연구는 재생 의학 및 조직 공학 분야의 유망한 응용 분야로 인해 생물 의학 분야에서 번창했습니다. 인간 낙엽 및 영구치의 치수 조직에서 파생된 치과 치수줄기세포(DPSC)는 즉시 사용 가능하고 다능한 용량으로 인해 줄기세포의 공급원으로 상당한 관심을 끌고 있습니다 1,2. 이러한 세포는 지방세포, 조골세포, 연골세포를 포함한 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 이는 수많은 연구에서 확인되었습니다3.
지난 수십 년 동안 줄기 세포의 연구 및 치료 응용 분야가 급증했습니다. 줄기 세포의 무한한 잠재력은 줄기 세포를 얻는 원천을 다양화할 것을 요구합니다. 몇 가지 요인이 선택한 세포의 효율성, 생존력 및 줄기에 영향을 미칩니다. 골수 및 지방 조직과 같은 다양한 알려진 줄기 세포 저장소가 존재함에도 불구하고 이러한 출처와 관련된 침습적 절차, 현장 이환율 및 윤리적 문제로 인해 종종 탐색이 제한됩니다 4,5. 다양한 줄기세포 원료 중 치과줄기세포는 접근성이 용이하고 가소성이 높으며 다양한 응용분야로 주목받고 있다. 특히 인간 치수 줄기세포는 치료 가능성을 위해 광범위하게 연구되어 왔다6. 일반적으로 의료 폐기물로 버려지는 치아에는 중간엽 줄기세포가 풍부하게 함유되어 있다7. 이 귀중한 줄기 세포 풀을 보호하려면 환자, 치과 의사 및 의사의 집단적 노력이 필요하며, 이러한 자원이 낭비되지 않도록 하여 각 치과 치수줄기 세포를 미래의 재생 요구 사항에 사용할 수 있도록 해야 합니다.
인간 성인 치수 줄기 세포(DPSC) 및 박리된 인간 낙엽치(SHED)의 줄기 세포와 같은 치과 치수에서 유래한 줄기 세포는 치수의 혈관 주위 틈새에 있습니다. 이 세포는 두개신경능선세포(cranial neural crest cell)에서 유래한 것으로 여겨지며 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)와 신경외배엽 줄기세포(neuroectodermal stem cells) 모두에 대한 초기 마커를 나타냅니다. DPSC와 SHED는 다능성과 다양한 조직 유형을 재생할 수 있는 능력을 입증했다8.
치아 줄기 세포의 잠재적 공급원은 건강한 낙엽 치아와 영구치를 포함합니다. 줄기세포는 펄프의 전체 세포 개체군의 약 1%만을 구성하므로 효과적인 분리 및 증식 기술의 중요성이 강조되고 있습니다9. 결과적으로, 이러한 줄기 세포의 추출 및 증식은 DPSC분리 10에서 중추적인 단계입니다. 발치되거나 박리된 치아는 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 행크스 완충 식염수(HBSS)와 같은 영양이 풍부한 수송 매체에 보관해야 합니다.
치수를 얻는 것은 치아 유형 7,11에 따라 다양한 방법을 통해 얻을 수 있습니다. 뿌리가 재흡수된 낙엽 치아의 경우 뿌리 정점을 통해 발치를 수행할 수 있습니다. 유사하게, 멸균 가시 브로치는 미성숙한 열린 정점을 가진 영구치에서 치수를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 뿌리가 완전히 발달한 영구치의 경우, 치수실에 접근하려면 치근에서 치관 크라운을 분리해야 합니다. 이것은 cementoenamel 접합부에서 다이아몬드 디스크를 사용하여 치아를 절단함으로써 수행됩니다. 이 절개는 펄프 챔버를 노출시켜 펄프 조직 12,13,14를 회수할 수 있습니다.
치수 줄기 세포(DPSC)는 효소 소화(ED) 또는 조직 외식물(OG)에서 발육(자연 성장이라고도 함)을 통해 분리할 수 있습니다. ED 방법은 주로 콜라겐 분해 효소 I 및 dispase를 사용하여 조직을 단일 세포 현탁액15,16으로 분해합니다. 더 간단하고 빠른 OG 방법은 펄프 단편을 잘게 잘라 배양 플레이트에 직접 넣어 세포 조직이 조직 이식물로부터 성장할 수 있도록 하는 것을 수반한다17. 연구자들은 세포 증식 속도, 분리된 줄기 세포 특성의 보존, 분화 및 표면 마커 발현을 평가하기 위해 두 가지 기술을 모두 활용하고 비교했습니다18. 효율성이 높고 줄기가 좋은 DPSC를 획득하기 위한 프로토콜을 수립하고 표준화하면 효과적이고 안전한 치료법을 위한 길을 열 수 있습니다19. 이 프로토콜은 효소 분해, 실험실 공정, 보존 및 지방 형성, 골형성 및 연골 형성을 위한 비색 염색을 통한 세포 분화를 사용하여 DPSC를 추출하는 것을 포함합니다.
