예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 연구를 위한 대사 불활성화 박테리아 방법론

요약

실험실에서 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )의 먹이 공급원은 살아있는 대장균입니다. 박테리아는 대사적으로 활동적이기 때문에 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 대사 및 약물 연구에서 혼란스러운 변수를 제시합니다.파라포름알데히드를 사용하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 자세한 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.

초록

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 유전학, 발달, 노화, 신진대사 및 행동 연구를 위한 일반적인 모델 유기체입니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 살아있는 박테리아를 섭취하기 때문에 먹이 공급원의 대사 활동은 벌레에 대한 다양한 개입의 직접적인 효과를 찾는 실험을 혼란스럽게 할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구자들은 박테리아 대사의 교란 효과를 피하기 위해 자외선(UV) 조사, 열 사멸 및 항생제를 포함하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 여러 가지 방법을 사용했습니다. UV 처리는 상대적으로 처리량이 낮고 각 플레이트가 성공적인 박테리아 사멸을 검사해야 하기 때문에 액체 배양에 사용할 수 없습니다. 두 번째 치료 방법인 열 살해는 박테리아의 질감과 영양 품질에 부정적인 영향을 미쳐 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 발달 정지를 초래합니다. 마지막으로, 항생제 치료는 박테리아 성장을 막는 것 외에도 예쁜꼬마선충의 생리학을 직접적으로 변화시킬 수 있습니다. 이 원고는 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 대체 방법을 설명합니다. PFA 처리는 박테리아 세포 내에서 단백질을 가교하여 세포 구조와 영양 성분을 보존하면서 대사 활동을 방지합니다. 이 방법은 처리량이 많으며 PFA 처리된 박테리아의 한 플레이트의 성장을 테스트하여 전체 배치를 검증하기 때문에 액체 배양 또는 고체 플레이트에서 사용할 수 있습니다. PFA 처리를 통한 대사 불활성화는 예쁜꼬마선충의 약물 또는 대사 산물 보충, 스트레스 저항성, 대사체학 및 행동에 대한 연구에서 박테리아 대사의 교란 효과를 제거하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 1965년에 모델 생물체로 처음^{제안되었으며1} 이후 유전학, 발달, 행동, 노화 및 신진대사 연구에 널리 채택되었다². 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 큰 무리 크기와 투명한 표피 때문에 형광 리포터를 이용한 고처리량 스크리닝에 특히 적합하다³. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 짧은 생애주기, 자웅동체 번식, 인간과의 유전적 상동성(genetic homology)은 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 발달 연구(development biology)4 및 노화 생물학^{(aging biology)5} 연구에 유용한 모델 시스템으로 만든다. 더욱이, 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 비교적 관리하기가 쉽습니다. 웜은 액체 배양 또는 고체 한천 플레이트에서 자랄 수 있으며 살아있는 대장균 OP50 박테리아를 섭취할 수 있다⁴.

그러나 예쁜꼬마선충(C.....

프로토콜

1. 세균 접종

1. 증류수 950mL에 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨(NaCl) 10g을 녹여 루리아 육수(LB)를 준비합니다.
2. 7.0M 수산화나트륨(NaOH)을 추가하여 LB의 pH를 5로 조정합니다. 이를 위해서는 약 0.2mL의 NaOH만 필요합니다.
3. 15psi에서 45분 동안 액체 사이클에서 pH 조정 LB 배지를 고압멸균합니다. 용액을 식히고 실온에서 보관하십시오.
4. 500mL 삼각 플라스크에 100mL의 LB에 있는 단일 박테리아 군집을 접종합니다. 37°C Shaker 인큐베이터에서 밤새 박테리아를 배양합니다.
5. 박테리아 군집의 상태, 플라스크의 크기 및 Shaker가 설정된 속도에 따라 박테리아가 성장하는 데 걸리는 시간이 다를 수 있습니다. ~14시간 후 600nm(OD₆₀₀)에서 박테리아의 광학 밀도(OD)를 확인합니다.
6. OD₆₀₀ 이 3.0(1 x 10⁹ 콜로니 형성 단위(CFU)/mL)일 때 Shaker에서 박테리아를 제거합니다. OD₆₀₀ 이 3.0 미만이면 원하는 OD에 도달할 때까지 플라스크를 Shaker 인큐베이터로 되돌립니다.
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결과

프로토콜의 자세한 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 파라포름알데히드¹⁶을 사용한 예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구에서 대사 및 약물 연구를 위해 박테리아 복제(그림 2A) 및 대사(그림 2B)를 일관되게 비활성화하기 위해 고처리량 분석법이 개발되고 최적화되었습니다. 목표는 웜의 다양한 건강 측정에 영향을 미치지 않고 박테리아를 지속적으로 죽이는 데 필요한 PFA의 최저 농도와 가장 짧은 시간을 결정하는 것이었습니다. 이러한 값은 실험실 환경에 따라 위치마다 다를 수 있으며 박테리아 균주마다 다를 수 있습니다. 예를 들어, HB101 박테리아를 1시간 동안 0.25%에 노출시키면 대사를 비활성화하기에 충분하며(그림 2C), 엔테로코커스 패칼리스(EF)는 일관된 효과를 위해 1.0%의 PFA.......

토론

다른 박테리아 살상 방법과 비교되는 PFA 살상의 이점
PFA 처리는 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 영양가 있는 식품 공급원을 유지하면서 박테리아 대사를 방지하는 고처리량 방법입니다. PFA 처리를 통해 박테리아를 죽이는 것은 다른 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 성공적인 사멸을 위해 모든 플레이트를 테스트해야 하는 UV 처리와 달리, PFA 처리된 박테리아 배치의 단일 플레이트를 테스트하여 배치¹⁶을 검증할 수 있습니다. PFA 처리는 박테리아 대사를 제거하는 데에도 매우 효과적이며(그림 2B), PFA 처리된 박테리아는 항생제 처리된 박테리아에 비해 대사 활성이 감소합니다¹⁹. PFA 처리의 또 다른 이점은 박테리아가 세포 구조와 영양 프로필을 유지한다는 것입니다. 결과적으로, 벌레는 PFA 처리된 박테리아.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알루미늄 호일	스테이플	2549291
분젠 버너	VWR	470121-700
셀 밀도 미터	Denville	80-3000-45
원심분리기	Eppendorg	5430
화학 연기 후드	Labcono	975050411384RG
Conincal 튜브 (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Erlenmyer 플라스크	Fisher	250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000
접종 루프	Fisher	22-363-605
LB 한천	Fisher	BP1425500
액체 폐기물 수집 병	Thomas Scientific	1230G50
황산마그네슘(MgSO4)	Sigma	M7506
파라포름알데히드(32%)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	파라포름알데히드– 메탄올 무함유 용액
피펫터	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
플라스틱 접시(100mm)	Fisher	FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate	Agilent	101085-004
혈청학 피펫(50mL)	Genesee Scientific	12-107
Shaker incubator	Thermo	11 676 083
염화나트륨 (NaCl)	Fisher	S640-3
수산화나트륨 (NaOH)	Fisher	S318500
인산나트륨 이염기성 무수(Na2HPO4)	Sigma	S374-500
고형 폐기물 수거통	M& M 산업	5.0 갤런 M1 전통적인 양
트립톤	Genesee Scientific	20-251
Vortex	Thermo	11676331
계량 저울	C Goldenwall	HZ10K6B
효모 추출물	Genesee Scientific	20-255

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