Method Article

탈세포화된 폐 세포외 기질 하이드로겔의 개발 및 특성 분석

DOI:

10.3791/65768

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December 8th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Engineered Cancer and Organ Models Laboratory, Koç University, 2Research Center for Translational Medicine (KUTTAM), Koç University, 3Department of Chemical and Biological Engineering, School of Engineering, Koç University, 4Department of Medical Biology, School of Medicine, Koç University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 토착 소 폐 조직에 적용되는 두 가지 뚜렷한 탈세포화 방법론을 설명하여 각각의 특성화에 대한 포괄적인 설명을 제공합니다.

Abstract

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조직 공학에서 세포외 기질(ECM) 유래 하이드로겔의 사용은 체외에서 세포의 자연 환경을 모방할 수 있기 때문에 점점 더 대중화되고 있습니다. 그러나 ECM의 기본 생화학적 함량을 유지하고, 기계적 안정성을 달성하고, 탈셀룰러화 공정이 ECM 하이드로겔의 기계적 특성에 미치는 영향을 이해하는 것은 어려운 일입니다. 여기에서는 두 가지 프로토콜을 사용한 소 폐 조직의 탈세포화를 위한 파이프라인, 탈세포화 효과의 다운스트림 특성 분석, 재구성된 탈세포화된 폐 ECM 하이드로겔의 제조 및 기계적 및 세포 적합성 특성 평가에 대해 설명했습니다. 소 폐의 탈세포화는 물리적(동결-해동 주기) 또는 화학적(세제 기반) 방법을 사용하여 수행되었습니다. 주요 ECM 성분의 탈세포화 및 머무름을 검증하기 위해 Hematoxylin 및 Eosin 염색을 수행했습니다. 탈세포화된 샘플 내의 잔류 콜라겐 및 황산염 글리코사미노글리칸(sGAG) 함량을 평가하기 위해 각각 Sirius red 및 Alcian blue 염색 기법을 사용했습니다. 탈세포화된 폐 ECM 하이드로겔의 기계적 특성은 진동 유변학에 의해 특성화되었습니다. 그 결과, 탈세포화된 소 폐 하이드로겔은 대부분의 천연 ECM 성분을 유지함으로써 상용 ECM 제품에 대한 신뢰할 수 있는 유기형 대안을 제공할 수 있음을 시사합니다. 또한, 이러한 발견은 선택한 탈세포화 방법이 겔화 역학뿐만 아니라 생성된 하이드로겔의 강성 및 점탄성 특성에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.

Introduction

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기존의 단층 배양 조건은 천연 조직 미세환경을 충실하게 표현하지 못하며, 세포-매트릭스 및 세포-세포 상호작용을 가능하게 하는 교육적 리간드가 있는 3차원(3D) 스캐폴드를 제공할 수 있는 능력이 부족하다1. 세포외 기질(ECM) 조성 및 기계적 특성은 조직 특이적이고 시간 의존적이며 병리학적 조건에서 변화를 겪습니다. 따라서 이러한 특성의 조정 가능성, 세포 행동의 조절 및 원하는 조직 기능 달성을 허용하는 생체 모방 3D 조직 모델이 필요합니다. 네이티브 ECM 유래 생체 재료는 조직 특이적 ECM 1,2,3,4,5를 직접 사용할 수 있는 능력으로 조직 공학에서 많은 관심을 끌고 있습니다. ECM 기반 캐리어는 조직 재생에서 질병 모델 개발에 이르기까지 많은 응용 분야에서 사용되었습니다. 이들은 주사 또는 이식 가능한 생체 재료 스캐폴드(4,5), 약물 ....

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Protocol

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어린(1-2세) 소 기증자로부터 신선한 토종 폐를 지역 도축장에서 얻어 얼음 위에 밀봉된 플라스틱 용기에 담아 실험실로 운송했습니다. 동물 희생은 일반적인 육류 소비(폐는 폐기물로 버려짐)를 위해 수행되며 연구와 관련이 없거나 연구로 인한 것이 아닙니다. 우리는 도축장이 동물 희생에 관한 국가 법률 및 규정을 준수함을 확인합니다. 또한, 폐기물만 사용했으며, 연구 프로젝트는 희생된 동물의 수에 영향을 미치지 않았음을 확인합니다.

1. 장기 및 조직 적출 준비

  1. 갓 얻은 소의 폐 조직은 실험이 끝날 때까지 -80°C에서 보관합니다.
  2. 실험 당일에는 얼어붙은 폐 조직이 실온에서 해동될 때까지 기다립니다.
  3. 멸균 메스와 가위로 조직을 해부하여 기관과 연골기도를 제거하고 작은 조각으로 더 잘게 썬다.
  4. 2% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 3배 이상 함유한 초순수로 철저히 씻으십시오.