이 기사에서 설명하는 프로토콜은 치아에서 치수를 처음 분리하는 것부터 시작하여 실험실에서 DPSC의 배양 및 유지 관리, 특정 줄기 세포 마커를 사용하여 특성화하는 것으로 마무리되는 단계별 절차를 제시합니다(그림 1). 이러한 줄기 세포를 다른 세포 계통으로 유도하여 다능성을 강조하는 기술도 설명되어 있습니다.
프로토콜
여기에 설명된 프로토콜은 기관 인간 연구 윤리 위원회(IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala)의 지침을 따릅니다. 발치된 치아의 사용은 참가자의 무결성, 존엄성 및 권리를 보장하기 위해 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. 이 연구를 위해 선발된 참가자는 교정 치료를 위해 발치가 필요한 30세 미만의 건강한 개인이었습니다. 광범위한 치아우식증이나 심한 치주염이 있는 사람들은 연구에서 제외되었다. 남아 있는 치아를 발치해야 하는 어린이로부터 낙엽 치아를 수집했습니다. 이 연구에 참여한 피험자로부터도 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다.
1. 치아의 발치 및 운송
- 낙엽 치아와 영구치 수집
- 참가자에게 시술의 목적과 발치한 치아가 연구 목적으로 사용될 수 있는 가능성을 설명합니다.
- 발치할 치아 주변에 마취제를 투여하여 국소 마취하에 치아 발치를 수행합니다. 구체적으로, 이 연구를 위해 에피네프린(재료 표 참조)과 혼합된 1.75mL의 리도카인을 1:200,000 비율로 주입했습니다. 심한 치아우식증이나 치주염이 나타나지 않는 치아를 선택하는 것이 바람직하다20,21.
- 발치된 치아의 운송
알림: 오염을 방지하기 위해 무균 조건에서 작업하는 것이 좋습니다. 여기에는 장갑 및 실험실 가운과 같은 개인 보호 장비 착용과 생물학적 위험 층류 후드와 같은 멸균 환경에서 작업하는 것이 포함됩니다.- 치아를 발치한 후에는 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 용액으로 헹구어 혈액 및 기타 이물질을 제거합니다. 멸균 겸자와 메스를 사용하여 치아 표면에 부착된 연조직 잔여물을 조심스럽게 제거합니다(그림 2A).
- 70% 에탄올과 같은 소독 용액에 치아를 10초 동안 담그십시오. 소독 후 멸균 PBS로 치아를 헹구어 잔류 소독제를 씻어냅니다.
- 수송 매체가 들어있는 멸균 용기에 치아를 넣으십시오.
참고: 수송 배지는 항생제가 보충된 상업용 배양 배지인 Alpha-MEM으로 구성되었습니다: 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신( 재료 표 참조). 이 배지는 발치된 치아 내의 세포에 필수 영양소를 공급하여 실험실 공정까지 생존을 보장했습니다. 항생제는 세균의 성장을 억제하는 역할을 하였다. - 세포 대사 활동을 늦추고 세포 사멸을 지연시키기 위해 운송 중 4 °C의 온도를 유지하십시오. 치아를 검사실로 이송하여 치수줄기세포를 처리하고 분리하는 등의 다음 단계를 수행합니다.
2. 펄프 조직의 수집
- 치과 겸자를 사용하여 치아를 고정하여 시술 중에 제자리에 유지되도록 합니다. 다이아몬드 디스크를 사용하여 수냉수에 연결된 치과용 핸드피스( 재료 표 참조)에서 치아를 절단합니다(그림 2B).
알림: 목표는 내부의 펄프 조직에 불필요한 손상을 입히지 않고 펄프 챔버를 노출시키는 것입니다. - 치과 굴삭기( 재료 표 참조)를 사용하여 치수 조직을 제거합니다. 이 기기를 사용하면 손상을 입히지 않고 치수를 추출할 수 있으므로 치과용 치수줄기세포의 생존력을 보존할 수 있습니다(그림 2C).
- 얻은 조직을 유리 페트리 접시에 놓습니다. 인산염 완충 식염수로 펄프 조직을 세척하십시오.
3. 치수조직 분해 및 세포 분리
- 조직 다진 및 소화
- 멸균 수술용 칼날을 사용하여 치수 조직을 조심스럽게 작은 조각으로 다지고(그림 2D) PBS가 있는 미니 조직 그라인더에 넣어 미세하게 균질화된 혼합물을 얻습니다. 이 과정은 조직의 표면적을 증가시켜 소화 중에 보다 효율적인 효소 작용을 촉진합니다.
- 다진 균질한 조직 조각을 15mL 튜브에 옮기고 3mg/mL 콜라겐분해효소 I형 및 4mg/mL 디스파아제의 혼합물을 사용하여 효소로 분해합니다( 재료 표 참조). 이러한 효소를 원하는 농도를 얻기 위해 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)에 용해시켰습니다.
