Method Article

미생물 자가응집(microbial autoaggregation)을 연구하기 위한 이미징 유세포분석(Imaging flow cytometry)

DOI:

10.3791/65788

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, 2Ilse Kats Institute for Nanoscale Science & Technology, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Plant Pathology and Microbiology, Faculty of Agriculture, Food and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, 4The Scojen institute for synthetic biology, Reichman university

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 이미징 유세포 분석을 사용하여 미생물 자가응집을 측정하기 위한 정량적 접근 방식을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유익한 프로바이오틱 박테리아는 숙주에서 필수적인 역할을 하여 전염병에 대한 면역을 포함한 다양한 건강상의 이점을 제공합니다. 락토바실러스과(Lactobacillaceae)는 프로바이오틱스 특성이 확인된 그람 양성 박테리아로 구성되어 있습니다. 이 연구는 세포 응집 연구에서 단세포 고처리량 분석의 효과를 입증하기 위한 모델로 Lactobacillaceae 종을 활용합니다. 초점은 식단의 단순 탄수화물에 대한 이러한 유익한 종의 반응을 분석하는 것입니다.

이 연구는 이미징 유세포 분석(IFC)이 탄수화물의 존재와 부재에서 프로바이오틱 박테리아 조립의 근본적인 차이를 극복할 수 있는 방법을 보여줍니다. IFC는 기존 유세포 분석의 성능 및 속도와 현미경의 공간 해상도를 결합하여 유익한 박테리아 균주 및 조건 라이브러리에서 표현형으로 정의된 방식으로 복잡한 형태 측정 속도를 높일 수 있습니다. 이 프로토콜은 락토바실러스과(Lactobacillaceae) 종의 자가응집에 대한 통찰력을 제공하고 식이 탄수화물에 대한 반응을 밝혀 이러한 프로바이오틱 박테리아의 유익한 효과 뒤에 숨겨진 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

Introduction

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박테리아 자가응집은 생물막 형성의 주요 단계로 간주됩니다. 이 과정(자가응집 또는 응집이라고도 함)에서 동일한 유형의 박테리아는 다세포 덩어리를 형성하여 결국 배양관의 바닥에 가라앉거나 표적 조직 또는 표면1에 부착됩니다.

자가응집은 널리 관찰되는 현상으로, 기회주의적 병원체인 Acinetobacter baumannii2, 치과 병원체인 Aggregobacter actinomycetemcomitans3 및 신흥 병원체인 Burkholderia pseudomallei4와 같은 그람 음성 병원체에서 지금까지 나타났습니다. 자가응집은 또한 여러 프로바이오틱 그람 양성 균주 5,6,7,8에서 설명되었습니다. 락토바실러스(L.) 애시도필러스(Lactobacillus (L.) acidophilus

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Protocol

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예를 들어 LGG(Lacticaseibacillus rhamnosus GG)에 대한 템플릿이 포함된 .ast 파일은 보충 코딩 파일 1에 제공됩니다.

1. 미디어 준비

  1. 제조업체의 지침에 따라 락토바실러스 MRS 육수(탈이온수 1L에 55g)를 준비하고 1.5%(w/v) 한천이 있는 락토바실러스 MRS 한천 플레이트를 준비합니다( 재료 표 참조). 오토클레이브 멸균 후 배지는 직접 사용할 수 있거나 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  2. 트립트 콩 육수 50%(탈이온수 15L에 1g)를 준비하고( 재료 표 참조), 1%(w/v) D-(+)-포도당 및 1%(w/v) D-(+)-라피노스를 보충한 TSB를 준비한 다음 고압멸균을 위해 배지를 살균합니다. 오염을 피하기 위해 4 °C에서 보관하는 것이 좋습니다.
  3. 포도당이 함유된 완충 매체의 경우, 1%(w/v) D-(+)-글루코스, 5mM의 인산칼륨 일염기성 및 이염기성 칼륨, 및 100mM 걸레(3-(N-모르폴리노) 프로판 술폰산, 재료 표 참조) pH 7이 보충된 TSB를 준비합니다. 그....

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Results

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결과는 이 방법이 LAB 박테리아의 식이 당에 대한 반응으로 자동 응집의 차이를 쉽게 측정할 수 있음을 보여줍니다. 집합체에서 개체를 분리함으로써, 이 방법은 식단에서 발효성 또는 비발효성 설탕에 대한 반응으로 모든 이벤트에서 집계 이벤트의 개체군의 백분율을 계산할 수 있습니다. 또한, 처리 간에 응집체 모집단의 평균 크기에 차이가 있는지 측정할 수 있었습니다.

그림 3의 대표 이미지는 각 LAB 박테리아에 대한 게이팅 전략을 보여줍니다. LGG 및 L. paracasei에서는 단일 세포, 작은 응집체, 큰 응집체 및 사슬이 검출되었습니다(그림 3). 그러나 체인과 더 큰 골재는 분리할 수 없었습니다.

그림 4의 대표적인 이미지는 발효성 또는 비발효성 설탕.......

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Discussion

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유세포 분석은 진핵 세포의 형광 강도를 정량화하는 데 널리 사용되는 방법이지만, 크기가 크거나 응집체가 작기 때문에 박테리아 세포에 대한 정확한 측정을 제공하지 못할 수 있습니다. 이러한 요인은 자동 응집체의 정확한 정량화와 다양한 조건에서 응집체 형성의 기초 수준에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 이미징 유세포 분석(IFC)을 사용하여 탄수화물이 프로바이오틱 박테리아의 응집에 미치는 영향을 더 잘 파악했습니다5. IFC는 샘플당 수많은 디지털 이미지를 수집하고 수치 이미지 기반 특징을 추출하여 기존 유세포 분석에서 큰 샘플 크기의 통계적 유의성을 표준 현미경의 세포별 정보 콘텐츠와 결합합니다16.

이전에 IFC는 Bacillus subtilis의 항생제 생산 및 이중 종 생물막18,19

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Acknowledgements

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이 연구는 이스라엘 과학 재단(보조금 119/16)과 IMoh 보조금(3-15656)의 지원을 받아 IKG에 지원되었습니다. R.S. Kreitman 펠로우십의 지원을 받습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14 mL 배양 튜브Falcon352051
15 mL 원심분리 튜브Falcon352096
Bacto AgarBaeton,Dickinson and Company214010
Bacto Typtic soy BrothBaeton,Dickinson and Company211825
D-(+)-GlucoseSigmaG7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrateSigma83400-25G
Difco Lactobacilli MRS 브로스Baeton,Dickinson and Company288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)FL medical23053
IDEAS SoftwareAmnis/EMD MilliporeN/A  자세한 내용은 https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/A 에서 확인할 수 있습니다. 세부 정보 제공: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)프로판설폰산Fisher 생물 시약BP308-500
인산칼륨 이염기성Fisher Scientific, 174.18g/molBP363-1
인산칼륨 일염기성 시그마, 136.09g/molP0662-500G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. Bacterial autoaggregation. AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).
  2. Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating hig....

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Imaging Flow CytometryMicrobial AutoaggregationLactobacillaceae SpeciesProbiotic BacteriaSingle Cell AnalysisDietary CarbohydratesHigh Throughput ImagingAggregate Size DistributionBright Field MicroscopyCell Aggregation

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