인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 간세포를 정제하기 위한 세포 분류에 살아있는 미토콘드리아 염색 적용

요약

만능 줄기 세포에서 유래한 간세포는 미토콘드리아 및 활성 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM, CD166이라고도 함) 염색을 사용하여 세포 분류를 통해 정제할 수 있습니다.

초록

인간 배아 줄기(ES) 및 유도 만능 줄기(iPS) 세포는 무제한 증식 및 만능 특성으로 인해 심각하게 병든 장기를 치료하기 위한 세포 기반 재생 의학에 잠재적으로 응용될 수 있습니다. 그러나 인간 ES/iPS 세포를 100% 순수 표적 세포 유형으로 분화시키는 것은 환경에 대한 민감도가 높기 때문에 어렵습니다. 이식 후 종양 형성은 오염, 증식, 미분화 세포에 의해 발생하므로 재생 의학의 안전한 실현을 위해서는 고순도 기술이 필수적입니다. 종양 형성의 위험을 완화하기 위해 인간 iPS 세포 유래 간세포에 대한 고순도 기술이 개발되었습니다. 이 방법은 유전자 변형 없이 높은 미토콘드리아 함량과 세포 표면 마커 ALCAM(활성 백혈구 세포 접착 분자)의 조합을 사용하여 FACS(형광 활성화 세포 분류)를 사용합니다. 이 방법을 사용하여 정제된 간세포의 97% ± 0.38%(n=5)에서 알부민 단백질 발현을 나타냈다. 이 기사는 인간 iPS 세포를 간세포로 분화하는 가장 최근의 2차원 분화 방법에 적용되는 이 방법에 대한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

서론

배아 및 유도 만능 줄기 세포(각각 ES 및 iPS)는 재생 요법을 위한 유망한 세포 공급원으로 간주됩니다. 그러나, 이러한 세포를 특정 표적 세포 유형으로 분화하는 효율성은 동일한 세포주, 프로토콜 및 실험자 1,2,3,4를 사용하는 경우에도 다를 수 있습니다. 이러한 변동성은 인간 ES/iPS 세포가 환경에 민감하게 반응하기 때문일 수 있습니다. 따라서 현재로서는 순수한 타겟 세포를 지속적으로 획득하기 어렵습니다. 안전성이 높은 재생의학을 달성하기 위해서는 치료세포에서 증식세포와 미분화줄기세포를 제거하는 것이 중요하며, 표적세포에 대한 첨단 정제 기술이 필수적이다 ^5,6,7.

세포 분류기는 개별 세포를 즉시 분석하고 형광 신호 강도를 기반으로 관심 있는 활성 세포를 분류하는 장치로, 유망한 솔루션을 제공합니다. 이는 세포 유형별 표면 마커의 항체 염색을 통해 또는 세포 유형별 리포터 유전자 발현을 활용하여 달성할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 ^8,9,10 및 간세포^11,12를 정제하는 방법에 대한 여러 보고서가 있습니다. Hattori et al.은 세포 분류기¹³을 사용하여 혁신적인 미토콘드리아 정제 방법을 개발했습니다. 심근세포는 미토콘드리아 활동을 통해 많은 에너지를 필요로 한다는 사실을 이용하여 살아있는 미토콘드리아 표시 염료인 TMRM(테트라메틸로다민 메틸 에스테르)으로 세포를 염색하는 데 사용하여 다양한 세포 유형을 포함하는 인간 ES 세포 유래 배아체의 FACS로 심근세포를 라벨링하고 고도로 정제할 수 있습니다. 종양원성의 부재는 정제된 심근세포를 사용한 기형종 형성 분석에 의해 확인되었습니다. 또한, Yamashita 등은 미토콘드리아 활성이 높고 ALCAM 양성 발현이 가능한 분획을 분리하여 인간 ES 세포 유래 배아체에서 간세포를 정제하는 방법을 예기치 않게 발견했습니다¹⁴. 이 방법의 근거는 간세포는 영양 대사 및 해독을 위해 ATP를 많이 소비하기 때문에 상대적으로 많은 수의 미토콘드리아를 가지고 있으며¹⁵ 간세포는 세포 접착 및 이동에 중요한 역할을 하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원인 ALCAM을 발현한다는 것입니다¹⁶.