- 효소 혼합물(단계 3.1.2)에서 펄프 조직을 37°C에서 약 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 효소를 중화하고 추가 배양을 위해 원심분리(단계 3.2.1)로 세포를 수집합니다.
- 원심분리 및 재현탁
- 배양 후 분해된 조직을 15mL 원심분리 튜브에 옮기고 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 회전시켜 세포를 펠렛화합니다. 이 단계는 소화되지 않은 나머지 조직 조각 및 효소로부터 세포를 분리합니다. 상층액 배지를 조심스럽게 폐기하고 튜브 바닥의 세포 펠릿을 방해하지 않도록 합니다.
- 세포 펠릿을 새로운 배양 배지에 재현탁시킵니다. 이 배지는 분리된 세포가 생존하고 증식하는 데 필요한 영양소와 환경을 제공합니다.
4. 세포 배양
- 세포의 도금 및 배양
- 재현탁 세포를 25cm² 배양 플라스크에 조심스럽게 옮깁니다.
참고: 단일 펄프의 모든 물질은 단일 25cm2 세포 배양 플라스크로 옮겨집니다. 5-7mL의 배지 용량은 세포에 대한 충분한 적용 범위와 영양소 가용성을 보장합니다. DPSC를 위한 배양 배지는 필요한 성장 인자를 제공하기 위해 10%-20% 소 태아 혈청(FBS)( 재료 표 참조)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)인지 확인하십시오. 또한 박테리아 오염을 방지하기 위해 배지에 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충합니다. 세포가 플라스크 전체에 고르게 분포되어 균일한 성장을 촉진하도록 합니다. - 37 ° C에서 5 % CO 2 가 포함 된 분위기에서 플라스크를 배양합니다.
- 재현탁 세포를 25cm² 배양 플라스크에 조심스럽게 옮깁니다.
- 매체 변화 및 모니터링 컨플루언시
- 신선한 영양소를 제공하고 대사 폐기물을 제거하기 위해 2-3일마다 배양 배지를 교체하십시오. 이렇게 하려면 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 기존 배지를 조심스럽게 흡입하고 새 배지로 교체합니다.
- 현미경으로 세포 배양을 정기적으로 모니터링하여 세포의 성장을 추적하고 오염 징후가 있는지 확인합니다.
- 세포가 80%-90% 밀도에 도달할 때까지 이 과정을 계속하며, 이는 세포가 플라스크 표면적의 대부분을 덮지만 과도하게 붐비지 않는 지점입니다.
- 세포 트립신화(trypsinization) 및 패시징(passaging) 또는 동결(freezing)
- 세포가 80%-90% 밀도에 도달하면 배양 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하여 잔류 배지 세포와 비부착 세포를 제거합니다.
- 플라스크에 0.25% trypsin-EDTA 용액을 추가하여 플라스크 표면에서 세포를 분리합니다. 세포가 들어 올릴 때까지 37 ° C에서 2-5 분 동안 배양합니다.
- 동일한 부피의 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화한 다음 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 완전한 세포 분리를 보장합니다.
- 세포 현탁액을 300 x g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
- 세포를 새로운 배양 배지에 재현탁시키고 추가 성장을 위해 세포를 재플레이트(통로)하거나 향후 사용을 위해 동결합니다. 냉동 시 DMSO와 같은 동결 보호제가 포함된 동결 매체를 사용하여 동결 중 세포가 손상되지 않도록 보호하십시오.
5. DPSC의 특성화
- 유세포 분석
- 분리된 세포의 중간엽 줄기 세포 특성을 확인하려면 유세포 분석22,23을 수행하십시오. 처음에는 4.3단계에서 설명한 대로 세포를 trypsinize하고 수집합니다.
- 트리판 염료 배제 기법으로 세포 생존율을 측정합니다. 2번째 및 8번째 통로 동안 세포 생존도 분석기(재료 표 참조)를 사용하여 분석을 수행합니다. 3번째 및 7번째 통로 동안 유세포분석기를 통해 표현형 분석을 수행합니다.
- 배양 후 유세포 분석 완충액에서 세포를 세척하여 과도한 항체를 제거하고 유세포분석기를 사용하여 세포를 분석합니다.
참고: 유세포 분석 완충액은 인산염 완충 식염수(1x PBS), 1%-2% 소 태아 혈청(FBS) 및 0.1% 아지드화나트륨(NaN3)으로 구성됩니다. FBS 또는 BSA는 항체의 비특이적 결합을 차단하는 반면 아지드화나트륨은 방부제 역할을 합니다. 높은 비율의 세포는 중간엽 줄기세포 마커를 발현하고 조혈 마커가 부족해야 하며, 이는 DPSCs로 정체성을 확인합니다24. - DPSC를 분리하고 유세포 분석을 위해 면역형광 항체로 염색합니다.