2. 조직의 탈세포화

참고: 천연 소의 폐 조직은 두 가지 별개의 프로토콜을 사용하여 탈세포화되었습니다.

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Results

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탈셀룰라화(Decellularization)
본래 폐 미세환경을 재현하는 dECM 하이드로겔을 생산하기 위한 소 폐 조직의 탈세포화는 물리적(동결-해동) 및 화학적(Triton-X-100) 방법 모두에 의해 달성되었습니다. 해부 후, 조직 조각을dH2O 함유 항생제로 세척하여 나중에 dECM 하이드로겔의 무균성에 영향을 미칠 수 있는 병원균을 제거하였다. 세포 구조를 파괴하기 위해 동결-해동 방법에 액체 질소에서 37°C 수조를 번갈아 가며 총 5회 사이클을 적용했습니다. 두 번째 탈세포화 방법에서는 천연 폐 조직 조각을 1% Triton-X-100 용액으로 3일 동안 일정한 교반 하에 처리했습니다. 두 방법 모두 폐 조직을 작은 조각으로 자르는 것이 핵 내용물의 물리적 파괴뿐만 아니라 핵심 영역으로의 용액 확산을 허용하는 데 중요합니다. 탈세포화의 첫 번째 시각적 지표로서 조직의 분홍색은 두 가지 방법 모두에서 반복된 주기로 희끄무레한 색으로 변했습니다. 이 프로토콜에서 .......

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Discussion

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장기 유래 하이드로겔은 자연 조직 ECM을 재현하고 기관형 세포 기능을 모방하는 유망한 모델이 되었습니다. 탈세포화된 폐 ECM은 조직 공학에 자주 사용되어 왔지만, 생체 재료 조성 및 기계적 특성의 철저한 특성 분석은 항상성 또는 질병 중 생물학적 과정을 모델링하기 위해 세포-ECM 상호 작용이 어떻게 조절될 수 있는지 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다. 특히, 강성 및 점탄성과 같은 재구성 하이드로겔의 기계적 특성에 대한 평가 및 제어는 여러 세포 현상을 조절하는 데 있어 매우 중요합니다. 따라서 생화학적 함량 및 기계적 측면 측면에서 dECM 하이드로겔을 생산하기 위한 다양한 탈세포화 방법을 비교하고 평가하는 것이 중요합니다20,23. 여기에서 소의 폐 탈세포화는 주로 DNA 함량의 기계적 파괴 및 제거를 기반으로 하는 동결-해동 주기와 일반 세제인 Triton-X-100을 사용한 핵 함량의 화학적 제거라는 두 가지 뚜.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자는 재정적 이익 경쟁이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 연구는 터키 과학 기술 연구 위원회(TÜBİTAK)(보조금 번호 118C238)의 자금 지원을 받았습니다. 출판물/논문에 대한 모든 책임은 출판물의 소유자에게 있습니다. TÜBİTAK으로부터 받은 재정적 지원은 출판물의 내용이 TÜBİTAK에 의해 과학적 의미로 승인되었음을 의미하지 않습니다. 저자들은 Koç University Research Center for Translational Medicine (KUTTAM)의 서비스 및 시설 사용에 대해 감사의 뜻을 표합니다. 그림 1과 그림 2a는 Biorender.com 를 사용하여 작성되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
절대 에탄올ISOLAB64-17-5
아세트산ISOLAB64-19-7
Alcian 청색 용액Sigma-AldrichB8438
소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease ISigma-AldrichDN25
Discovery HR-2 레오미터TA Instruments
Entellan 장착 매체Merck107960
Eosin 용액Bright-slide2.BS01-105-1000
포름 알데히드전자 현미경 과학50-980-485
염산Merck100317
요오드Sigma-Aldrich3002
염화 마그네슘Sigma-Aldrich7786-30-3
Mayer의 헤마톡실린 염색 용액Merck2.BS01-103-1000
O.C.T 화합물Tissue-Tek4583
페니실린/스트렙토마이신BiowestL0018-100
돼지 위 점막의 펩신Sigma-AldrichP6887
피크르산Polysciences88-89-1
Sirius RedPolysciences09400-25
수산화나트륨시그마-알드리치S5881
설탕 시그마-알드리치S0389
트리톤-X-100머크112298

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhu, X., et al. Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening. Mater Today Bio. 15, 100274(2022).
  2. Ulldemolins, A., et al. Lung extracellular matri....

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Decellularized Lung MatrixECM HydrogelsTissue EngineeringLung DecellularizationFreeze Thaw MethodDetergent Based DecellularizationOscillatory RheologyMechanical PropertiesViscoelastic PropertiesDisease Modeling

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