만능줄기세포 유래 간세포에 대한 이전의 고도의 정제 방법은 유전자 변형이 필요했고, 비유전자 정제 방법은 효율이 낮았다¹⁷. 미토콘드리아 비유전적 방법은 고순도를 달성하는 장점이 있습니다. 간 전구 세포가 필요한 경우, CD133 및 CD13 또는 Dlk1 기반 방법^18,19를 선택할 수 있습니다. 게놈 편집 기술의 정확도가 향상되었지만, 예상치 못한 게놈 변화(예: 발암)의 잠재적 위험을 완전히 제거할 수는 없습니다. 유전자 변형을 포함하지 않고 미토콘드리아 활성에 기반한 방법은 이러한 위험에서 자유로울 수 있습니다.

신생아 쥐의 심근세포에서 다양한 미토콘드리아 지표를 조사한 결과, TMRM은 24시간 이내에 완전히 사라지는 것으로 관찰된 반면, 다른 염료는 최소 5일 동안 남아 있었다¹³. 또한, TMRM과 JC-1은 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석으로 평가했을 때 세포 생존율에 영향을 미치지 않은 반면, 다른 염료는 세포 생존율에 다양한 영향을 미쳤다는 점에 유의해야 한다¹³. TMRM은 더 높은 안전성을 보여줍니다.

현재까지 여러 2차원(2D) 분화 방법이 3차원(3D) 배아 몸체 형성에 비해 분화를 유도하기 위한 보다 효율적인 접근법으로 개발되었습니다. 이는 단계적 분화 유도 화합물 또는 사이토카인을 3D 공간이 아닌 2D 평면의 세포에 균일하게 투여할 수 있기 때문입니다. 이 연구에서, 이전에 보고된 방법²⁰ 은 인간 iPS 세포 유래 간세포로의 분화를 유도하도록 수정되었다. 여기에서는 인간 iPS 세포에서 유래한 간세포의 최신 2D 분화 및 정제를 위한 절차에 대해 자세히 설명합니다.

프로토콜

이 연구는 상업적으로 획득한 인간 iPS 세포(253G1 균주)를 사용했습니다( 재료 표 참조).

1. 인간 iPS 세포의 유지

1. 0.25 μg/cm² iMatrix-511로 코팅된 배양 접시의 AK02 배지에서 인간 iPS 세포를 공급이 없는 상태로 유지합니다( 재료 표 참조).

2. 2D 배양에서 인간 iPS 세포의 간 분화

참고: 간 분화의 일일 일정에 대해서는 그림 1A 를 참조하십시오. 공정 전반에 걸쳐 6-웰 배양 플레이트를 사용하고 지정된 세척액 또는 배양 배지 2mL를 각 웰에 추가합니다. 37°C에서 100% 습도, 5%_CO2 및 20%_O2 에서 세포 배양 조건을 유지합니다.