참고: 중간엽 줄기 세포(MSC)의 유세포 분석을 위한 마커 선택은 MSC가 CD105, CD73 및 CD90을 발현해야 하며 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79a 또는 CD19 및 HLA classII 25의 발현이 부족해야 한다고 명시한 국제 세포 치료 학회(ISCT)에서 확립한 합의를 기반으로 합니다. 이러한 마커는 치수 줄기세포를 조사하는 연구에서 일반적으로 사용된다26. 염색을 위한 항체의 농도는 사용된 특정 항체에 따라 달라질 수 있으며, 항체 희석 및 배양 조건에 대한 제조업체의 지침( 재료 표 참조)을 따르는 것이 권장됩니다25. - 언급 한 바와 같이 CD 마커의 발현에 대한 분류 기준27,28을 설정하십시오 : 10 % 미만, 발현 없음; 11%에서 40% 사이, 낮은 발현; 41%에서 70%의 범위, 적당한 표현; 71% 이상, 높은 표현력.
- 또한 CD34 및 CD45에 대한 항체가 있는 별도의 세포 분취액을 배양하여 조혈 마커가 없는지 확인합니다.
6. 다계통 분화
참고: 다음 단계에서는 치아 줄기 세포의 골형성(osteogenic), 지방형성(adipogenic) 및 연골형성(chondrogenic) 분화를 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 완전한 배지(CM)가 있는 피브로넥틴 코팅된 조직 배양 플레이트에서 웰당 1 x 105 개 세포 밀도로 배양물을 파종하는 것으로 시작합니다. 원하는 분화 프로토콜을 시작하기 전에 80%-90% 밀도가 달성될 때까지 세포 성장을 모니터링합니다. DPSC의 다중 계통 분화 잠재력을 평가하려면 세포를 24웰 플레이트에 파종하고 적절한 분화 배지에서 배양하여 골아세포, 지방세포 및 연골세포에 대한 분화 과정을 시작합니다.
- 골형성 분화(Osteogenic differentiation)
- 70%-80% 합류점에 도달할 때까지 표준 조건의 일반 성장 배지에서 DPSC를 배양하여 시작합니다.
- 세포에서 성장 배지를 제거한 다음 1x PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 세포에 ODM(Osteogenic Differentiation Medium)을 추가합니다.
참고: ODM은 10% FBS, 100단위/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, 0.25μg/mL 암포테리신 B, 50μg/mL 아스코르브산, 10mM 베타-글리세로인산염 및 100nM 덱사메타손이 보충된 α-MEM( Alpha Minimum Essential Medium)으로 구성됩니다(재료 표 참조). - 5 % CO 2 로 37 ° C의 골형성 배지에서 세포를 배양합니다. 골형성 배지를 2-3일마다 교체하십시오.
참고: 14일에서 21일 후, DPSC는 조골세포와 같은 세포로 분화해야 합니다. 이는 알칼리성 포스파타아제와 같은 조골세포 특이적 마커의 발현 증가를 확인하거나 Alizarin Red S 염색과 같은 광물화된 매트릭스를 검출하기 위해 염색 기술을 사용하여 확인할 수 있습니다. - -20 °C에서 1 시간 동안 70 % 얼음처럼 차가운 에탄올로 세포를 배양하여 세포를 고정합니다.
- 40nM Alizarin Red S(pH 4.2) 염색 용액으로 고정 셀을 어두운 실온에서 10-15분 동안 염색합니다. 골형성 분화를 확인하기 위해 현미경으로 염색을 시각화합니다(그림 3). 광물화29,30을 나타내는 칼슘 침전물을 식별하는 Alizarin Red S로 세포를 염색하여 분화를 확인합니다.
- 지방형성 분화(Adipogenic differentiation)
- 이전 섹션에서 자세히 설명한 바와 같이 37°C에서 5% CO2 가 있는 가습된 분위기의 표준 조건에서 DPSC를 배양합니다. 세포가 약 70%-80% 합류점에 도달할 때 세포를 통과시킵니다.
- 배지를 흡인하고 1x PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 세척된 배지를 지방 분화 배지로 교체합니다. 이 배지는 일반적으로 DMEM, 10% FBS, 10μg/mL 인슐린, 1μM 덱사메타손, 200μM 인도메타신 및 0.5mM IBMx로 구성됩니다( 재료 표 참조).
- 3-4일마다 분화 매체를 교체하십시오. 약 3주 후 지방형성 분화 DPSC를 PBS로 세척하고 상온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다.
- Oil Red O(재료 표 참조)로 고정 세포를 염색하여 지질 방울 축적을 시각화합니다(그림 4). 지방형성 분화를 추가로 확인하기 위해 과산화소체 증식제 활성화 수용체 감마(PPARγ) 및 아디포넥틴31,32와 같은 지방형성 마커의 유전자 발현 분석을 수행합니다.
- 연골 분화(Chondrogenic differentiation)
- 37 ° C에서 5 % CO2 로 가습 된 분위기에서 유지되는 DPSC 배양은 연골 분화에 사용됩니다. 세포가 약 70%-80% 합류점에 도달할 때 세포를 통과시킵니다.
