Cell Wound Healing Assay의 신뢰성을 개선하기 위해 안정적이고 재현 가능한 cell-free gaps를 자동으로 생성하는 도구

요약

상호 작용 경험 설계 및 사용자 요구 사항 분석의 통합을 통해 재현성, 신뢰성, 실용성, 세포 무결성 및 사용자 경험 측면에서 세포 상처 치유 분석을 향상시키는 혁신적인 세포 스크레이퍼를 소개합니다.

초록

상처 치유 분석에서 세포 이동 측정의 신뢰성은 널리 퍼진 방법론적 불안정성, 즉 팁 기반 분석법으로 인해 자주 훼손됩니다. 이러한 한계를 해결하도록 설계된 혁신적인 기기를 소개합니다. 당사의 새로운 셀 스크레이퍼는 현재 접근 방식을 능가하여 보다 일관되고 안정적인 cell-free 갭을 생성합니다. 반복된 생물학적 실험을 통해 셀 스크레이퍼에 의해 생성된 cell-free gap이 팁 기반 기술에 비해 더 직선적인 가장자리와 균일한 크기 및 모양을 나타낸다는 것이 밝혀졌습니다(p < 0.05). 제품 설계 측면에서 셀 스크레이퍼는 실험실 환경에 적합한 세련된 색상 구성표를 자랑하며 실험 결과의 모니터링을 강화하고 재사용을 위한 오토클레이브를 통한 멸균을 허용합니다. 특히, 처리 후 세포 스크레이퍼는 세포 생존율과 증식에 미치는 영향이 미미하다는 것을 보여줍니다(각각 97.31% 및 24.41%). 반대로, 팁 기반 방법은 세포 생존율(91.37%)과 증식률(18.79%)이 낮습니다. 이 연구는 세포 스크레이퍼를 세포 생존력을 보존하면서 재현 가능한 cell-free gaps를 생성할 수 있는 새롭고 재사용 가능한 장치로 제시하여 기존 기술에 비해 상처 치유 분석의 신뢰성을 높입니다.

서론

종양은 선택적 성장 이점, 대사 재배선 및 면역 조절과 같은 뚜렷한 특징이 있으며, 이 모든 특징은 종양 세포의 중요한 악성 행동인 세포 이동을 향상시키는 데 흥미롭게 기여합니다. 이 특징은 원발성 종양의 원격 전이에 직접적인 영향을 미쳐 환자 ^1,2,3의 장기 생존을 손상시킵니다. 선택적 성장의 이점은 암세포가 정상 세포를 능가할 수 있도록 하며, 대사 재배선은 에너지 경로를 변경하여 이러한 빠른 증식을 지원합니다. 동시에 면역 조절은 종양이 신체의 방어를 회피할 수 있도록 합니다. 여러 연구에 따르면 세포 이동이 활발하게 진행된 결과인 폐 전이가 다양한 암 환자의 사망으로 이어지는 말기 질환임을 보여주며 이 문제의 심각성을 강조하고 있다⁴. 예를 들어, 유방암⁵, 자궁경부암⁴, 골육종⁶이 각각 20%, 9%, 30%를 차지한다. 따라서 종양 세포 이동을 평가하는 것은 현재 종양학 연구의 필수 요소가 되었으며, 종양 진행의 다면적 특성을 더욱 강조합니다.

세포 상처 치유 분석은 체외 세포 이동을 측정하기 위한 사용하기 쉬운 방법으로, 종양학 연구에서 자주 사용됩니다⁷. 대부분의 실험자는 피펫 팁을 사용하여 수동으로 세포 상처를 만듭니다⁸. 이러한 방법은 세포 상처를 빠르고 편리하게 형성할 수 있지만, 세포 이동을 평가하기 위한 재현성 및 정확성에 영향을 미치는 많은 제한 사항이 여전히 있습니다. 첫째, 피펫 팁을 사용하여 수동으로 스크래치를 만드는 것은 작업자의 작동 각도, 힘 및 속도에 큰 영향을 받아 분석법의 반복성에 영향을 미칩니다⁸. 둘째, 팁에서 생성된 셀 결함은 일반적으로 가장자리가 직선이 아닌 들쭉날쭉한 가장자리를 가지는데, 이는 피펫 팁이 특정 탄성을 가진 플라스틱 제품이기 때문입니다⁹. 일부 연구에서는 세포 증식 범위를 제한하기 위해 조립식 배양 삽입물을 세포 배양 플레이트에 직접 배치하여 상처를 발생시킨다¹⁰. 이 접근 방식은 들쭉날쭉한 가장자리 및 재현성과 같은 팁 기반 방법의 제한을 우회합니다. 그러나 생체적합성 물질을 사용하더라도 세포와의 임베딩의 장기적인 공존은 여전히 세포 성장에 영향을 미칩니다¹¹. 더욱이, 임베딩은 또한 접촉 제한(¹²)으로 인해 변연 영역에서 세포 후성유전학적 변화를 일으킬 수 있다. 또한 생체적합성 재료로 생산된 접점 삽입물은 비용이 많이 들고 재사용이 어려워 실현 가능성이 제한적이다¹³. 따라서 in vitro 세포 이동을 쉽게 정량화하기 위해 새롭고 재현 가능하며 실용적인 도구가 필요합니다.

이 방법의 주요 목표는 종양학 연구에서 체외 세포 이동을 정량화하기 위한 혁신적인 도구를 도입하여 기존 기술의 한계를 해결하고 세포 이동 평가의 재현성과 정확성을 향상시키는 것입니다.