1. 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 기저막 매트릭스(PBS(-)에서 1/25로 희석)를 코팅하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
2. 10μM ROCK 억제제(Y-27632)가 보충된 AK02N 배지를 사용하여 20,000-30,000cells/cm²의 밀도로 인간 iPS 세포를 코팅된 접시에 통과시킵니다( 재료 표 참조). 다음 날 Y-27632를 넣지 않고 배지를 교체하고 추가로 2일 동안 배양합니다.
3. RPMI-1640 배지로 세포를 한 번 세척합니다. 배지를 RPMI-B27-Glu(RPMI-1640 + 2% B27 인슐린 + 1% 디펩타이드 L-알라닐-L-글루타민)로 교체하고 3-6μM CHIR-99021 및 100ng/mL Activin A를 24시간 동안 보충하여 내배엽 분화를 시작합니다( 재료 표 참조).
4. 배지를 24시간 동안 50ng/mL Activin A가 보충된 RPMI-B27-Glu로 교체합니다.
5. 간 전구 세포 분화를 유도하기 위해 배지를 1% 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 보충된 RPMI-B27-Glu로 5일 동안 교체합니다.
6. 간세포 성숙을 촉진하기 위해 간세포 성숙 배지로 전환하십시오: 10μM 하이드로코르티손 21-헤미숙시네이트, 8.3% 트립토스 인산염 육수, 100nM 덱사메타손(DEX), 50μg/mL 나트륨-L-아스코르브산염, 0.58% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 8.3% 소 태아 혈청(FBS), 2mM 디펩타이드 L-알라닐-L-글루타민 및 100nM N-헥사노익-트라이-일-(6)-아미노 헥사노익 아미드(Dihexa)를 함유하는 Leibovitz의 L-15 배지( 재료 표 참조).
7. 20일 동안 2일마다 매체를 교체합니다. 분화를 시작한 후 약 27일 후에 세포를 분류합니다.

3. 인간 iPS 세포 유래 간세포의 정제를 위한 세포 준비

1. 웰당 2mL PBS(-)로 간 분화 세포를 세척합니다.
2. 광고 완충액(116mM NaCl, 12.5mM NaH_2PO4, 20mM HEPES, 5.4mM KCl, 5.6mM 포도당 5.8mM MgSO4, pH 7.35)에 0.1% 콜라겐아제, 0.083% 트립신, 10μM ROCK 억제제(Y-27632), 20nM 시클로스포린 A 및 50μg/mL 나트륨-L-아스코르브산염을 포함하는 웰당 1mL 효소 용액을 추가합니다(재료 표 참조). 37°C에서 약 2시간 동안 수평으로 회전하여 플레이트에서 셀을 분리합니다.
3. 현미경으로 세포가 분리되어 둥글게 된 것을 확인한 후 부드러운 피펫팅으로 단세포로 분산시켜 50mL 튜브에 채취합니다.
4. 18°C에서 5분 동안 200 x g 의 셀을 원심분리하여 펠릿화합니다. 흡입기를 사용하여 상층액을 제거합니다.
5. 세포의 미토콘드리아를 100nM TMRM(테트라메틸로다민, 메틀 에스테르)을 함유하는 5mL의 간세포 성숙 배지에 분산시켜 염색합니다( 재료 표 참조). 37 °C에서 30 분 동안 배양하면서 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호합니다.
6. 200 x g 에서 18 °C에서 5 분 동안 세포를 원심 분리하여 펠릿화합니다. 상층액을 제거합니다.
7. 2% FBS를 함유한 1-5mL의 콜드 광고 버퍼로 세포를 재현탁시킵니다.
8. 0.4% 트리판 블루 용액과 세포 계수 플레이트를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
9. 세포를 200 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하여 펠릿화합니다. 상층액을 제거합니다.
10. 항-ALCAM 항체(1차 항체, 재료 표 참조)를 광고 완충액에서 1:50 비율로 희석하고, 10⁶ cells당 100 μL의 희석된 항체를 첨가한다. 얼음에서 50분 동안 세포를 염색합니다. 1차 항체로 염색되지 않은 세포를 음성 대조군으로 준비합니다.
11. 2% FBS를 함유한 차가운 광고 버퍼로 세포를 두 번 세척합니다.
12. 광고 완충액에서 Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG(2차 항체, 재료 표 참조)를 1:100 비율로 희석하고 10⁶ cells당 100 μL의 희석된 항체를 추가합니다. 얼음 위에서 30분 동안 세포를 염색합니다. 2차 항체를 사용하여 1차 항체로 염색되지 않은 세포를 염색합니다.
13. 2% FBS를 함유한 차가운 광고 버퍼로 세포를 두 번 세척합니다.
14. 광고 버퍼의 세포를 재현탁시키고 FACS로 분류하기 직전에 스냅 캡 세포 여과기(35μm 메쉬)를 통해 필터링하여 큰 세포 덩어리와 파편을 제거합니다.

