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방법 논문

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 연구를 위한 대사 불활성화 박테리아 방법론

3.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65775

⸱

2023년 7월 28일

 ,  ,  ,  , 
1Molecular and Integrative Physiology Department, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

실험실에서 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )의 먹이 공급원은 살아있는 대장균입니다. 박테리아는 대사적으로 활동적이기 때문에 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 대사 및 약물 연구에서 혼란스러운 변수를 제시합니다.파라포름알데히드를 사용하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 자세한 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.

초록

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 유전학, 발달, 노화, 신진대사 및 행동 연구를 위한 일반적인 모델 유기체입니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 살아있는 박테리아를 섭취하기 때문에 먹이 공급원의 대사 활동은 벌레에 대한 다양한 개입의 직접적인 효과를 찾는 실험을 혼란스럽게 할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구자들은 박테리아 대사의 교란 효과를 피하기 위해 자외선(UV) 조사, 열 사멸 및 항생제를 포함하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 여러 가지 방법을 사용했습니다. UV 처리는 상대적으로 처리량이 낮고 각 플레이트가 성공적인 박테리아 사멸을 검사해야 하기 때문에 액체 배양에 사용할 수 없습니다. 두 번째 치료 방법인 열 살해는 박테리아의 질감과 영양 품질에 부정적인 영향을 미쳐 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 발달 정지를 초래합니다. 마지막으로, 항생제 치료는 박테리아 성장을 막는 것 외에도 예쁜꼬마선충의 생리학을 직접적으로 변화시킬 수 있습니다. 이 원고는 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 대체 방법을 설명합니다. PFA 처리는 박테리아 세포 내에서 단백질을 가교하여 세포 구조와 영양 성분을 보존하면서 대사 활동을 방지합니다. 이 방법은 처리량이 많으며 PFA 처리된 박테리아의 한 플레이트의 성장을 테스트하여 전체 배치를 검증하기 때문에 액체 배양 또는 고체 플레이트에서 사용할 수 있습니다. PFA 처리를 통한 대사 불활성화는 예쁜꼬마선충의 약물 또는 대사 산물 보충, 스트레스 저항성, 대사체학 및 행동에 대한 연구에서 박테리아 대사의 교란 효과를 제거하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 1965년에 모델 생물체로 처음제안되었으며1 이후 유전학, 발달, 행동, 노화 및 신진대사 연구에 널리 채택되었다2. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 큰 무리 크기와 투명한 표피 때문에 형광 리포터를 이용한 고처리량 스크리닝에 특히 적합하다3. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 짧은 생애주기, 자웅동체 번식, 인간과의 유전적 상동성(genetic homology)은 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 발달 연구(development biology)4 및 노화 생물학(aging biology)5 연구에 유용한 모델 시스템으로 만든다. 더욱이, 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 비교적 관리하기가 쉽습니다. 웜은 액체 배양 또는 고체 한천 플레이트에서 자랄 수 있으며 살아있는 대장균 OP50 박테리아를 섭취할 수 있다4.

그러나 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 살아있는 먹이 공급원은 신진대사, 약물 보충제 및 행동에 대한 연구를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 살아있는 박테리아는 자체 신진대사를 가지고 있기 때문에 박테리아에 영향을 미치는 실험 조건은 벌레가 사용할 수 있는 영양분과 대사 산물도 변화시킵니다. 예를 들어, 박테리아의 철분, 아미노산, 엽산 농도의 차이는 예쁜꼬마선충의 발달, 생리, 수명에 다양한 영향을 미친다6. 많은 일반적인 실험실 관행은 OP50에 의해 생성되는 영양소 조성 및 대사 산물의 변화를 유도할 수 있습니다. 특히, 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 번식을 막기 위해 일반적으로 사용되는 화합물인 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(FUdR)에 노출되면 아미노산 생합성 경로를 포함한 OP50 유전자 발현의 광범위한 변화를 유도한다7. 살아있는 박테리아는 또한 박테리아가 활성 화합물을 부분적으로 또는 완전히 대사할 수 있기 때문에 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 작은 분자를 보충하는 연구를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 더욱이, 박테리아에 대한 이러한 작은 분자의 영향은 수명 연장 약물인 메트포르민8로 보고된 바와 같이 예쁜꼬마선충의 생리학을 변화시킬 수 있습니다. 마지막으로, 살아있는 박테리아는 매력적인 냄새 물질9을 분비하고, 외인성 신경 조절제(exogenous neuromodulators)10를 생성하며, 밀집된 박테리아 잔디밭(11)에서 산소 구배를 생성하는 것과 같은 행동을 변화시키는 방식으로 벌레의 환경을 변화시킬 수 있다.

