Method Article

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer(포레스트 우드 보어의 곤충병원성 곰팡이의 격리, 행동 식별 및 병원성 평가)

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 숲 나무 천공충에서 곤충병원성 균류를 얻기 위한 프로토콜과 딱정벌레목 모델 곤충을 사용하여 곤충병원성 활성을 평가하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 자연 산림에서 나무를 뚫는 곤충 해충으로부터 곤충 병원성 곰팡이 자원을 탐사하는 데 효율적이고 편리합니다.

Abstract

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FWB(Forest Wood Borers)는 전 세계적으로 심각한 나무 피해와 경제적 손실을 초래합니다. FWB 출현 기간 동안 곤충병원성 곰팡이(EPF)의 방출은 화학적 방제에 대한 수용 가능한 대안으로 간주됩니다. 그러나 EPF 자원은 농업 해충과 달리 FWB에 대해 훨씬 덜 탐사되었습니다. 이 논문은 야생 Monochamus alternatus 개체군을 예로 들어 FWB에서 EPF 자원을 탐색하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서 함정 할당은 M으로 미끼입니다. 다른 개체군에 대한 Alternatus 유인제는 딱정벌레의 출현 기간 동안 자연 감염 증상이 있는 적절한 샘플의 수집을 보장했습니다. 외피를 정교하게 해부하여 선택적 배지에 놓은 후, 딱정벌레 몸체의 각 부분에서 곰팡이 종을 분리하고 분자 및 형태 학적 특성을 기반으로 식별했습니다.

몇몇 곰팡이 종은 포자 현탁액과 함께 건강한 M. alternatus 의 재감염을 통해 기생 EPF로 인증되었습니다. M. alternatus 에 대한 그들의 행동 표현형은 주사 전자 현미경을 사용하여 관찰되었으며 딱정벌레목 모델 곤충 Tribolium castaneum의 표현형과 추가로 비교되었습니다. 두 딱정벌레 종 모두에서 일관된 기생 표현형을 나타내는 EPF의 경우 T에 대한 활성 평가. castaneum 은 M. alternatus에 대한 향후 연구를 위해 치사율에 대한 귀중한 정보를 제공했습니다. 이 프로토콜은 중국의 M. alternatus 개체군에 대해 새로 보고된 EPF를 발견하는 데 도움이 되었으며, 이는 다른 FWB에서 더 많은 EPF 자원을 탐색하기 위한 효율적인 접근 방식으로 적용될 수 있습니다.

Introduction

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해충으로 인한 황폐화는 산림과 농업 생태계 모두에서 큰 생태학적, 경제적 손실을 초래했습니다. 대부분의 농업 해충은 천적이나 인공 방제제에 노출되면서 숙주 식물에 피해를 줍니다. 대신, 산림나무천공자(FWB)는 숙주나무 줄기1 내에서 전체 발달 주기를 거의 완료하는데, 이는 야생에서 FWB의 효율적인 생물 방제 유기체를 탐색하는 데 큰 도전을 제기합니다. 더욱 심각한 것은 FWB가 많은 수의 식물병원체2를 운반하거나 이러한 병원체와 잠재적인 매개체3,4로서 밀접한 관계를 맺고 있어 FWB가 산림 건강에 미치는 부정적인 영향을 극적으로 증폭시킨다는 것이다. 화학 살충제의 과도한 사용은 FWB의 심각성을 완화할 수 있지만, 살충 내성 5,6의 출현은 환경 적용을 제한한다. 특정 경우에, 곤충 기생충, 포식성 절지동물 및 곤충병원성 미생물이 생물방제로서 FWB7의 분포 영역에 방출되었으며, 화학적 방제에....

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Protocol

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1. M. alternatus 에서 곰팡이 분리(그림 1)

  1. 딱정벌레 표본 수집
    1. 소나무 sawyer 딱정벌레 M을 수집하십시오. 자연적으로 감염된 소나무 숲에서 딱정벌레 개체군의 예측된 출현 기간 전에 유인제로 미끼를 던진 상업용 트랩(재료 표 참조)을 사용하는 Alternatus.
      참고: 이 연구에서는 중국 남부의 5개 지역(후저우/저장, 량산/쓰촨, 샤먼/푸젠성, 사오관/광동, 위린/광시)에서 딱정벌레를 수집했습니다. 위에서 아래로 트랩 설정은 둥근 상단(지름 50cm), 십자형 패널(폭 35cm, 길이 66cm), 깔때기(상단 원형 지름 35.5cm, 하단 원형 지름 5.5cm), 수집 컵(지름 10.5cm, 길이 26.5cm)입니다. 숙주 휘발성 물질(예: 에탄올 및 α-피넨) 및 응집 페로몬(2-운데실옥시-1-에탄올)이 미끼(30)로 사용된다.
    2. 실험실로 옮기기 전에 표본에 라벨을 붙입니다. 각 딱정벌레를 신선한 나뭇 가지가있는 개별 멸균....