4. 인간 iPS 세포 유래 간세포의 FACS 분석 및 분류

1. 제조업체의 지침에 따라 셀 분류를 위해 FACS 기계를 설정합니다( 재료 표 참조).
   참고: 간세포에는 85μm 또는 100μm 크기의 노즐과 2.0의 ND 필터를 사용하십시오. ALCAM에 대한 Alexa Flour 488을 감지하기 위해 FITC 채널을 사용하고 미토콘드리아에 대한 TMRM 형광을 감지하기 위해 PE 채널을 사용합니다.
2. FSC(순방향 산란) 및 SSC(측면 산란) 전압을 조정하여 세포 집단을 적절하게 시각화합니다.
3. FITC 및 PE 형광 채널의 전압을 조정합니다. 레이블이 지정되지 않은 셀부터 시작하여 각 채널 플롯의 맨 아래에 있는 셀 모집단을 중앙에 배치합니다. 레이블이 지정된 셀이 플롯 내에 적절하게 배치되어 있는지 확인합니다.
4. 더블릿을 제거하기 위해 일반적인 게이팅 전략을 사용하십시오: 주요 FSC-A 대 게이트 SSC-A 모집단(그림 2A), FSC-H 대 -W, 그리고 SSC-H 대 -W(그림 2B,C).
5. TMRM^hi 및 ALCAM⁺ 집단( 그림 2E의 P2)을 게이트하여 간세포를 분류합니다. TMRM^hi 및 ALCAM^- 집단( 그림 2E의 P1)을 게이트하여 비간세포를 분류합니다. 간세포 성숙 배지가 포함된 15mL 수집 튜브에서 분류된 간세포와 비간세포를 수집합니다.
6. 분류된 세포가 들어 있는 수집 튜브를 200 x g 에서 18°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
7. 상층액을 제거하고 간세포 성숙 배지에서 세포를 재현탁시킵니다.
8. 10 μM Y-27632 및 20 nM 시클로스포린 A가 보충된 간세포 성숙 배지를 사용하여 미토마이신 C 처리된 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 또는 겔 같은 기저막 매트릭스에 세포를 파종합니다. 37°C CO₂ 인큐베이터에서 5일 동안 세포를 배양합니다.

5. 인간 iPS 세포 유래 간세포 검출을 위한 면역세포화학(Immunocytochemistry)

1. 배양된 세포를 PBS(-)로 분류 후 5일 동안 세척합니다.
2. 실온에서 5분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다.
3. TBS-T 완충액(1x TBS, 1% Tween 20)으로 세포를 두 번 세척하여 파라포름알데히드를 제거합니다.
4. 0.1% Triton X-100 희석된 TBS-T 완충액으로 실온에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
5. TBS-T 완충액으로 세포를 두 번 세척하여 Triton X-100을 제거합니다.
6. 시중에서 판매되는 차단 용액( 재료 표 참조)을 실온에서 30분 동안 셀에 추가합니다.
7. 차단 용액에 1:50으로 희석하여 알부민(간세포 마커) 및 인간 핵 항원(hNA, 재료 표 참조)에 대한 1차 항체를 추가합니다.
8. 4 °C에서 밤새 세포를 배양합니다. TBS-T 버퍼로 세포를 두 번 세척합니다.
9. 2차 항체 추가: 차단 용액에 1:100으로 희석한 Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG 및 Alexa Fluor 546 donkey anti-mouse IgG( 재료 표 참조).
10. 실온에서 30분 동안 세포를 배양합니다. TBS-T 버퍼로 세포를 두 번 세척합니다.
11. 형광 현미경으로 알부민 양성 및 hNA 양성 세포를 계수하여 간세포 순도를 평가합니다. P1 및 P2 집단 모두에 대해 hNA 양성 세포당 알부민 양성 세포의 백분율을 계산합니다.