이 기술 개발의 근거는 종양학에서 종양 세포 이동을 평가하는 것이 매우 중요하다는 데 있습니다. 종양은 선택적 성장 이점, 대사 재배선 및 면역 조절을 포함한 독특한 특징을 나타내며, 모두 암 악성 종양의 근본적인 측면인 세포 이동을 향상시키는 데 기여합니다. 이 방법은 세포 이동을 연구하는 보다 신뢰할 수 있는 수단을 제공하여 종양 행동에 대한 더 깊은 이해에 기여하는 것을 목표로 합니다.

이 방법은 기존 기술에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 수동 스크래치 분석은 작업자에 따른 간섭으로 어려움을 겪을 수 있으며, 배양 삽입물은 세포 성장과 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있습니다. 대조적으로, 이 방법은 향상된 반복성, 정확성 및 실용성을 제공하여 종양학 연구에서 체외 세포 이동을 측정하기 위한 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다. 이는 다양한 암 유형에서 세포 이동을 연구하기 위한 신뢰할 수 있고 접근 가능한 도구에 대한 중요한 필요성을 해결하여 이 분야에 귀중한 추가 기능을 제공합니다.

프로토콜

모든 참가자가 충분한 서면 동의서를 제공했습니다. 본 연구에는 동물 또는 인간 조직 샘플이 포함되지 않았기 때문에 윤리 승인이 적용되지 않았습니다.

1. 사용자 커뮤니티의 요구 사항 조사

1. 세포 상처 치유 분석을 연구하는 생물학자/실험자에게 설문지를 전달합니다. 완성된 설문지를 수집하여 연구에 사용합니다. 이 연구를 위해 2021년 10월 12일부터 2022년 2월 3일까지 100명의 생물학자에게 100개의 설문지가 전달되었습니다. 응답률은 97%였습니다.
2. 응답자들에게 세포 긁기 실험 중 어떤 것이 가장 신경이 쓰였는지 묻는 질문에 답하도록 요청하세요. 그리고 셀 스크래칭을 수행하는 데 어떤 도구가 사용되었습니까? 하위 질문과 함께 다음 질문을 따라 원인을 추적하십시오.
3. 세포 상처 치유 실험에서 피펫 팁 및 세포 배양 삽입물과 같은 도구에 대한 실험자의 인식을 조사합니다. 설문지 섹션^14,15의 래더링 기법을 기반으로 한 평균-끝-사슬 이론을 사용하여 다른 도구보다 한 도구를 선택하는 이유를 이해하고 수집합니다.
   참고: 사다리 방법은 두 가지 유형으로 나뉩니다: 심층 인터뷰가 있는 부드러운 사다리 방법과 설문지 또는 종이와 연필 퀴즈를 포함하는 하드 사다리 방법¹⁶. 하드 래더링 방법은 이 연구에서 사용된 주요 기술이었습니다. 평균-최종사슬 이론(Means-end-chain theory)은 대상 사용자가 보유한 명시적 지식은 피상적이고 구체적인 반면, 암묵적 지식은 깊고 추상적이라고 제안한다 17,18,19.

