만능 줄기 세포에서 유래한 간세포는 미토콘드리아 및 활성 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM, CD166이라고도 함) 염색을 사용하여 세포 분류를 통해 정제할 수 있습니다.
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방법 논문
인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 간세포를 정제하기 위한 세포 분류에 살아있는 미토콘드리아 염색 적용
이 논문에서
요약
초록
인간 배아 줄기(ES) 및 유도 만능 줄기(iPS) 세포는 무제한 증식 및 만능 특성으로 인해 심각하게 병든 장기를 치료하기 위한 세포 기반 재생 의학에 잠재적으로 응용될 수 있습니다. 그러나 인간 ES/iPS 세포를 100% 순수 표적 세포 유형으로 분화시키는 것은 환경에 대한 민감도가 높기 때문에 어렵습니다. 이식 후 종양 형성은 오염, 증식, 미분화 세포에 의해 발생하므로 재생 의학의 안전한 실현을 위해서는 고순도 기술이 필수적입니다. 종양 형성의 위험을 완화하기 위해 인간 iPS 세포 유래 간세포에 대한 고순도 기술이 개발되었습니다. 이 방법은 유전자 변형 없이 높은 미토콘드리아 함량과 세포 표면 마커 ALCAM(활성 백혈구 세포 접착 분자)의 조합을 사용하여 FACS(형광 활성화 세포 분류)를 사용합니다. 이 방법을 사용하여 정제된 간세포의 97% ± 0.38%(n=5)에서 알부민 단백질 발현을 나타냈다. 이 기사는 인간 iPS 세포를 간세포로 분화하는 가장 최근의 2차원 분화 방법에 적용되는 이 방법에 대한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.
서론
배아 및 유도 만능 줄기 세포(각각 ES 및 iPS)는 재생 요법을 위한 유망한 세포 공급원으로 간주됩니다. 그러나, 이러한 세포를 특정 표적 세포 유형으로 분화하는 효율성은 동일한 세포주, 프로토콜 및 실험자 1,2,3,4를 사용하는 경우에도 다를 수 있습니다. 이러한 변동성은 인간 ES/iPS 세포가 환경에 민감하게 반응하기 때문일 수 있습니다. 따라서 현재로서는 순수한 타겟 세포를 지속적으로 획득하기 어렵습니다. 안전성이 높은 재생의학을 달성하기 위해서는 치료세포에서 증식세포와 미분화줄기세포를 제거하는 것이 중요하며, 표적세포에 대한 첨단 정제 기술이 필수적이다 5,6,7.
세포 분류기는 개별 세포를 즉시 분석하고 형광 신호 강도를 기반으로 관심 있는 활성 세포를 분류하는 장치로, 유망한 솔루션을 제공합니다. 이는 세포 유형별 표면 마커의 항체 ....
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프로토콜
이 연구는 상업적으로 획득한 인간 iPS 세포(253G1 균주)를 사용했습니다( 재료 표 참조).
1. 인간 iPS 세포의 유지
- 0.25 μg/cm2 iMatrix-511로 코팅된 배양 접시의 AK02 배지에서 인간 iPS 세포를 공급이 없는 상태로 유지합니다( 재료 표 참조).
2. 2D 배양에서 인간 iPS 세포의 간 분화
참고: 간 분화의 일일 일정에 대해서는 그림 1A 를 참조하십시오. 공정 전반에 걸쳐 6-웰 배양 플레이트를 사용하고 지정된 세척액 또는 배양 배지 2mL를 각 웰에 추가합니다. 37°C에서 100% 습도, 5%CO2 및 20%O2 에서 세포 배양 조건을 유지합니다.
- 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 기저막 매트릭스(PBS(-)에서 1/25로 희석)를 코팅하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 10μM ROCK 억제제(Y-2....
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결과
인간 iPS 세포가 2D 배양을 통해 간세포로 분화하도록 유도하는 과정(그림 1A)과 대표적인 세포 특징(그림 1B)의 타임라인이 표시됩니다. 대략 분화 12일째에 세포는 간세포의 특징인 다각형 세포 모양과 둥근 핵을 나타내기 시작했습니다. 일부 간세포는 또한 다핵형성(multinucleation)을 보였다.
FACS 분석은 분화 27일째에 세포를 사용하여 수행하였다. ALCAM+ 집단을 식별하기 위해 첫 번째 항-ALCAM 항체가 있는 경우와 없는 경우를 비교 플롯이 각각 그림 2D,E에 나와 있습니다. 2D 배양을 통해 간 분화를 유도한 간세포(P2)의 개체군은 이 실험에서 10.1%로 나타났으며, 이는 3D 배아체 형성 방법을 사용하여 발견된 0.8%(데이터 미도시).......