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Results

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M에서 분리된 곰팡이의 분리 및 식별. 알터나투스
유인 트랩의 도움으로 많은 수 (총 약 500 마리의 딱정벌레)의 M. Alternatus 는 5 개의 지리적 지역에서 수집되었습니다. 곤충병원성 곰팡이에 의한 감염의 전형적인 증상이 있는 딱정벌레 시체를 채취하였다; 그런 다음, 모든 딱정벌레의 신체 외피를 프로토콜 단계 1.3에 설명된 대로 여러 위치로 절개했습니다. 그 결과, 600개 이상의 진균 분리체가 서로 다른 신체 위치에서 분리되었습니다. 이를 통해 소나무 톱질 딱정벌레에 대한 병원균을 스크리닝할 수 있는 더 풍부한 곰팡이 후보가 가능합니다. ITS 영역의 시퀀싱은 이러한 분리물이 15 개의 곰팡이 속과 39 종으로 분류 될 수 있음을 예비 적으로 밝혔습니다. 또한, M. alternatus 성인의 지리적 개체군 간의 곰팡이 군집 구성에 상당한 차이가 있었습니다. 곰팡이 종, Aspergillu.......

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Discussion

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FWB의 다른 지리적 개체군은 지역 기후 요인에 대한 EPF 종의 장기적인 환경 적응 및 숙주 곤충44,45의 특정 유전형 개체군으로 인해 자연 곤충병원성 곰팡이와 다양한 상호 작용을 개발할 수 있습니다. 샘플링 장소를 여러 곤충 발생 지역으로 확장하는 것은 농업 해충에 대한 이전 연구에서 설명한 바와 같이 자연 숙주로부터 다양한 균주 또는 종의 EPF를 획득할 가능성을 높이는 데 도움이 된다46. 이 프로토콜에서는 유인제로 미끼를 던진 함정의 도움으로 소나무 톱질 딱정벌레 M. alternatus는 중국 남부의 5개 지역에서 위도를 넘나들며 수집되며, 이는 더 높은 온도와 습도를 고려할 때 새로운 EPF를 탐사하기 위한 이상적이고 풍부한 자원 저장소로 간주됩니다. 이 노동력 절약형 방법은 .......

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Disclosures

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국가핵심연구개발프로그램(2021YFC2600100)과 저장성 자연과학재단(LY21C040001)의 지원을 받았다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL, 2 mL 원심분리기 튜브BiosharpBS-15-M
10 µ L 피펫 팁Sangon BiotechF601216
10 µ L, 20 &마이크로; L, 100 &마이크로; L, 200 &마이크로; L, 1,000 &마이크로; L 피펫Rainin
1,000 µ L 피펫 팁Sangon BiotechF630102
2 mL 극저온 바이알Corning430659
20x PBS 버퍼Sangon BiotechB548117-0500
200 µ L 피펫 팁Sangon BiotechF601227
2,000 bp makerTaKaRarSD0531
50 mL 튜브Nest602052
50% 글루타르알데히드 용액Sangon BiotechG916054
50x TAE 버퍼Sangon BiotechB548101
6x loading bufferTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
무수 에탄올JkchemicalLB10V37
생화학 배양 캐비닛ShanghaiyihengLRH-250F
클로로포름Juhua61553
상업용 딱정벌레 트랩FEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
젤 이미저Bio-RadGelDoc XR+
글리세롤Sangon BiotechA600232
고속 냉장 원심 분리기SigmaD-37520
고압 증기 살균 포트Mettler ToledoJA5003
이소 프로필 알코올일반 시약G75885B
핵산 염료Sangon BiotechA616696
광학 현미경, OMLeicaDM2000
파라 필름파라 필름PM996
PCR 미터Heal ForceTrident960
페니실린 GMarklinGB15743
감자 포도당 한천, PDAOxoidCM0139
감자 포도당 육수, PDBSolarbioP9240
프라이머Sangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation KitSangon BiotechB518229
주사 전자 현미경, SEMHitachiS-3400N
스트렙토마이신MarklinS6153
TetracyclineMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
진공 동결 건조기YamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
β-MercaptoethanolMarklinM6230

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-t....

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Entomopathogenic FungiForest Wood BorersMonochamus AlternatusFungal IsolationPathogenicity AssessmentScanning Electron MicroscopyMolecular IdentificationParasitic FungiPhylogenetic AnalysisInsect Pathogenicity

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