2. 설계 및 3차원 모델링

1. 이전 설문지 설문조사에서 수집한 인사이트를 바탕으로 스케치를 그리고 디자인 프로세스를 시작합니다. 이 예비 스케치를 기본 청사진으로 사용합니다.
   1. 모델링 소프트웨어에서 Dim, DimRadius 및 DimDiameter 기능을 적용하여 각 구성요소의 치수와 레이아웃을 자세히 설명합니다.
   2. 실제 6웰 플레이트에서 0.02mm의 정밀도로 버니어 캘리퍼로 측정을 수행하여 셀 스크레이퍼의 최종 치수를 확인합니다. 길이 42.1mm, 너비 42.1mm, 높이 18.5mm인지 확인합니다. 설계 단계의 세부 사항, 특히 제품 높이와 웰의 적합성에 주의를 기울여 보다 원활한 조립을 용이하게 하십시오.
2. 3차원 모델을 구성하고 렌더링합니다.
   1. 기본 모델을 생성하여 소프트웨어에서 3D 설계를 시작합니다. 스트레칭을 위한 ExtrudeCrv 및 디자인 형성을 위한 Loft 와 같은 버튼을 클릭합니다. 모델을 정련한 다음 FilletEdge 를 클릭하여 가장자리를 매끄럽게 만듭니다.
      참고: 사용된 다른 기능 버튼은 다음과 같습니다. Lines - 직선 세그먼트를 그리려면, Polylines - 여러 세그먼트로 구성된 연속선을 만들려면, Rectangles - 직사각형 모양을 그리려면, Circles - 원형 모양을 그리려면, Arcs - 호 또는 타원형 모양을 그리려면, Points - 단일 포인트 마커를 배치하기 위해, Text - 텍스트 레이블을 추가하려면, Dimensions - 측정 된 치수를 모델에 추가하려면, Array - 객체의 복사된 패턴을 생성하려면, 회전 - 객체를 원하는 각도로 회전합니다. 이동 - 객체를 새 위치로 이동합니다. Scale - 개체의 크기를 더 크거나 작게 조정합니다. Trim/Extend - 다른 형상에 맞게 개체를 자르거나 확장합니다. Boolean Union/Difference/Intersection - 객체의 교차점을 결합하거나 빼거나 찾습니다. Layers - 다른 레이어에 객체를 구성하려면, 렌더(Render ) - 재질 및 조명과 함께 렌더링된 뷰를 생성하고 내보내기(Export ) - 모델 형상을 다른 파일 형식으로 내보냅니다.
   2. 모델을 3D 렌더링 소프트웨어로 가져옵니다. 플라스틱, 스펀지, 강철을 포함한 재료를 적용한 다음 사실적인 렌더링을 위해 조명을 조정합니다.
      참고: 기능 버튼의 일반화된 목록에는 다음이 포함됩니다. Drag & Drop - 라이브러리에서 재료를 끌어다 실시간 보기에서 원하는 구성 요소에 놓아 부품 또는 모델에 직접 재료를 적용하려면, Right-click - 라이브러리에서 재료를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하면 일반적으로 다음과 같은 옵션이 표시됩니다. Apply to Selection - 실시간 보기에서 선택한 부품에 재료를 적용합니다. 재질 편집 - 재질 속성을 조정합니다. Material Properties (After selecting a material) - 색상, 거칠기, 굴절률 및 기타 속성과 같은 재료의 특정 속성에 액세스하고 수정합니다. Search Bar(검색 창) - 라이브러리에서 재료의 이름 또는 관련 키워드를 입력하여 자료를 빠르게 찾습니다. Categories/Folders 카테고리/폴더 - 금속, 플라스틱, 유리 등과 같은 재료의 다양한 카테고리 또는 폴더를 탐색합니다. Add to Favorites(즐겨찾기에 추가 ) - 향후 세션에서 쉽게 접근할 수 있도록 특정 자료를 즐겨찾기로 표시합니다. 단축키 - 일부 작업은 단축키를 통해 액세스할 수 있습니다. 예를 들어, M은 일반적으로 선택한 부품의 재질 속성을 빠르게 불러오는 단축키입니다.
   3. 마지막으로, 사진 및 디자인 소프트웨어에서 이미지의 대비(+56)와 채도(생동감 +19, 채도 +7)를 향상시키고, 컨텍스트에 맞는 배경 요소(텍스트 정보 및 흰색에서 밝은 회색 그라데이션 배경까지의 색상)를 추가하여 고품질의 사실적인 제품 표현을 보장합니다.
      1. Image > Adjustments, Brightness/Contrast를 사용하여 이미지의 대비를 조정합니다. Image > Hue/Saturation을 사용하여 이미지의 채도 수준을 수정합니다. 텍스트 도구(T 아이콘)를 사용하여 이미지에 텍스트 정보를 추가합니다.
         참고: 기능 버튼의 일반화된 목록에는 Ellipse Tool (U) - To draw dots/circles(타원 도구(U) - 점/원을 그리려면)이 포함됩니다. 도구를 설정하여 도형을 그리고, 원하는 채우기 색상을 선택한 다음, 클릭하고 드래그하여(완벽한 원을 유지하려면 Shift 키를 누른 상태) 점을 만듭니다. Line Tool (U) - 이미지에 직선을 그립니다. 도구를 선택하고 원하는 선 너비를 설정한 다음 클릭하고 드래그하여 선을 그립니다. 브러시 도구 (B) - 점과 선을 그리는 다른 방법입니다. 브러시 크기와 모양을 선택한 다음 클릭(점의 경우)하거나 클릭하고 드래그(선의 경우)합니다.
3. 3차원 모델을 완성한 후, 연삭 및 조립 방법⁽20,21,22)을 통해 셀 스크레이퍼의 제조를 진행한다.

3. 생산

1. 현재 연구에서 CMF(Color, Materials, Finish) 이론을 사용하여 셀 스크레이퍼의 프로토타입을 설계합니다. CMF 이론은 과학 연구에서 설계 방법론으로 사용됩니다. 제품 유용성을 향상시키고, 사용자 인식을 형성하며, 재료 선택을 지시합니다(23,24,25).
   1. Black 6 C, Cool Gray 6 C 및 11-0601TPG^26,27을 포함한 표준 색상 시스템에서 셀 스크레이퍼에 사용할 색상을 선택합니다.
   2. 실험실 표준을 충족하는 셀 스크레이퍼를 제작하려면 폴리프로필렌(PP), 스폰지 및 고탄소강을 포함한 적절한 재료를 선택하십시오. 물리적 프로토 타입을 제작하려면 3D 프린터를 사용하여 구조적 프레임 워크를 제작하십시오. 그런 다음 커넥터 또는 접착제를 사용하여 스크레이퍼 조립을 완료합니다.
      알림: 셀 스크레이퍼의 물리적 제품을 준비하려면 필요한 재료를 갈고 조립하십시오. 안전하고 효과적인 최종 제품을 보장하기 위해 전체 공정에서 안전 프로토콜을 따라야 합니다.
   3. 절단, 연삭, 연마, 스탬핑 또는 기타 기술이 포함될 수 있는 마무리 공정으로 이동합니다. 중간 입자, 120방 사포를 사용하여 모델을 샌딩하여 거친 가장자리를 제거하는 것으로 시작합니다.
   4. 그런 다음 미세한 220방 사포로 매끄러운 표면을 얻습니다.
   5. 표면을 매끄럽게 하기 위한 포스트 샌딩, 플러그인 또는 내장 커넥터가 올바르게 일치하는지 확인합니다.
   6. 커넥터(고정 로드)를 사용하여 슬라이드 I과 II를 단단히 결합하여 셀 스크레이퍼의 견고하고 내구성 있는 조립을 보장합니다. 기계적 체결과 접착 본딩의 조합을 통해 셀 스크레이퍼의 최종 고정 형태를 달성합니다. 패스너, 특히 장붓 구멍 및 장부 구조를 사용하여 기계적 힘을 통해 부품을 함께 고정합니다. 또한 어셈블리의 강도를 향상시키려면 접착제(접착제)를 도포하여 구성 요소를 더 접착합니다.
   7. 스크레이퍼를 121.3°C에서 30분 동안 고압멸균하여 원래 모양과 물리적 특성을 유지하는지 확인합니다.