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토론
영양소 대사와 해독 작용을 하기 때문에, 간세포는 다른 세포 유형에 비해 상대적으로 많은 수의 미토콘드리아를 보유하고있다 15. ALCAM은 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이며 세포 접착 및 이동에 중요한 역할을 합니다. 간세포, 상피세포, 림프구세포, 골수세포, 섬유아세포, 신경세포 등 다양한 세포 유형에서 발현된다16. 미토콘드리아 기반 방법과 ALCAM 항체의 조합을 활용하여 인간 iPS 세포 유래 간세포를 성공적으로 식별했습니다.
정제된 간세포의 분비 기능 또는 효소 활성을 특성화하기 위한 분석은 수행되지 않았지만, 정제된 인간 iPS 세포 유래 간세포에서 CYP3A4 유전자의 mRNA 발현을 검증했습니다. 또한, 인간 ES 세포에서 유래한 배아체에서 분리된 TMRM(높음) 및 ALCAM(+)을 가진 간세포 집단은 ES 세포 유래 심근세포에 비해 간세포 관련 유전자 세트(VTN
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공개 사항
저자는 밝힐 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 문부과학성 보조금 번호[23390072]의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 253G1 인간 iPS 세포주 | RIKEN BioResource Research Center | HPS0002 | |
| 4% 파라포름알데히드 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-20145 | |
| Activin A Solution, human, recombinant | NACALAI TESQUE, INC. | 18585 | |
| 항핵 항체, 클론 235-1 | Chemicon | MAB1281 | 인간 핵 항원 |
| B-27 보충제에 대한 항체 (50x), 무혈청 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | 세포 분류기 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182 | |
| 시클로스포린 A | 후지필름 와코 퓨어 케미컬 주식회사 | 035-18961 | |
| 콜라겐 분해효소 | 후지필름 와코 퓨어 케미컬 | 034-22363 | |
| 코닝 마트리겔 성장 인자 감소(GFR) 기저막 매트릭스 | 코닝 | 354230 | 젤 유사 기저막 매트릭스 |
| CultureSure Y-27632 | 후지필름 와코 퓨어 케미컬 코퍼레이션 | 036-24023 | ROCK 억제제 |
| 덱사메타손 | 후지필름 와코퓨어케미컬 | 047-18863 | |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | 후지필름 와코퓨어케미컬 | 047-29353 | |
| 당나귀 안티-염소 IgG(H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| 당나귀 항-마우스 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | |
| 당나귀 항-토끼 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Falcon 5 mL 원형 바닥 폴리스티렌 시험관, 세포 여과기 스냅 캡 | Corning | 352235 | |
| 소 태아 혈청 | 포함Biowest | 51820-500 | |
| GlutaMAX 보충제 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | 디펩타이드 L-Alanyl-L-Glutamine |
| 인간/마우스/쥐/개 ALCAM/CD166 항체 | R& D Systems | AF1172 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H2270 | |
| iMatrix-511 silk | Nippi | 892021 | |
| ImmunoBlock | KAC | CTKN001 | 차단 솔루션 |
| ITS-G Supplement(× 100) | 후지필름 와코 퓨어 케미컬 코 | 090-06741 | |
| 레보비츠의 L-15 매체 | 후지필름 와코 퓨어 케미컬 코퍼레이션 | 128-06075 | |
| N-헥사노-트라이-일-(6)-아미노 헥사노익 아미드 (디헥사) | 토론토 리서치 케미컬 | H293745 | |
| 폴리클론 토끼 안티-휴먼 알부민 | 다코 | A0001 | |
| 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 (트윈 20) | NACALAI TESQUE, INC. | 28353-85 | |
| RPMI-1640 | 후지필름 Wako Pure Chemical Corporation | 189-02025 | |
| L-아스코르브산나트륨 | NACALAI TESQUE, INC. | 03422-32 | |
| StemFit AK02N | REPROCELL | RCAK02N | |
| TBS (10x) | NACALAI TESQUE, INC. | 12748-31 | |
| 테트라메틸로다민, 메틸 에스테르(TMRM) | Thermo Fisher Scientific | T668 | |
| Triton X-100 | NACALAI TESQUE, INC. | 28229-25 | |
| Trypan 블루 솔루션 | NACALAI TESQUE, INC. | 20577-34 | |
| 트립신 250 | Difco | 215240 | |
| 트립토스 인산염 육수 용액 | 시그마-알드리치 | T8159 |
참고문헌
- Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).
- Laco, F., et al.
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