- 배지를 흡인하고 1x PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 세척된 배지를 일반적으로 고포도당 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 1% ITS, 100nM 덱사메타손, 50μg/mL 아스코르브산염-2-인산염, 40μg/mL 프롤린 및 10ng/mL 변형 성장 인자-베타 3(TGF-β3)을 포함하는 연골 분화 배지로 교체합니다( 재료 표 참조).
- 연골 분화 배지의 세포를 유지하여 2-3일마다 배지를 교체합니다. 약 3주 후, DPSC는 연골세포와 같은 세포로 분화해야 합니다.
- 실온에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로 20분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 고정 후 세포를 Alcian Blue( 재료 표 참조)로 염색하고 현미경으로 시각화하여 연골 형성 분화를 확인합니다(그림 5).
- 프로테오글리칸에 대한 Alcian Blue 염색 또는 aggrecan, SOX9 및 유형 II 콜라겐33,34와 같은 연골 마커의 유전자 발현 분석과 같은 기술을 사용하여 DPSC를 연골세포로 분화시키는 것을 확인합니다.
결과
요약된 프로토콜의 성공적인 실행으로 다중 계통 분화가 가능한 치과 치수줄기세포(DPSC)가 생성되어 다능성을 입증했습니다.
생존도 분석
DPSC의 생존 가능성은 다양한 시점에서 Trypan Blue 배제 분석을 사용하여 평가되었습니다. 그 결과 배양 기간 동안 일관되게 높은 생존율(95% 이상)을 보여 주어 당사의 분리 및 배양 프로토콜의 견고성을 입증합니다.
Colony-Forming Unit (CFU) 어세이
DPSC의 자가 갱신 능력을 평가하기 위해 CFU 분석을 수행했습니다. 단세포 현탁액을 저밀도로 도우려 14일 동안 배양하였다. 그런 다음 형성된 식민지를 염색하고 계산했습니다. 그 결과 많은 콜로니가 나타났으며, 이는 DPSC 개체군 내에서 자가 재생 세포의 비율이 높다는 것을 나타냅니다.
세포 배가시간
세포 배증 시간은 DPSC의 성장 곡선을 기반으로 계산되었습니다. 세포는 특정 밀도로 파종되고 정기적으로 계수되어 성장 곡선을 구성했습니다. 그런 다음 곡선의 지수 성장 단계를 사용하여 두 배로 늘어나는 시간을 계산했습니다. 그 결과 MSC에 대해 보고된 것과 일치하는 배가 시간을 보여주며, 이는 건강하고 증식하는 세포 집단을 시사합니다(그림 6).
유세포 분석
유세포 분석 결과 DPSC의 대다수(예: >95%)가 CD90, CD73 및 CD105에 대해 양성인 것으로 나타났으며, 이는 MSC로서의 정체성을 확인시켜 주었습니다(그림 7). 또한, 세포의 2% 미만이 CD45, CD34 및 HLA-DR에 대해 양성이었으며, 이는 유의미한 조혈 또는 내피 세포 오염이 없음을 확인했습니다.
골형성 분화(Osteogenic differentiation)
골형성 분화가 완료되면 세포는 광물화된 매트릭스를 나타냈으며, 이는 Alizarin Red S 염색으로 시각화되었습니다(그림 3). 염색된 세포에서 적색 착색이 존재한다는 것은 골형성 분화의 필수 특성인 광물화된 매트릭스의 성공적인 침착을 나타냅니다. 차별화 염색을 성공적으로 달성할 수 없는 것은 샘플 수집 절차에서 직면하는 문제와 잠재적으로 관련이 있을 수 있습니다.
지방형성 분화(Adipogenic differentiation)
지방 분화 과정에서 DPSC는 지방 형성을 나타내는 지질 방울을 축적했습니다. 지질 방울은 Oil Red O 염색으로 관찰할 수 있습니다(그림 4). 성공적인 분화로 세포 내에 주황색-빨간색으로 염색된 지질 방울이 생성되었습니다.
연골 분화(Chondrogenic differentiation)
마지막으로, 연골 형성 분화 후 DPSC는 Alcian Blue 염색으로 확인된 중요한 연골 구성 요소인 글리코사미노글리칸을 생성했으며, 이 성분은 이러한 글리코사미노글리칸에 결합합니다. 연골 형성을 성공적으로 거친 세포는 염색 시 파란색을 나타냈습니다(그림 5).
염색 절차에서 각각의 색상 변화를 나타내지 못한 세포는 분화 배지의 문제 또는 DPSC의 초기 품질 문제 때문일 수 있는 최적이 아닌 분화 때문일 수 있습니다. 배지 및 보충제의 품질과 사용된 DPSC의 건강 및 통로 수를 보장하는 것이 중요합니다. DPSC를 조골세포, 지방세포 및 연골세포로 성공적으로 분화한 것은 이러한 세포의 다능성을 입증하고 재생 의학 및 치료 응용 분야에서의 잠재력을 강조합니다.