4. 세포 배양

1. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 최소 필수 배지에서 HOS 세포를 성장시킵니다. 37 ° C에서 5 % CO₂로 배양합니다.
2. 2일마다 배양 배지를 교체하십시오.
3. 세포 성장이 80% 밀도를 초과하면 0.25% EDTA와 함께 1mL의 트립신을 추가하고 60초 동안 분해합니다. 그 후, 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하여 계대 배양합니다. 상층액을 제거하고 배양 배지를 추가하여 웰당 5 x 10⁴ 세포의 최종 농도를 얻습니다. 세포 계수를 위해 자동화된 세포 카운터를 사용하십시오.

5. 셀 스크레이퍼의 셀 상처 가능성 평가 및 팁 기반 방법

1. 상처에 대한 모든 재료를 준비하고 30 분 동안 노출시켜 자외선으로 살균하십시오.
2. 멸균 후 셀 스크레이퍼 방법 또는 팁 기반 방법을 사용하여 웰당 5 x 10⁴ 셀의 농도로 6웰 플레이트에 100% 융합 HOS 세포를 감습니다.
   1. 팁 기반 방법의 경우 100μL 팁을 사용하여 수평 방향으로 1개의 스트로크와 수직 방향으로 다른 스트로크를 가진 매체가 포함된 셀을 가로질러 드래그합니다.
   2. 셀 스크레이퍼 방법의 경우 스크레이퍼 프로토 타입을 웰 중 하나에 넣고 핀셋을 사용하여 부드럽게 한 번 누릅니다. 세포가 상처를 입었습니다. 각 상처 입히기 실험을 세 번에 걸쳐 수행하십시오.
3. 디지털 현미경 시스템과 이미징 소프트웨어를 사용하여 모든 세포 상처를 분석합니다.

6. 세포 생존력 및 세포 증식 측정

1. CCK-8 Kit에 제공된 프로토콜에 따라 모든 세포 생존도 분석을 수행합니다.
2. CCK-8 용액으로 37°C에서 2시간 동안 세포를 배양한 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 정량화합니다.
3. 5-ethynyl-20-deoxyuridine(EdU) 통합 분석을 설계하여 DNA 복제를 정확하게 정량화하고 세포 증식 비율을 직접 정량화할 수 있습니다. 이전 간행물²⁸에 설명된 프로토콜에 따라 EdU 분석을 사용하여 세포 증식에 대한 세포 상처를 생성하는 다양한 방법의 영향을 결정합니다.
4. 세포를 염색하고 디지털 현미경 시스템을 사용하여 이미지화합니다. 각 실험이 세 번에 걸쳐 수행되어야 합니다.

결과

세포 상처를 생성하는 도구에 대한 사용자 요구 사항 분석
세포 상처를 생성하는 현재의 실험 방법은 생물학적 재현성, 견고성, 경제적 소비 및 세포 상처 치유 분석의 사용자 경험을 손상시키는 많은 문제를 해결하기 위해 추가적인 개선이 필요합니다. 우리는 설문지²⁹ 를 통해 생체 실험에 관련된 사용자의 요구 사항을 분석하기 위해 하드 래더링 방법을 활용했습니다(그림 1A). 설문지에 포함된 이름이나 같은 정보는 개인 정보를 보호하기 위해 익명으로 처리되었습니다. 설문지의 세부 사항은 표 1에 나와 있습니다. 100명을 대상으로 한 6주간의 설문조사 동안 97개의 완전히 작성된 설문지가 접수되었으며 3개의 의심스럽고 유효하지 않은 설문지는 제외되었습니다. 응답률은 97.00%였다.

그 결과, 세포 상처 치유 분석에서 가장 골치 아픈 문제는 톱니 모양의 가장자리(직선이 아님)와 불안정한 상처 너비 또는 부위였으며 각각 55.67%와 29.90%를 차지했습니다. 이는 각각 3.09%, 5.15%, 6.19%로 세포 성장률, 세포 오염 및 기타 옵션이 낮은 경우보다 유의하게 높았습니다(p < 0.001, 그림 1B). 상처를 만들기 위한 도구 선택과 관련하여, 피펫 팁의 사용이 세포 배양 삽입물보다 훨씬 더 일반적이었습니다(그림 1C). 이는 주로 세포 배양 삽입물이 다소 비싸고 재사용할 수 없는 반면(그림 1D), 피펫 팁은 저렴하고 실험 재현성(6.59%)과 세포 생존율(20.88%, 그림 1E)을 보여주기 때문입니다. 중요한 것은 최대 69.23%의 사용자가 세포 배양 인서트의 가격이 예산을 초과했다고 주장했다는 것입니다(그림 1D). 반면, 세포 배양 삽입물을 선택한 피험자는 6명에 불과했으며, 16.67%만이 가격이 수용 가능하다고 생각했습니다(그림 1F). 마지막으로, 세포 상처를 생성하는 혁신적인 도구에 대해서는 86.60%가 낙관적인 반면, 내키지 않는 사용자는 더 적었습니다(4.12%, 그림 1G).

그 후, 사용자가 시급히 필요로 하는 제품 기능을 해부하였다 30,31,32. 이러한 특징에는 직선 상처, 안정적인 상처 너비 및 면적, 높은 재현성 및 수용 가능한 가격이 포함되었습니다. 이에 따라 후속 설계 활동이 수행되었습니다.