결과

인간 iPS 세포가 2D 배양을 통해 간세포로 분화하도록 유도하는 과정(그림 1A)과 대표적인 세포 특징(그림 1B)의 타임라인이 표시됩니다. 대략 분화 12일째에 세포는 간세포의 특징인 다각형 세포 모양과 둥근 핵을 나타내기 시작했습니다. 일부 간세포는 또한 다핵형성(multinucleation)을 보였다.

FACS 분석은 분화 27일째에 세포를 사용하여 수행하였다. ALCAM⁺ 집단을 식별하기 위해 첫 번째 항-ALCAM 항체가 있는 경우와 없는 경우를 비교 플롯이 각각 그림 2D,E에 나와 있습니다. 2D 배양을 통해 간 분화를 유도한 간세포(P2)의 개체군은 이 실험에서 10.1%로 나타났으며, 이는 3D 배아체 형성 방법을 사용하여 발견된 0.8%(데이터 미도시)...

토론

영양소 대사와 해독 작용을 하기 때문에, 간세포는 다른 세포 유형에 비해 상대적으로 많은 수의 미토콘드리아를 보유하고^{있다 15}. ALCAM은 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이며 세포 접착 및 이동에 중요한 역할을 합니다. 간세포, 상피세포, 림프구세포, 골수세포, 섬유아세포, 신경세포 등 다양한 세포 유형에서 발현된다¹⁶. 미토콘드리아 기반 방법과 ALCAM 항체의 조합을 활용하여 인간 iPS 세포 유래 간세포를 성공적으로 식별했습니다.

정제된 간세포의 분비 기능 또는 효소 활성을 특성화하기 위한 분석은 수행되지 않았지만, 정제된 인간 iPS 세포 유래 간세포에서 CYP3A4 유전자의 mRNA 발현을 검증했습니다. 또한, 인간 ES 세포에서 유래한 배아체에서 분리된 TMRM(높음) 및 ALCAM(+)을 가진 간세포 집단은 ES 세포 유래 심근세포에 비해 간세포 관련 유전자 세트(VTN

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
253G1 인간 iPS 세포주	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% 파라포름알데히드	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, human, recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
항핵 항체, 클론 235-1	Chemicon	MAB1281	인간 핵 항원
B-27 보충제에 대한 항체 (50x), 무혈청	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		세포 분류기
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
시클로스포린 A	후지필름 와코 퓨어 케미컬 주식회사	035-18961
콜라겐 분해효소	후지필름 와코 퓨어 케미컬	034-22363
코닝 마트리겔 성장 인자 감소(GFR) 기저막 매트릭스	코닝	354230	젤 유사 기저막 매트릭스
CultureSure Y-27632	후지필름 와코 퓨어 케미컬 코퍼레이션	036-24023	ROCK 억제제
덱사메타손	후지필름 와코퓨어케미컬	047-18863
디메틸설폭사이드(DMSO)	후지필름 와코퓨어케미컬	047-29353
당나귀 안티-염소 IgG(H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
당나귀 항-마우스 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
당나귀 항-토끼 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL 원형 바닥 폴리스티렌 시험관, 세포 여과기 스냅 캡	Corning	352235
소 태아 혈청	포함Biowest	51820-500
GlutaMAX 보충제	Thermo Fisher Scientific	35050061	디펩타이드 L-Alanyl-L-Glutamine
인간/마우스/쥐/개 ALCAM/CD166 항체	R& D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	차단 솔루션
ITS-G Supplement(× 100)	후지필름 와코 퓨어 케미컬 코	090-06741
레보비츠의 L-15 매체	후지필름 와코 퓨어 케미컬 코퍼레이션	128-06075
N-헥사노-트라이-일-(6)-아미노 헥사노익 아미드 (디헥사)	토론토 리서치 케미컬	H293745
폴리클론 토끼 안티-휴먼 알부민	다코	A0001
폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 (트윈 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	후지필름 Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
L-아스코르브산나트륨	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
테트라메틸로다민, 메틸 에스테르(TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan 블루 솔루션	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
트립신 250	Difco	215240
트립토스 인산염 육수 용액	시그마-알드리치	T8159