그림 1: 치과용 치수줄기세포 분리, 특성화 및 분화 개요. 이 그림은 치과용 치수줄기세포(DPSC)를 분리, 특성화 및 분화하기 위한 워크플로우를 개략적으로 표현한 것입니다. 이 과정은 치아(또는 치아)의 발치로 시작하여 DPSC가 파생되는 치수질 조직의 분리로 이어집니다. 분리 후 DPSC는 줄기 세포 정체성을 확인하고 생존율, 증식 속도 및 기타 주요 특성을 평가하기 위해 다양한 특성 분석 테스트를 거칩니다. 이 다이어그램에 표시된 마지막 단계는 분화 유도와 관련이 있으며, 여기서 DPSC는 조골세포, 지방세포 또는 연골세포와 같은 특수 세포 유형으로의 변환을 안내하는 특정 인자로 처리됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 발치된 치아에서 치수를 채취 한 결과. (A) 치수조직 추출을 위해 준비된 발치된 치아. (B) 다이아몬드 버를 사용하여 발치한 치아의 절편. (C) 치수실에서 치수조직 제거. (D) 수술용 칼날을 사용한 치수조직의 단편화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Alizarin Red S 염색(40배)으로 입증된 치수 줄기세포(DPSC)의 골형성 분화. 밝은 적색 염색은 조골세포의 특징인 광물화된 기질의 침착을 드러내며 성공적인 골형성 분화를 확인합니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Oil Red O 염색으로 입증된 치수 줄기 세포(DPSC)의 지방 분화. 밝은 빨간색 방울의 존재는 지방 세포의 특징인 지질 축적을 나타내며 성공적인 지방 분화를 확인합니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Alcian Blue Staining(40x)으로 입증된 치수 줄기 세포(DPSC)의 연골 형성 분화. 강렬한 파란색은 연골세포의 특징인 프로테오글리칸이 풍부한 세포외 기질의 존재를 나타내며 성공적인 연골 형성 분화를 확인합니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 치수 줄기 세포(DPSC)의 세포 배증 시간. 이 그림은 시간 경과에 따른 DPSC의 성장 곡선을 보여줍니다. 세포는 처음에 특정 밀도로 파종되었으며, 증식 속도를 모니터링하기 위해 세포 수를 일정한 간격(x축으로 표시)으로 측정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: DPSC 배양에서의 줄기세포 표면 마커 발현. 이 그림은 DPSC에서 특정 표면 마커의 표현을 보여줍니다. 중간엽 줄기 세포 마커인 CD44, CD90 및 CD105는 높은 수준의 발현을 보여주며, 이는 이러한 세포에 중간엽 형질이 있음을 나타냅니다. 반대로, 조혈 마커(CD34 및 CD45)와 주요 조직적합성 복합체 클래스 II 분자(HLA-DR)의 발현은 거의 무시할 수 있는 수준으로, 배양에 조혈 계통 세포가 없음을 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
이 프로토콜은 인간의 낙엽 및 영구치에서 치수 줄기 세포(DPSC)의 분리, 배양 및 특성화를 간략하게 설명합니다. 여기에는 이들 세포의 저장 및 증식에 대한 설명뿐만 아니라 골아세포, 지방세포 및 연골세포로의 시험관 내 분화 가능성에 대한 평가가 포함된다35.
Chen et al.36은 치주염, 치근 흡수, 관상주위염 및 치아 골절과 같은 질환으로 고통받는 감염된 중요한 인간 치아, 수퍼 및 정렬되지 않은 치아를 포함하여 다양한 출처에서 치과 치수줄기세포(DPSC)를 얻을 수 있음을 보여주었습니다. 이 발견은 감염된 생명 치아를 DPSC 37,38,39,40의 잠재적 원인으로 식별하는 후속 연구에 의해 더욱 확증되었습니다. 그러나 Bernardi et al.[10]은 뿌리 흡수가 증가하면 이러한 줄기세포의 생존력에 해로운 영향을 미칠 수 있다고 지적했습니다. 이 과정에서 중요한 장애물은 세포를 보존하고 발치 또는 각질 제거 직후에 시작되는 세포의 퇴화를 방지하는 것입니다. 또한, 치근단 농양, 종양 또는 낭종과 같은 심각한 상태의 영향을 받는 치아는 줄기 세포를 추출하는 데 사용되어서는 안 된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다40,41.
DPSC는 효소 소화(ED) 기법 또는 자발적 성장 기법(spontaneous growth technique14,15)으로도 알려진 조직 이식 요법(outgrowth from tissue explants, OG) 기법을 통해 조달할 수 있습니다. 연구자들은 이러한 전략을 사용하여 세포 증식의 효율성 또는 분리된 줄기 세포의 형태학적 및 표현형 특성의 유지를 조사합니다17. 연구에 따르면 OG 방법을 통해 분리한 줄기세포는 증식 속도가 느리고 줄기세포 마커의 발현이 약하다는 것이 밝혀졌습니다18. 반대로, ED 방법을 통해 분리한 DPSC는 OG 방법으로 분리한 것보다 추가 표면 마커의 증식, 분화 및 발현 증가를 보여주었습니다. 흥미롭게도, OG 기법을 사용하여 낙엽 치아에서 추출한 치수 미성숙 줄기 세포(IDPSC)는 세포 배양이 IDPSC의 선택적 증식을 촉진하여 조기 분화를 방지한다는 것을 보여주었다42.