셀 스크레이퍼 개발에 사용되는 요소 및 재료를 설계하기로 결정
위의 데이터는 일상적인 생물학 연구에서 구현되는 실험실 용품은 세포 오염을 피하기 위해 엄격하게 멸균되어야 함을 보여줍니다³³. 따라서 제안된 셀 스크레이퍼는 멸균되어야 합니다. 일회용 도구는 에틸렌 옥사이드로 살균 할 수 있지만 실험 비용은 필연적으로 증가합니다 34,35,36. 따라서 일회용 재료 대신 고압 증기 멸균(121.3°C)에 대한 내성이 뛰어난 재사용 가능한 재료로 셀 스크레이퍼를 설계하여 다양한 경우에 적용할 때 비용을 절감하고 유연성을 높일 것을 제안합니다³⁷. 이러한 요구 사항을 충족하려면 셀 스크레이퍼를 구성하는 데 사용되는 재료에 열, 고압 및 수증기 부식에 대한 내성을 비롯한 특정 물리적 및 화학적 특성이 있어야 합니다.

셀 스크레이퍼의 의도된 사용을 위해서는 가장자리를 직선으로 감는 것과 같은 기본 기능을 충족하는 것 외에도 매력적인 디자인과 색상이 있어야 합니다. 모델링 측면에서, 대상 및 응용 분야를 고려할 때 전반적인 스타일은 실험실에 적합해야 합니다. 외관이 너무 과시적이어서는 안 되며, 인원이 실험 진행 상황을 관찰하는 데 방해가 되어서는 안 된다. 또한, 그 크기는 6웰 플레이트에 적합해야 하며, 표면에는 핀셋이 안정적으로 집어낼 수 있도록 돌출부가 있어야 합니다.

디자인에서 CMF는 미학과 사용자 경험에 영향을 미치는 제품 디자인의 중요한 측면입니다. 색상 선택은 정서적 반응에 영향을 미치고, 재료 선택은 기능성과 지속 가능성에 영향을 미치며, 마감은 촉감과 시각적 매력을 결정합니다. CMF 디자이너는 시장 트렌드와 브랜드 아이덴티티를 고려하여 이러한 요소들을 조화시켜 사용자가 공감할 수 있는 제품을 만듭니다.

CMF 이론에 따르면, 색상, 재료, 마감 공정을 포함한 세 가지 중요한 요소가 기능 및 시각 효과에 미치는 영향을 결정하기 위해 고려되었다²⁴. 색상 선택이 먼저 수행되었습니다. 이러한 맥락에서 색상은 외부 광원이나 반사의 영향이 없는 표준 조명 조건에서 물체 또는 물질의 고유한 색상인 고유 색상을 나타냅니다. 6웰 플레이트가 표면이 투명한 PP로 만들어졌다는 점을 감안할 때 짙은 회색이 고유 색상으로 선택되었습니다. 이 선택은 짙은 회색이 다른 색상과 겹쳐질 때 최적의 대비와 가시성을 제공하기 때문에 쉽게 식별하고 작동할 수 있도록 만들어졌습니다. 게다가, 짙은 회색은 다른 색상과 결합할 때 색상 왜곡을 일으킬 가능성이 적으며, 이는 관찰에도 중요합니다. 필수 기능 구성 요소는 검은색으로 더욱 구별되었습니다(그림 2A).

상업용 컬러 매칭 시스템은 다양한 산업 분야에서 널리 수용되고 사용되기 때문에 색상 선택의 표준으로 선택되었습니다. 다양한 매체에서 일관된 색상을 재현할 수 있는 회사의 능력에 의존하여 정확하고 일관된 색상 표현을 보장하는 것이 중요하기 때문에 연구를 위해 선택되었습니다.

재료 선택은 앞서 언급한 설문지 결과를 바탕으로 수행되었습니다. 스크레이퍼의 쉘과 구성 요소는 그림 2B에 표시된 예와 같이 내열성 플라스틱인 폴리프로필렌(PP)으로 제작되어 오토클레이브를 통한 멸균 요구 사항을 충족했습니다. 고탄소강은 고온 및 저온, 내식성 실험실 환경에 안정적이기 때문에 스프링에 적합합니다. 고밀도 스폰지는 완충을 위해 사용되었으며 슬라이드 끝에 배치되었습니다.

마지막으로 마감 공정이 개발되었습니다. 셀 스크레이퍼는 자주 사용되고 쉽게 오염되며 표면 품질이 멸균에 영향을 미치기 때문에 사용자가 오염원을 신속하게 식별하고 처리할 수 있도록 도와주어 청결감을 주기 때문에 셀 스크레이퍼는 매끄럽고 광택이 있는 표면이 선호됩니다. 팁은 배양 접시 바닥의 손상을 방지하기 위해 부분적으로 샌딩되며, 이는 배양 환경에 영향을 미치고 세포 증식을 제한할 수 있다⁽³⁸).

셀 스크레이퍼의 설계 및 프로토 타입
셀 스크레이퍼의 세 가지 프로토 타입은 위에서 언급 한 결과를 기반으로 설계되었습니다 (그림 3A). 연구에 따르면 세포 배양 플레이트 내에서 가장 일반적으로 사용되는 세포 상처는 십자형³⁹로, 직사각형 상처를 사용한 프로토타입 I과 상당히 다릅니다. 따라서 프로토 타입 I은 면제되었습니다 (그림 3A). 프로토타입 II와 III은 모두 십자형 무세포 영역을 만들 수 있었지만 프로토타입 II의 슬라이드 레일은 세포 배양 디스크에 고정하기 어려웠고 인프라도 다소 복잡했습니다(그림 3A). 신중한 논의 끝에 프로토타입 III이 셀 스크레이퍼를 생산하기 위한 최종 모델로 선정되었습니다.

