Method Article

Chimeric Small Noncoding RNA에 대한 전산 분석 튜토리얼: 표적 RNA 염기서열분석 라이브러리

DOI:

10.3791/65779

⸱

December 1st, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

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여기에서는 in vivo RNA:RNA 상호 작용 연구에 사용되는 키메라 RNA 염기서열 분석 데이터를 분석하기 위한 생물정보학 파이프라인의 설치 및 사용을 보여주는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

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microRNA(miRNA)와 같은 작은 비코딩 RNA(sncRNA)와 표적 RNA의 생체 내 유전자 조절 상호 작용에 대한 이해는 키메라 RNA 및 후속 염기서열 분석 라이브러리의 형성을 통해 sncRNA:표적 RNA 상호 작용을 포착하기 위해 교차 결합 후 결찰을 사용하는 생화학적 접근 방식에 의해 최근 몇 년 동안 발전되었습니다. 키메라 RNA 염기서열 분석의 데이터 세트는 miRNA 예측 소프트웨어보다 게놈 전체에 대한 모호성이 훨씬 적은 입력을 제공하지만, 이 데이터를 의미 있고 실행 가능한 정보로 추출하려면 추가 분석이 필요하며 계산 배경이 부족한 연구자를 설득할 수 있습니다. 이 보고서는 초급 컴퓨터 생물학자가 최신 오픈 소스 소프트웨어 도구인 SCRAP(Small Chimeric RNA Analysis Pipeline)를 설치하고 적용할 수 있도록 지원하는 자습서를 제공합니다. 플랫폼 요구 사항, 업데이트, 파이프라인 단계 및 주요 사용자 입력 변수 조작에 대한 설명이 제공됩니다. 생물학자가 키메라 RNA 염기서열 분석 접근법에서 통찰력을 얻을 수 있는 장벽을 줄이면 여러 생물학적 맥락에서 조절 sncRNA:표적 RNA 상호 작용에 대한 발견 기반 조사를 시작할 수 있습니다.

Introduction

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작은 비코딩 RNA는 분화 및 발달, 신호 처리 및 질병과 같은 다양한 과정에서 유전자 제품군의 발현을 조정하는 전사 후 역할에 대해 고도로 연구되고 있습니다 1,2,3. microRNA(miRNA)를 포함한 유전자 조절 소형 비코딩 RNA(sncRNA)의 표적 전사체를 정확하게 결정하는 능력은 기본 및 번역 수준 모두에서 RNA 생물학 연구에 중요합니다. miRNA 시드 서열과 잠재적 표적 사이의 예상되는 상보성을 활용하는 생물정보학 알고리즘은 miRNA:표적 RNA 상호작용의 예측에 자주 사용되어 왔습니다. 이러한 생물정보학 알고리즘은 성공적이었지만 다른 곳에서 검토된 바와 같이 위양성 및 위음성 결과를 모두 보유할 수도 있습니다 4,5,6. 최근에, 단일 키메라 RNA 4,5,7,8,9,10을 형성하기 위해 sncRNA를 표적에 물리적으로 부착하기 위한 ligation 단계의 in vivo 교차결합 및 후속 통합에....

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Protocol

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참고: 프로토콜은 SCRAP를 사용하여 키메라 RNA 염기서열 분석 라이브러리를 분석하는 데 필요한 소프트웨어를 다운로드하고 설치하는 것으로 시작됩니다.

1. 설치

  1. SCRAP를 설치하기 전에 분석에 사용할 컴퓨터에 종속성 Git 및 Miniconda를 설치합니다. Git이 이미 설치되어 있을 수 있습니다. 예를 들어 Mac OSX 플랫폼에서 which git을 사용하여 이를 확인하여 " git " 유틸리티가 있고 이 디렉토리에 설치되어 있는지 확인합니다. Miniconda가 어떤 conda를 사용하여 설치되었는지 확인하십시오. 아무 것도 반환되지 않으면 Miniconda를 설치합니다. Miniconda를 설치하려면 400MB의 디스크 공간이 필요합니다.
    1. Miniconda를 설치하는 몇 가지 방법이 있으며 플랫폼에 따라 다릅니다. Windows, MacOS 및 Ubuntu에 설치하기 위한 추가 지침이 있는 Meffert Lab GitHub 리포지토리 [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]의 PLATFORM-SETUP

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Results

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CLEAR-CLIP9 를 사용하여 준비한 이전에 발표된 염기서열분석 데이터 세트에서 변형된 버전의 SCRAP(rRNA 필터링을 위한 수정을 구현하는 SCRAP 릴리스 2.0)에 의해 검출된 sncRNA:target RNA에 대한 결과는 그림 2 및 표 1에 나와 있습니다. 사용자는 SCRAP에서 피크 호출에 의한 신뢰도 높은 상호 작용의 분리 후에 발생하는 인트론 영역과의 상대적 분획 miRNA 상호 작용의 감소를 이해할 수 있습니다. SCRAP를 사용한 분석의 추가 데이터는 이 파이프라인6의 초기 게시에서도 사용할 수 있습니다. 실험적 접근 방식에 따라 결과의 아티팩트를 줄이기 위해 준비된 키메라 RNA 라이브러리의 염기서열 분석 데이터 필터링이 필요할 수 있습니다. 염기서열분석 라이브러리의 최적이 아닌 생화학적 준비 및/또는 염기서열분석 데이터의 최적이 아닌.......

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Discussion

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sncRNA:target RNA 상호 작용 분석을 위한 SCRAP 파이프라인 사용에 대한 이 프로토콜은 전산 분석을 시작하는 연구자를 지원하기 위해 설계되었습니다. 이 튜토리얼을 완료하면 초급 이상의 계산 경험이 있는 연구자에게 이 파이프라인과 키메라 RNA 염기서열 분석 라이브러리에서 얻은 데이터를 분석하기 위한 애플리케이션의 설치 및 사용에 필요한 단계를 안내할 수 있을 것으로 예상됩니다. 이 프로토콜의 완료에 중요한 단계에는 올바른 참조 설치 및 SCRAP 실행이 포함되며, 이는 시간이 많이 소요될 수 있으며 특히 Anaconda를 사용하여 종속성을 설치하거나 명령줄 인수를 입력하는 동안 주의를 기울이지 않은 경우 오류의 원인이 될 수 있습니다.

여기서는 키메라 sncRNA:표적 RNA 염기서열분석 라이브러리 분석을 위한 SCRAP 파이프라인의 실제 사용을 위한 팁과 단계에 특히 중점을 두었습니다. SCRAP는 sncRNA:표적 RNA 상호 작용 검출에서 다른 키메라 RNA.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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파이프라인의 설치 및 구현에 대한 중요한 피드백을 제공해 주신 BH Powell 및 WT Mills IV를 포함하여 유용한 토론을 해주신 Meffert 연구소 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 Braude Foundation 상, Maryland Stem Cell Research Fund Launch Program, Blaustein Endowment for Pain Research and Education 상, NINDS RO1NS103974 및 NIMH RO1MH129292 to M.K.M.의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
게놈UCSC 게놈 브라우저해당 없음https://genome.ucsc.edu/ 또는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/
LinuxLinuxUbuntu 20.04 또는 22.04 LTS 권장
MacAppleMac OSX (>11),
플랫폼 설정, GitHub해당 없음https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]
SCRAP 파이프라인GitHub해당 없음https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP
Unix shellUnix 운영 체제bash >=5.0
Unix shellUnix 운영 체제zsh(5.9 권장)
WindowsWindows WSL Ubuntu 20.04 또는 22.04 LTS
, , , ,

References

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  1. Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
  2. Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury resp....

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