본 연구는 혈전 용해, 세포 염색 및 정기 혈액 검사를 통한 뇌혈전의 세포 성분 분석을 위한 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.
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방법 논문
뇌혈전의 세포 성분을 분석하기 위한 포괄적인 접근법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
뇌동맥이나 정맥에 혈전이 생기는 뇌혈전증은 뇌경색의 가장 흔한 유형이다. 뇌혈전의 세포 성분에 대한 연구는 진단, 치료 및 예후에 중요합니다. 그러나 혈전의 세포 성분을 연구하는 현재의 접근 방식은 주로 in situ 염색을 기반으로 하며, 이는 세포가 혈전으로 단단히 싸여 있기 때문에 세포 성분에 대한 포괄적인 연구에는 적합하지 않습니다. 이전 연구에서는 Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소(sFE)를 성공적으로 분리했는데, 이는 가교 결합된 피브린을 직접 분해하여 세포 성분을 방출할 수 있습니다. 이 연구는 뇌혈전의 세포 성분을 연구하기 위해 sFE를 기반으로 하는 포괄적인 방법을 확립했습니다. 이 프로토콜에는 혈전 용해, 세포 방출, 세포 염색 및 정기 혈액 검사가 포함됩니다. 이 방법에 따르면 세포 구성 요소를 정량적 및 정성적으로 연구할 수 있습니다. 이 방법을 사용한 실험의 대표적인 결과를 나타낸다.
서론
뇌혈관질환은 인간의 건강을 위협할 수 있는 3대 질환 중 하나로, 그 중 허혈성 뇌혈관질환이 80% 이상을 차지합니다. 뇌혈전증과 뇌정맥혈전증은 오늘날 가장 우려되는 허혈성 뇌혈관 질환으로, 주로 뇌혈전으로 인해 발생한다 1,2. 치료가 제대로 이루어지지 않으면 장애율과 사망률이 높고 퇴원 후 재발률이 높다3.
최근에는 뇌혈전의 세포 성분이 뇌혈전증의 진단, 치료 및 예후와 밀접한 상관관계가 있다는 연구 결과가 점점 더 많이 나오고 있다 4,5,6. 따라서 혈전 구성, 특히 세포 구성 요소에 대한 데이터의 가용성은 임상 진단 및 치료에 중요합니다. 안타깝게도, 현재 사용 가능한 방법으로는 혈전 성분을 정량적, 정성적으로 종합적으로 분석할 수 없습니다. 예를 들어, Martius Scarlett Blue 기반 in-situ 염색은 혈전7의 특정 절편의 적혈구/백혈구만 연구할 ....
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프로토콜
이 연구는 Huaqiao University 의료 윤리 위원회의 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 뇌혈전은 푸젠 의과대학 부속 취안저우 제1병원에서 환자의 사전 동의를 얻어 외과적으로 제거해 채취했다.
1. 혈전 전처리
- 깨끗한 접시에 혈전을 놓고 핀셋으로 생리식염수 5mL를 넣고 접시를 부드럽게 흔든 다음 피펫으로 식염수를 제거합니다.
알림: 헹굼을 세 번 반복합니다. - 가위로 혈전을 더 작은 조각(5mm x 5mm x 5mm 미만)으로 자릅니다. 생리식염수 5mL를 넣고 접시를 부드럽게 흔든 후 피펫으로 식염수를 제거합니다.
알림: 헹굼을 세 번 반복합니다. 헹구는 동안 응고 조각이 흡입되지 않도록 하십시오. - 혈전을 다른 깨끗한 U-플레이트로 옮깁니다.
알림: 프로토콜은 여기에서 일시 중지하고(플레이트를 2-8°C에 보관) 나중에 다시 시작할 수 있습니다.
2. 혈전용해
- 생리식염수로 sFE의 농도를 2000U/mL로 조정하여 sFE 작업 용액을 준비합니다.
알림: sFE는 Tang Lab15
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결과
분해 과정의 초기 단계에서 혈전은 적색 조밀 구조를 가지고 있으며 작업 용액은 무색이라는 것이 밝혀졌습니다. 30분 동안 배양한 후, 작업 용액은 밝은 빨간색으로 변했으며, 이는 교차된 혈액 세포가 작업 용액으로 방출되었음을 나타냅니다. 배양 시간을 5시간으로 늘리면 대부분의 혈전이 용해되었고, 작업 용액은 연한 붉은색이 되었습니다. 반대로, 10시간 배양 후에도 생리식염수군(NC)에는 큰 변화가 없었습니다(그림 1). 이러한 결과는 혈전으로 둘러싸인 혈액 세포가 이 프로토콜에 의해 성공적으로 방출되었음을 보여주었습니다.
Wright의 염색 후 세포 성분을 광학 현미경으로 명확하게 검사했습니다(그림 2A). 방출된 혈액 세포 중에는 표면이 약간 오목하고 원반 모양인 성숙한 적혈구가 많이 관찰될 수 있었습니다. 유리 슬라이드에서 불규칙한 모양의 작은 자주색-적색 입자가 다량 .......
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토론
sFE는 피브린을 직접적이고 효과적으로 분해할 수 있는 섬유소 용해제입니다12,16. 여기서 sFE를 사용하여 대뇌 혈전의 가교 피브린을 분해하고, 혈전 내에 밀폐된 세포를 방출하고, 혈전의 세포 성분을 정성적, 정량적으로 분석했습니다. 현미경 검사 데이터와 정기 혈액 검사는 밀폐된 세포가 혈전에서 방출되었음을 나타냈습니다. 또한, 방출된 세포의 세포 유형 및 구조는 sFE 처리 후 크게 영향을 받지 않았습니다. 따라서 대뇌 혈전의 세포 성분을 분석하기 위한 독특하고 간단하며 효과적인 방법이 처음으로 만들어졌습니다.
방출된 세포는 혈전 내만큼 안정적이지 않기 때문에 온도, sFE 선량, 회전 속도 및 분해 시간과 같은 방출된 세포의 파괴 비율을 줄이기 위해 분해 조건을 최적화해야 합니다. Wright의 염색 결과는 10시간 열화의 배경이 5시간의 배경보다 더 흐릿하다는 것을 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 샤먼시 과학기술국(3502Z20227197)과 푸젠성 과학기술국(No. 2019J01070, No.2021Y0027)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
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| 원심분리기 튜브 (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
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| 항온 인큐베이터 | JINGHONG | JHS-400 | |
| 문화 접시 (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG 시리즈 가열 및 건조 오븐 | SENXIN | DGG-9140AD | |
| 전자 분석 저울 | DENVER | TP-213 | |
| 필터 멤브레인 (0.22 &마이크로; m) | Millex GP | SLGP033NK | |
| 마이크로 냉장 원심분리기 | Cence | H1650-W | |
| 현미경 슬라이드 | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| 광학 현미경 | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| 인산염 완충 식염수 | Beyotime | C0221A | |
| 피펫 팁 (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| 피펫 팁 (200 µ L) | Axygene | T-200XT-C | |
| 피펫터(1mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| 피펫(200 &마이크로; L) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| 메스 | MARTOR | 23111 | |
| 소형 와류 발진기 | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| 핀셋 | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright 염색 용액 | Beyotime | C0135-500ml |
참고문헌
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T.
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