특히, 팁의 모양이 가장자리와 크기 측면에서 셀이 없는 영역에 직접적인 영향을 미칠 수 있다는 점을 감안할 때 세 가지 스케치가 선택을 위해 설계되었습니다. 스케치에는 매우 직선 모서리를 제공할 수 있는 날카로운 상단이 있었습니다. 그러나 팁이 너무 날카롭면 세포 증식을 허용하는 배양 인터페이스가 손상될 수 있습니다(그림 3B). Sketch II는 세포 배양 플레이트의 손상을 방지할 수 있는 정사각형 상단을 제공했습니다. 그러나 배양판의 팁과 하단 사이의 접촉면이 정사각형이기 때문에 사용 시 불안정합니다(그림 3B). Sketch III는 뭉툭하고 둥근 팁을 제공하여 위의 문제를 효과적으로 방지했습니다(그림 3C). 그래서 최종 디자인으로 선정되었습니다.

디자인은 각각 픽서 고정 방법, 내장 쿠션 스펀지, 그립 용이성의 세 가지 측면에서 최적화되었습니다. 첫째, 예상되는 제품 고정 방법에는 좌굴⁴⁰개, 장붓 구멍 및 장부⁴¹개, 피봇팅⁴²개가 포함되었습니다. 실제 생산 비용과 작동성을 고려하여 우물 가장자리를 쉽게 클램핑할 수 있도록 십자형 정착액 아래에 발톱을 설계했습니다. 또한 세포 스크래치 치유 테스트에서는 슬라이드의 고정된 길이와 경도로 인해 끝 부분에 닿은 후 팁이 튕겨 나오는 것을 관찰했으며, 이는 스크래치 상태에 영향을 미쳤습니다. 따라서 슬라이드 끝에 쿠션 스폰지를 추가하여 팁의 움직임을 안정화했습니다. (그림 3A,C). 마지막으로, 핀셋 그립을 용이하게 하기 위해 돌출부에 표면 함몰부가 추가되었습니다.

3D 설계 소프트웨어를 사용하여 3차원 모델을 추가로 구축했습니다. 렌더링은 그림 4A에 나와 있습니다. 폭발 플롯은 셀 스크레이퍼의 상세한 내부 구조를 정교하게 설명하며, 이는 위에서 논의한 필수 특성을 보여줍니다(그림 4B). 또한 팁과 직선 모서리의 부드러운 슬라이딩 목표를 달성하기 위해 내부 기계적 동력 전달 구조를 채택했습니다. 셀 스크레이퍼의 전체 기능 단위는 제어 부분으로 구성됩니다. 실제 작업에서는 셀 스크레이퍼 내부의 링키지 레버가 상단 버튼과 연결되며, 압력을 가하여 엔드 버클을 만든 후 엔드가 아래쪽으로 움직입니다. 슬라이드 내부의 스프링이 해제되어 팁을 밀어 움직입니다. 마지막으로, 좁은 슬릿이 있는 스펀지에서 멈춰 긁기를 완료한 다음 다시 사용하면 재설정되도록 전환됩니다(그림 5A). 또한 학습의 용이성과 편리한 작동은 생물학자가 제품 품질을 측정하는 기준입니다. 따라서 제품의 외관 디자인을 위해 표면 레이아웃은 대칭 및 깔끔함^{원칙 43,44}을 따랐으며 검정색, 흰색 및 회색의 다양한 음영을 통해 서로 다른 구성 요소를 구별하고 강조했습니다(그림 5A).

셀 스크레이퍼는 실제 사용에서 팁 스크래칭 방법보다 우수합니다.
셀 스크레이퍼의 물리적 생성물은 연삭 및 조립 방법을 사용하여 제조되었습니다(그림 5B). 예상대로 셀 스크레이퍼는 6웰 플레이트와 훌륭하게 통합되었으며 상부 십자형 홀더가 플레이트 가장자리에 밀착되어 강력한 고정을 제공합니다(그림 5C). 또한 팁이 6웰 플레이트의 바닥에 정확하게 맞아 cell-free 영역의 원활한 생성을 용이하게 합니다. 마지막으로, 셀 스크레이퍼를 고압멸균하여 재사용 가능한지 테스트했습니다. 그림 5D에서 볼 수 있듯이 현재의 셀 스크레이퍼는 121.3°C에서 30분 동안 고압멸균한 후에도 원래의 모양과 물리적 성능을 유지했습니다.

셀 스크레이퍼는 벤치마크 테스트에서 기존 셀 상처 생성 방법을 능가했습니다. 반복된 테스트 후, 셀 스크래처는 상처 준비에서 높은 안정성과 재현성을 보였으며, 각 상처 면적과 거의 직선 가장자리의 낮은 변동을 나타냈으며, cell-free area의 표준 편차는 483.73이고 직선 가장자리까지의 편차는 5041.33 ± 2420.00이었습니다. 대조적으로, 피펫 팁에 의해 준비된 각 상처의 면적은 3905.80의 cell-free area의 표준 편차와 19562.33 ± 1068.39의 직선 가장자리 편차로 더 높은 변동을 보였습니다(그림 6A-C).