예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구에 대한 박테리아 대사의 교란 효과를 완화하기 위해 박테리아를 죽이는 여러 가지 방법이 개발되었습니다(표 1). OP50을 죽이는 세 가지 일반적인 전략은 자외선 조사, 열 살해 및 항생제 처리입니다. 간단하고 비교적 비용이 저렴하지만 이러한 각 방법은 박테리아와 예쁜꼬마선충 모두에게 바람직하지 않은 영향을 미칠 수 있습니다. UV 가교제(12)를 통한 UV-사멸은 낮은 처리량이며, 그 속도는 UV 가교제에 들어갈 수 있는 플레이트의 수에 의해 제한된다. 또한 UV 사멸의 효능은 배치 내에서 플레이트마다 다를 수 있으며 대규모 실험에서는 모든 플레이트의 성장을 테스트하는 것이 어려울 수 있습니다. 배양액을 >60°C의 온도에 노출시켜 OP50을 열 사멸시키는 데는 별도의 문제가 있습니다. 고열은 지렁이에게 필수적인 영양소를 손상시키고 박테리아의 세포 구조를 파괴하여 지렁이가 음식에 소비하는 시간을 줄이는 부드러운 질감을 만들 수 있습니다13. 이 방법은 또한 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 생애 주기 동안 사용할 수 없는데, 그 이유는 열로 죽은 박테리아를 먹인 벌레가 발달 초기에 체포될 수 있기 때문이다13. 항생제 치료는 세균 대사를 억제하는 세 번째 일반적인 방법이지만14 항생제는 기생충의 성장과 신진대사를 변화시킬 수도 있다15.

박테리아 구조와 필수 영양소를 보존하면서 살아있는 박테리아의 대사 효과를 제거하는 한 가지 솔루션은 파라포름알데히드(PFA)로 OP50을 죽이는 것입니다.16 PFA는 포름알데히드의 중합체로서 세포(17) 내의 단백질을 가교시켜 내부 원형질막(18)과 같은 내부 세포 구조를 파괴하지 않고 박테리아 복제를 방지할 수 있다. 이러한 내부 세포 구조의 보존으로 인해, PFA 처리된 박테리아는 성장이나 대사 활동을 나타내지 않지만, 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 식용 및 영양이 풍부한 식품 공급원으로 남아 있다 16. 여기에서는 파라포름알데히드를 사용하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 방법을 보여주는 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

메서드필수 자료확장성?영양?웜에 미치는 영향?
자외선UV 가교제제한:예NGM12, 23, 24의 수명에 대한 다양한 영향
UV 가교제에 맞는 플레이트 수FUdR24, 26, 27의 수명에 대한 다양한 영향
플레이트당 조사 시간음식 선호도 감소16
모든 접시의 성장을 확인하는 능력8
열>60 °C 인큐베이터예아니오 : 세포벽을 파괴하고 영양가를 감소시킵니다.발달 정지 13
음식 선호도 감소13
NGM31의 수명 연장
항생제항생제(카나마이신, 카베니실린 등)예예성장과 발전 지연15
액체 매질의 수명 연장19
NGM15의 수명 연장
PFA (PFA)0.5% 파라포름알데히드예예작은 무리 크기 감소16
작은 개발 시간 증가16
음식 선호도 감소16

표 1. OP50을 죽이는 방법 비교. 자외선 사멸, 열 사멸, 항생제 처리 및 PFA 처리는 박테리아의 영양 상태와 처리된 박테리아를 먹인 벌레의 건강에 다양한 영향을 미칩니다. 대장균 을 복제적으로 비활성화하는 이러한 방법은 필요한 재료와 확장성도 다릅니다.