DPSC의 정제는 재생성이 높은 세포를 얻는 데 매우 중요하며 특정 세포 마커가 필요합니다. 세포 선택은 형광 또는 자기 활성화 세포 분류 방법을 사용하여 수행됩니다. 앞서 언급한 마커 외에도, DSC의 이질적인 특성으로 인해 수많은 다른 표면 항원이 사용됩니다(43). 그러나 하위 모집단을 분리하는 단일 마커는 확인되지 않았습니다.
골수에서 유래한 중간엽 줄기세포와 비교하여, DPSC는 다계통 잠재력으로 인해 다능 세포의 유망한 공급원으로 인식되어 왔다44. 이러한 줄기는 소스 조직의 상대적 미성숙의 결과일 가능성이 높은데, 종종 DPSCs 발치의 원인인 사랑니는 가장 마지막에 발달하는 영구치이므로 골수보다 덜 성숙하기 때문에 45. 이 프로토콜은 치수 줄기 세포가 지방 형성, 골 형성 및 연골 형성을 겪도록 유도함으로써 이러한 세포의 다능성 특성을 성공적으로 탐구합니다. 특히, DPSC는 골형성 조건에서 배양할 때 DSPP 발현을 상향 조절하는 유일한 세포 유형이며, 이는 향후 오돈토아세포로 분화될 것임을 나타냅니다46.
다양한 출처에서 분리된 치과 줄기세포는 많은 증식 및 분화 잠재력을 보여줍니다47. 체외 시스템에서 이루어진 중요한 발전은 줄기 세포 생물학 및 치료법에 깊은 영향을 미쳤습니다. 이러한 발전에도 불구하고 줄기 세포 치료법을 벤치에서 병상으로 전환하는 데 있어 과제는 여전히 남아 있습니다. 보존 기술이 줄기 세포의 생존력을 손상시키지 않도록 줄기 세포의 생존과 안정성에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 치과 줄기 세포 연구는 동물 모델에서 유망한 결과를 낳았지만, 이러한 결과를 인간 시험으로 확장해야 할 필요성이 시급합니다. 엄격한 연구 개발을 지속적으로 추진함으로써 치과 줄기 세포는 줄기 세포 은행 분야를 발전시키는 데 상당한 역할을 할 준비가 되어 있습니다.
치수 줄기세포(DPSC)를 분리하기 위한 효소 소화 접근법은 널리 사용되지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 무엇보다도, 이 과정은 콜라겐분해효소 및 디스파아제와 같은 효소가 실수로 세포막을 손상시켜 더 적은 수의 살아있는 줄기세포를 생산할 수 있기 때문에 세포 생존력을 손상시킬 수 있습니다17. 게다가, 이 방법은 종종 줄기세포의 고유한 특성을 보존하는데 결정적인 역할을 하는 중요한 세포외기질(ECM)의 저하를 초래한다(48). 이 절차는 또한 세포 표면 마커를 변경하여 DPSC(43)의 정확한 식별 및 특성화를 방해할 수 있습니다. 이러한 생물학적 제약 외에도 이 접근 방식은 시간이 많이 걸리고 37°C에서 장기간 배양으로 인한 미생물 오염의 위험을 높입니다. 더욱이, 효소 배치 간의 불일치는 다양한 결과로 이어질 수 있으며, 이는 분리 절차의 재현성에 도전이 될 수 있습니다. 조직 소화에 적합한 고급 효소는 비싸기 때문에 재정적 부담을 간과할 수 없다49. 또한, 소화의 여파로 세포 배양에 해로운 영향을 미칠 수 있는 잔류 효소 활성이 나타날 수 있으며, 이는 세포 배양의 건강, 증식 및 분화에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, 효소 분해가 특정 DPSC 하위 집단을 다른 집단보다 우선적으로 분리할 수 있는 가능성은 결과적으로 생성된 세포 풀을 실수로 왜곡하여 치료 잠재력에 영향을 미칠 수 있습니다50.
공개 사항
저자는 밝힐 것이 없습니다.
감사의 글
저자들은 티루발라(Thiruvalla)에 있는 푸쉬파기리 연구 센터(Pushpagiri Research Centre)의 소장 겸 책임자인 매튜 마자반체릴(Mathew Mazhavancheril) 박사에게 연구 센터의 절차를 문서화하는 데 도움을 준 것에 대해 감사를 표합니다.