마지막으로, 세포 상처 후 세포 생존력에 미치는 영향을 평가했습니다(그림 6D). 그 결과, 세포 상처 완료 후 12시간 후에 세포 생존율이 팁 그룹보다 세포 스크레이퍼 그룹에서 약간 그러나 유의하게 더 높았다는 것을 보여주었습니다. EdU 분석은 이러한 결과를 더욱 확인하고 세포 증식, 즉 DNA 복제에 대한 다양한 세포 상처 준비 방법의 영향을 명확히 하기 위해 수행되었습니다. EdU 분석 결과에 따르면 12시간 후 세포 스크레이퍼 그룹(24.41% ± 0.48)에서 증식 세포의 비율이 팁 방법(18.79% ± 1.46)보다 훨씬 높았습니다(그림 6E,F).

이러한 데이터는 현재의 세포 상처 생성기가 안정성과 생물학적 재현성 측면에서 세포 상처를 만드는 현재의 방법을 능가한다는 것을 강력하게 입증했습니다. 세포 생존력과 증식에 미치는 영향은 적었습니다. 세포 상처 생성기의 이러한 모든 놀라운 장점은 결과 데이터의 신뢰성과 반복성을 보장함으로써 현재 세포 상처 분석을 개선할 수 있는 잠재력을 확인시켜 주었습니다.

그림 1: 사용자가 분석을 요구합니다. (A) Sankey plot은 실험자를 위한 설문지 기반 조사의 워크플로우를 제시합니다. (B)부터 (G)까지는, 1번부터 6번까지의 질문지를 포함한 설문지의 결과를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 색상과 재료가 사용된 제품 디자인. (A) 색상 선택. (B) 생물학 실험에 사용되는 오토클레이브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 세부 구조의 제품 설계. (A) 셀 스크레이퍼의 세 가지 프로토타입 후보. (B) 팁 디자인의 세 가지 스케치. (C) 선택한 프로토타입 III의 전체 설계와 물리적 및 공간적 매개변수를 보여주는 3-뷰 도면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 렌더링된 3차원 모델 및 내부 구조 표시. (A) 3차원 모델의 렌더링. (B) 제안된 셀 스크레이퍼의 내부 구조를 보여주는 폭발 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 셀 스크레이퍼의 작동 메커니즘. (A) 스케치는 셀 스크레이퍼의 작동 방식을 보여줍니다. (B) 셀 스크레이퍼의 물리적 생성물. (C) 셀 스크레이퍼는 6웰 플레이트에 맞습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 셀 스크레이퍼의 실험적 검증. (A) 다양한 방법에 의해 생성된 세포 상처 및 이들의 그룹화된 비교 결과를 (B) 및 (C)에 표시하였고, 눈금 막대는 100μm이며, (D) 세포 생존율 결과. (E) 및 (F) Edu 분석 결과, 스케일 바는 50μm입니다. 통계적 평가를 위해 그룹 비교를 위해 t-검정을 수행했으며 위양성 결과를 피하기 위해 원래 p-값을 Holm-Bonferroni 검정으로 조정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

I) 다음 중 세포 긁기 실험에서 가장 문제가 되는 문제는 무엇입니까?

A) 직선 모서리 없음

B) 불안정한 너비

C) 느린 증식

D) 세포 오염

E) 기타

II) 세포 상처를 생성하기 위해 어떤 도구를 사용합니까?

A) 피펫 팁(질문 III으로 전환)

B) 세포 배양 삽입물(질문 IV-V로 전환)

III) 세포 배양 삽입물을 선택하지 않으시겠습니까?

A) 세포 생존력

B) 재사용 불가

C) 비용

D) 기타

IV) 세포 배양 삽입물을 선택한 이유는 무엇입니까?

A) 비용

B) 반복성

C) 기타

V) 세포 배양 삽입물에서 가장 심각한 문제는 무엇이라고 생각하십니까?

A) 셀 상태

B) 재사용 불가

C) 비싸다

D) 기타

E) 만족

VI) 저렴하고 재사용 가능하며(오토클레이브 가능), 재현성이 높은 스크래칭 도구가 있다면 얼마나 구입하고 사용할 의향이 있습니까?

A) 매우 기꺼이

B) 기꺼이(Willing

C) 확실하지 않음

D) 내키지 않음

표 1: 이 연구에 사용된 설문지는 생물학자가 세포 상처 치유 분석 중에 직면하는 상황을 이해하기 위한 6개의 질문으로 구성되어 있습니다.

토론

본 연구는 세포 상처 치유 분석을 위한 자동 기계화 도구를 개발하는 것을 목표로 했습니다. 우리가 아는 한, 이것은 기계화 된 구동 구조를 적용하여 원 클릭 방식으로 세포 상처를 자동으로 생성하려는 첫 번째 시도를 나타냅니다. 이를 통해 낮은 재현성과 불안정한 스크래치 상태와 같은 전통적인 팁 기반 방법의 단점을 해결하는 것을 목표로 합니다. 긍정적인 결과와 사용자 커뮤니티의 고무적인 피드백을 바탕으로 세포 스크레이퍼는 실험자에게 세포 상처를 생성하기 위한 효율적이고 안정적인 대안을 제공하여 실험 분석 결과의 신뢰 수준을 크게 향상시킬 것으로 기대됩니다.

현재 셀 스크레이퍼의 사용을 위해 사용자는 1) 팁 기반 방법과 같은 기존 방법과 유사한 셀 프리 갭을 생성하기 위해 보류 중인 셀을 준비해야 합니다(즉, 주어진 밀도에서 6웰 플레이트에 셀을 파종); 2) 셀룰러 수렴률이 90%> 도달할 때까지 기다립니다. 3) 멸균 세포 스크레이퍼를 플레이트의 웰에 넣고 그림 5와 같이 버튼을 클릭하면 1-2초 이내에 세포가 없는 틈이 자동으로 생성됩니다.