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프로토콜

1. 세균 접종

  1. 증류수 950mL에 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨(NaCl) 10g을 녹여 루리아 육수(LB)를 준비합니다.
  2. 7.0M 수산화나트륨(NaOH)을 추가하여 LB의 pH를 5로 조정합니다. 이를 위해서는 약 0.2mL의 NaOH만 필요합니다.
  3. 15psi에서 45분 동안 액체 사이클에서 pH 조정 LB 배지를 고압멸균합니다. 용액을 식히고 실온에서 보관하십시오.
  4. 500mL 삼각 플라스크에 100mL의 LB에 있는 단일 박테리아 군집을 접종합니다. 37°C Shaker 인큐베이터에서 밤새 박테리아를 배양합니다.
  5. 박테리아 군집의 상태, 플라스크의 크기 및 Shaker가 설정된 속도에 따라 박테리아가 성장하는 데 걸리는 시간이 다를 수 있습니다. ~14시간 후 600nm(OD600)에서 박테리아의 광학 밀도(OD)를 확인합니다.
  6. OD600 이 3.0(1 x 109 콜로니 형성 단위(CFU)/mL)일 때 Shaker에서 박테리아를 제거합니다. OD600 이 3.0 미만이면 원하는 OD에 도달할 때까지 플라스크를 Shaker 인큐베이터로 되돌립니다.
  7. 박테리아를 50mL 코니컬 튜브에 분취하여 4°C에서 보관하거나 다음 단계로 진행합니다.

2. 파라포름알데히드 작업

알림: 사용된 파라포름알데히드(PFA)의 농도와 노출 기간은 기후, 위치 및 처리되는 박테리아의 유형에 따라 다소 다를 수 있습니다. OP50의 좋은 출발점은 1시간 동안 0.5% PFA에 노출되는 반면 HT115의 경우 1시간 동안 0.25% PFA에 노출되는 것으로 충분할 수 있습니다.

  1. 32% PFA 스톡을 준비하거나 시중에서 판매되는 32% PFA 용액을 사용하십시오. PFA로 작업할 때는 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오. 장갑과 보안경을 착용하십시오.
  2. 적절한 환기가 가능한 화학 흄 후드 내부에 PFA를 추가하십시오. 세척제와 팁이 포함된 PFA는 흄 후드의 적절한 화학적 위험 용기에 폐기하십시오.

3. 파라포름알데히드를 이용한 세균 처리

  1. 박테리아가 OD600 3.0에 도달하면 혈청학적 피펫을 사용하여 50mL를 새 250mL 삼각 플라스크에 옮깁니다. 나머지는 라이브 대조군, 모의 처리된 대조군(4단계 참조) 또는 필요에 따라 PFA로 처리하기 위해 저장합니다.
  2. 한 플라스크에서 다른 플라스크로 붓는 것을 피하고 새 플라스크의 측면에 박테리아가 튀지 않도록 주의하십시오. 플라스크 측면의 콜로니는 더 낮은 용량의 PFA를 받을 수 있습니다.
  3. 화학 후드에서 781μL의 32% PFA를 50mL 박테리아에 추가하여 최종 농도를 0.5%로 만듭니다. 고형 폐화학 물질 위험 용기에 사용한 팁을 폐기하십시오.
  4. 플라스크를 호일로 덮고 37°C Shaker 인큐베이터로 돌아가 1시간 동안 기다립니다. 1시간 후 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 5단계로 진행합니다.

4. 모의 처리된 대조군

  1. 박테리아가 OD600 3.0에 도달하면 혈청학적 피펫을 사용하여 박테리아 50mL를 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
  2. 5.3단계로 진행하여 PFA 처리군과 유사한 세척 단계를 완료합니다.