재료
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| 알칼리성 인산가수분해효소 -염색 키트 | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | ||
| Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | Gibco | |
| 알파 최소 필수 배지(α-MEM) | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | Gibco | |
| Alpha-MEM 또는 Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | Gibco | |
| Alpha-MEM 또는 Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | Gibco | |
| Antibiotic/Antimycotic | Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA | P4333 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA | 012-04802 | |
| 베타-글리세로인산염 | Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA | G9422-10G | |
| 생물 안전 캐비닛 층류 후드 | Labconco Corporation, MO 64132-2696, 미국 | ||
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| 세포 여과기 (70 µ m ) | 하이미디어 연구소 Ltd.뭄바이, 인도 | TCP025 | 세포 여과기 |
| 원심분리기 | REMI Elektrotechnik Limited (REMI) | ||
| 원심분리기 | HiMedia Laboratories Ltd.뭄바이, 인도 | 1101 | 1102 | |
| CO2 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | ||
| 콜라겐분해효소 유형 I | Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, 미국 | ||
| 콜라겐분해효소 유형 I | Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, 미국 | ||
| Complete Growth Medium | HiMedia Laboratories Ltd.Mumbai, India | AT006 | DMEM |
| Conical tubes (15 or 50 ) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 546021P/546041P | 15 mL 및 50 mL |
| Cryo 냉동 용기 | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | 15-350-50 | |
| Cryolabels | 라벨 인도: | ||
| Cryovial storage boxes | Cryostore 보관 상자 | ||
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | ||
| Cryovials (1.8 mL) | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | PW1282 | 자체 설치 |
| 문화 플라스크 (25 cm²) | Corning Inc.NY 14831, 미국 | ||
| 배양 플라스크 | HiMedia Laboratories Ltd.뭄바이, 인도 | TCG4/TCG6 | T25/T75 |
| 배양 플레이트 | HiMedia Laboratories Ltd.뭄바이, 인도 | TCP129/TCP008 | 60 mm/100 mm |
| 치과 다이아몬드 디스크 | Komet SC 29730, 미국 | Komet | |
| 치과 숟가락 굴삭기 | Brasseler, GA 31419, 미국 | 5023591U0 | |
| 덱사메타손 | 시그마-알드리치 주식회사 세인트루이스, MO 63103.USA | D4902-25MG | |
| 덱사메토손 | 시그마-알드리치 주식회사 세인트루이스, MO 63103.USA | D4902-25MG | |
| 덱사메토손 | 시그마-알드리치 주식회사 세인트루이스, MO 63103.USA | D4902-25MG | |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA | TC185 | |
| Dispase | Roche Diagnostics, 만하임, 독일. | ||
| Dispase | Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | ||
| Dulbecco의 수정된 독수리 매체 (DMEM) | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | ||
| 에탄올 (70%) | HiMedia Laboratories Ltd.뭄바이, 인도 | MB106 | |
| 에탄올 -70% | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | Fisher Scientific | |
| 추출 펜치 | Dentsply Sirona, 미국 | ||
| 태아 소 세럼 (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA | F2442-500ML | |
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| 태아 소 세럼 (FBS) | HiMedia Laboratories Ltd.뭄바이, 인도 | RM9954 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA | F2442-500ML | |
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| 피브로넥틴 코팅 조직 배양 플레이트 | Corning Inc.Corning, NY 14831, USA | ||
| 유세포 분석기 | BD Biosciences, CA 95131, USA | ||
| 플로우 사이토메트리 버퍼 | BD Biosciences,CA 95131,USA | ||
| 유리 커버 슬립 22 x 22 mm | HiMedia Laboratories Ltd.뭄바이, 인도 | TCP017 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland | ||
| 고속 치과 핸드피스 | NSK Ltd,Tokyo 8216, Japan | Ti-Max Z series | |
| Horse Serum | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | ||
| IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA | ||
| Indomethacin | Pfizer Inc. NY 10017,USA | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | I5523 | |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS) | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | I5523 | |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS) 프리믹스 | Corning Incorporated,MA 01876,USA | ||
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| 이소프로판올(60%) | Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA | I9516 | |
| 이소프로필 알코올 | Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA | MB063 | |
| 층류 후드 | Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA | ||
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| 액체 질소 | 공기 액체,75007 파리,프랑스 | ||
| 액체 질소 저장 탱크 | Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd. | ||
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| 미니 티슈 그라인더 | Bio-Rad Lab, Inc. CA 94547, USA | ReadyPrep 미니 그라인더 | |
| 마이너스 80 냉동고 | Blue Star Limited | ||
| Neubauer 계수 챔버 | Marienfeld Superior, arktheidenfeld, 독일 | ||
| 오일 레드 O 염색 | Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA | 1024190250 | |
| 골형성 분화 매체(ODM) | STEMCELL Technologies Inc.밴쿠버, BC, V5Z 1B3, 캐나다 | ||
| 파라포름알데히드(PFA) | Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA | TCL119 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, USA | ||
| Ca++ 및 Mg++HiMedia Laboratories가 없는 인산염 완충 용액(PBS); | Ltd.인도 뭄바이 | TS1101 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Thermo Fisher Scientific | Gibco | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | Gibco | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | ||
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | P3813-1PAK | 1x PBS, pH 7.4 |
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