세포 상처 치유 분석은 세포 이동 능력을 측정하기 위해 널리 사용되어 왔습니다. 일반적으로 실험자는 피펫 팁을 사용하여 세포 상처를 만듭니다. 예를 들어, Tariq et al.은 세포 이동 능력을 평가하기 위해 피펫 팁을 사용하여 세포 상처를 생성했습니다(⁴⁵); 우연의 일치가 아니라, Rahimi et al.은 PC3 세포⁴⁶의 이동 능력을 관찰하기 위해 분석에서 피펫 팁을 사용했습니다. 마우스 중간엽 세포 이동 분석에서 Cormier et al.은 또한 피펫 건⁽⁴⁷)을 사용하였다; 피부 세포 이동에 대한 비소의 효과를 입증하기 위해 Pinto et al.은 무엇보다도 수직 스크래핑⁴⁸을 위해 피펫 팁을 사용했습니다.

그러나, 앞서 언급한 바와 같이, 팁을 사용하여 세포 상처를 만드는 것은 가변적인 cell-free area, 들쭉날쭉한 가장자리, 작업자의 힘과 긁힘 각도에 대한 의존성과 같은 몇 가지 문제를 가지고 있어 낮은 재현성을 초래한다⁴⁹. 설문지의 현재 결과는 또한 팁 기반 방법이 특히 가격, 세포 생존율 및 도구 재사용성 측면에서 세포 배양 삽입물에 비해 더 명백한 이점이 있음을 입증했습니다. 또는 셀 인서트는 비용이 너무 많이 들고 재사용하기 어려우며 두 도구 모두 결함이 있습니다. 따라서 사용자 커뮤니티는 일반적으로 낙관적이며 혁신적인 도구를 시도할 의향이 있습니다. 이 연구는 세포 상처 생성을 촉진하고 안정화하기 위해 새로운 cell-free area preparation 도구를 설계하고 개발했습니다.

본 연구의 가장 중요한 기여는 셀 스크레이퍼의 개발 및 실험적 검증에 있습니다. 이전 연구와 비교하여 본 셀 스크레이퍼의 개선 사항에는 다음 세 가지 주요 사항이 포함됩니다. 1) 세포 상처의 안정적이고 편리한 제작. 본 연구는 기존의 팁 기반 방법과 비교하여 본 세포 스크레이퍼로 제조된 세포 상처는 모서리가 직선이고 반복 실험에서 유사한 상처를 생성할 수 있어 세포 상처 치유 실험의 재현성과 신뢰성을 크게 향상시켰다는 것을 보여주었습니다. 2) 현재의 셀 스크레이퍼는 셀 상태에 미치는 영향이 적었습니다. 세포 생존력 및 증식(DNA 증폭)에는 영향을 미치지 않았으며, 이는 팁 기반 방법보다 훨씬 우수했습니다. 따라서 이 세포 스크레이퍼는 일상적인 실험에서 세포 상처 치유 분석에 대한 외부 요인의 영향을 더욱 줄일 수 있을 것으로 기대됩니다. 3) 이 셀 스크레이퍼는 사용자 커뮤니티의 요구와 잘 일치합니다. 이전 설문지 조사 결과에 따르면 새로운 셀 상처 도구에 대한 사용자의 요구 사항은 주로 균일한 스트로크 폭, 높은 재현성, 간단한 조작 절차 및 적당한 가격을 포함하며, 이는 현재 셀 스크레이퍼에서 달성되었습니다. 또한 셀 스크레이퍼는 이 제품의 단순하고 실용적인 디자인 컨셉을 전달하기 위해 뉴트럴 컬러로 디자인되었습니다. 동시에 강한 흑백 대비는 기능적 영역을 효과적으로 강조합니다. 전체적인 스타일은 곡면의 둥근 관절에 의해 형성된 십자형으로, 기존의 상처 형태를 참조하고 제품의 역할을 제안합니다. 작동의 어려움은 작동 및 수동 재설정 기능을 단순화하여 줄어 듭니다. 요약하면, 이 결과는 실험자가 한 번의 클릭으로 자동화되고 강력한 방식으로 세포 스크래치를 준비할 수 있는 유망한 대체 도구를 나타내므로 과학적 결과의 재현성을 향상시킵니다.

이 연구의 한계를 인정해야 한다. 설문지 인터뷰 대상자의 표본 크기는 이 연구의 일반화 가능성을 제한합니다. 따라서 Cell Scrapper를 개선하기 위해 후속 연구에서 샘플 크기를 더욱 확장할 것입니다. 둘째, 이 셀 스크레이처의 성능을 보다 포괄적으로 평가할 수 있도록 더 많은 사용자를 대상으로 잘 계획된 연구에 셀 스크래처를 포함해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CCK-8 Kit	Beyotime Company, 중국	C0037
디지털 현미경 시스템	Olympus	IX81
태아 소 혈청	Gibco, 미국	16000044
HOS	프로셀 생명과학 & Technology Co., Ltd	CL-0360
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	버전 6.0
KeyShot	Luxion	버전 11.0	3D 렌더링 소프트웨어
마이크로 플레이트 리더	BioTek, 독일어	ELX808
최소 필수 매체	Gibco, 미국	11095080
Pantone 매칭 시스템	Pantone		상업적인 색깔 일치
페니실린 스트렙토 마이신	Beyotime 회사, 중국	ST488
포토샵	어도비		사진 및 디자인 소프트웨어
코뿔소 3D	로버트 맥닐 & Associates	버전 7.0	3D 설계 소프트웨어
TC20 자동 세포 계수기	Bio-Rad	TC20
Trypsin	Cytiva  HyClone, 미국	SH30042.01