5. 잔류 PFA를 제거하기 위해 박테리아 세척

  1. 케미컬 후드에서 혈청학적 피펫을 사용하여 처리된 박테리아를 삼각 플라스크에서 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 박테리아를 붓는 대신 혈청학적 피펫을 사용하면 PFA로 직접 처리하지 않았을 수 있는 플라스크 가장자리의 박테리아 군집으로부터 오염을 방지할 수 있습니다.
  2. 원심분리기는 박테리아를 약 3000 x g 에서 20분 동안 처리했습니다. 화학 후드의 액체 폐 화학 위험 용기에 넣어 상층액을 제거하십시오.
  3. 25mL의 LB와 와류를 추가하여 박테리아 펠릿을 재현탁시킵니다(튜브를 완전히 채우면 펠릿을 재현탁하기가 더 어려워짐). 원심분리 및 펠릿 재현탁을 4회 반복합니다.
  4. 다양한 분석에 최적화된 부피로 펠릿을 재현탁합니다. 수명 분석의 경우 200μL의 박테리아가 있는 60mm 플레이트를 10mL LB에 재현탁하고 박테리아를 10mL LB에 재현탁하면 원래 50mL 배양액에서 5배 농도가 됩니다.
  5. 박테리아를 4 °C에서 보관하십시오.

6. 세균 성장의 품질 검사

  1. 최종 세척 및 재현탁 후 준비된 박테리아로 LB 플레이트(멸균 피펫 팁 사용)에 줄무늬를 만듭니다. 세척 및 재현탁에 사용된 LB를 별도의 접시에 줄무늬를 표시하여 사용된 LB가 오염되지 않았는지 확인하는 것이 좋습니다.
  2. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 밤새 넣습니다. 성장이 있는지 확인합니다. 박테리아는 LB 플레이트에서 콜로니가 자라지 않을 때 복제적으로 죽은 것으로 간주됩니다.

7. 호흡계를 이용한 세균 대사 품질 검사

  1. 5.4단계에서 최종 세척 및 재현탁 후 호흡계19,20과 같은 사용 가능한 도구를 사용하고 기초 산소 소비율(OCR)을 측정하여 박테리아가 대사적으로 죽었는지 확인합니다.
  2. M9 용액 제조 : 인산 칼륨 일 염기성 (KH 2 PO 4) 3g,인산 나트륨 (Na2HPO4) 6g, 염화나트륨 (NaCl) 5g을 증류수 950mL에 녹입니다. 15psi에서 45분 동안 액체 사이클에서 오토클레이브한 다음 용액을 실온으로 냉각시킵니다. 1M 황산마그네슘(MgSO4) 1mL를 넣고 실온에서 보관합니다.
  3. 호흡계 카트리지 수화: 200웰 플레이트의 모든 웰에 96μL의 교정제를 추가합니다. 카트리지를 96웰 플레이트에 넣고 37°C 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
  4. 분석 보정: 다음 날 수화 카트리지를 기계에 넣고 보정을 시작합니다.
  5. 분석 테스트 플레이트 설정: 새로운 96웰 플레이트를 사용하여 160μL의 M9 및 40μL의 전처리된 박테리아(1 x 109 CFU/mL)를 추가하여 웰을 테스트합니다. 200μL의 M9를 4개의 코너 웰에 추가하여 블랭크 웰로 사용합니다. 세척 및 재현탁에 사용되는 160μL의 M9 및 40μL의 LB를 추가하여 음성 대조군으로 사용합니다. 사용하지 않을 나머지 웰에 200μL의 M9를 추가합니다.
  6. 분석 실행: 카트리지 보정이 완료되면 분석을 위해 7.5단계의 분석 플레이트를 기계에 삽입합니다. 설정에는 혼합, 대기, 측정 및 반복 단계가 포함됩니다. 결과는 산소 소비율(OCR)로 표시됩니다. 박테리아는 신진대사적으로 죽었고 OCR이 0일 때 사용할 준비가 되었습니다.

figure-protocol-1
그림 1. 파라포름알데히드 처리를 위한 워크플로우. 대장균 OP50 박테리아의 단일 군집이 하룻밤 사이에 자랍니다. PFA를 최종 농도 0.5%에 첨가하고 PFA 처리된 배양액을 37°C에서 1시간 동안 진탕합니다. 마지막으로, PFA는 신선한 LB 5x로 배양물을 세척하여 제거합니다. 처리된 박테리아가 복제적으로 비활성화되어 있는지 확인하려면 처리된 박테리아의 LB 플레이트를 줄무늬 제거하고 밤새 성장합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

프로토콜의 자세한 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 파라포름알데히드16을 사용한 예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구에서 대사 및 약물 연구를 위해 박테리아 복제(그림 2A) 및 대사(그림 2B)를 일관되게 비활성화하기 위해 고처리량 분석법이 개발되고 최적화되었습니다. 목표는 웜의 다양한 건강 측정에 영향을 미치지 않고 박테리아를 지속적으로 죽이는 데 필요한 PFA의 최저 농도와 가장 짧은 시간을 결정하는 것이었습니다. 이러한 값은 실험실 환경에 따라 위치마다 다를 수 있으며 박테리아 균주마다 다를 수 있습니다. 예를 들어, HB101 박테리아를 1시간 동안 0.25%에 노출시키면 대사를 비활성화하기에 충분하며(그림 2C), 엔테로코커스 패칼리스(EF)는 일관된 효과를 위해 1.0%의 PFA...

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토론

다른 박테리아 살상 방법과 비교되는 PFA 살상의 이점
PFA 처리는 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 영양가 있는 식품 공급원을 유지하면서 박테리아 대사를 방지하는 고처리량 방법입니다. PFA 처리를 통해 박테리아를 죽이는 것은 다른 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 성공적인 사멸을 위해 모든 플레이트를 테스트해야 하는 UV 처리와 달리, PFA 처리된 박테리아 배치의 단일 플레이트를 테스트하여 배치16을 검증할 수 있습니다. PFA 처리는 박테리아 대사를 제거하는 데에도 매우 효과적이며(그림 2B), PFA 처리된 박테리아는 항생제 처리된 박테리아에 비해 대사 활성이 감소합니다19. PFA 처리의 또 다른 이점은 박테리아가 세포 구조와 영양 프로필을 유지한다는 것입니다. 결과적으로, 벌레는 PFA 처리된 박테리아...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 NIH R21AG059117와 미시간 대학의 노화 연구 생물학을 위한 Paul F. Glenn Laboratories의 자금 지원을 받았습니다. SB는 T32AG000114에서 자금을 지원했습니다. ESK는 NSF DGE 1841052에서 자금을 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알루미늄 호일스테이플2549291
분젠 버너VWR470121-700 
셀 밀도 미터Denville80-3000-45 
원심분리기Eppendorg5430
화학 연기 후드Labcono975050411384RG
Conincal 튜브 (50 mL)Fisher339652
Cuvettes Fisher14-955-127
E. coli OP50CGCOP50
Erlenmyer 플라스크Fisher250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
접종 루프Fisher22-363-605
LB 한천FisherBP1425500
액체 폐기물 수집 병Thomas Scientific1230G50
황산마그네슘(MgSO4)SigmaM7506
파라포름알데히드(32%)Electron Microscopy Sciences15714-S파라포름알데히드– 메탄올 무함유 용액
피펫터EppendorfEppendorf Easypet 3
플라스틱 접시(100mm)FisherFB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)FisherP2853
Seahorse XF CalibrantAgilent100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture MicroplateAgilent101085-004
혈청학 피펫(50mL)Genesee Scientific12-107
Shaker incubatorThermo11 676 083
염화나트륨 (NaCl)FisherS640-3
수산화나트륨 (NaOH)FisherS318500
인산나트륨 이염기성 무수(Na2HPO4)SigmaS374-500
고형 폐기물 수거통M& M 산업  5.0 갤런 M1 전통적인 양
트립톤Genesee Scientific20-251
VortexThermo11676331
계량 저울C GoldenwallHZ10K6B
효모 추출물Genesee Scientific20-255
동이

참고문헌

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