통증 연구를 위한 조산쥐 모델

요약

여기에서는 조기 생쥐 모델을 만들기 위한 간결한 프로토콜을 제시하여 조기 산후 통증 관리에 대한 연구를 촉진합니다. 이 방법은 출산 예정일 3일 전에 제왕절개를 하고, 자궁절제술을 통해 조산아 새끼를 추출하고, 대리모 댐의 생물학적 자손과 통합하는 것입니다.

초록

이 연구는 통증 민감성에 대한 장기적인 영향을 확인하기 위해 조산아에 대한 지속적인 핀찌르기 자극의 결과를 조사합니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 조산 쥐 모델을 사용하여 신생아 핀찌르 자극이 생애 후반기의 통증 역치에 미치는 영향을 조사하는 것이었습니다. 이 모델을 확립함으로써 우리는 조산과 관련된 조기 산후 통증을 이해하고 관리하는 연구를 발전시키는 것을 목표로 합니다. 이 연구의 결과는 기계적 자극에 대한 기준선 임계값은 영향을 받지 않았지만 성체 쥐에서 완전한 Freund's adjuvant(CFA) 주사 후 기계적 과민성이 눈에 띄게 증가했음을 나타냅니다. 흥미롭게도, 수컷 쥐에 비해 암컷 쥐는 염증성 과민증이 높아진 것으로 나타났습니다. 주목할 만한 것은, 모성의 행동, 새끼의 체중, 그리고 자손의 성장 궤적은 자극에 의해 변하지 않았다는 것이다. 신생아의 통증 자극 후 성인기에 변화된 통각 수용 반응의 징후는 감각 처리의 변화와 글루코코르티코이드 수용체의 기능을 나타낼 수 있습니다. 그러나 관련된 근본적인 메커니즘을 이해하고 성인의 미숙아 및 신생아 통증의 결과에 대한 중재를 개발하기 위해 추가 연구가 필요합니다.

서론

신생아 기간 동안 통각 수용성 경로는 상당한 구조적, 기능적 성숙을 겪으며, 조직 손상 및 관련 통증의 존재는 체성 감각 처리의 발달에 깊은 영향을 미칩니다¹.

동물 모델을 활용하면 비인간 동물에 대한 통제된 실험적 조작이 가능하여 신생아 통증이 나중에 행동에 미치는 결과를 더 깊이 이해할 수 있는 동시에 잠재적인 교란 변수를 완화할 수 있습니다 ^2,3. 일반적으로 관찰되는 결과는 신생아 통증이 성인기의 통증 민감도 증가에 미치는 영향입니다 ^2,4,5. 신생아 집중치료실(NICU)에서 신생아 통증은 스트레스의 가장 흔한 원인이며, 조산아는 일반적으로 하루에 평균 10번의 침습적 시술을 받는다⁶. 신생아 집중치료실(NICU)의 미숙아 신생아는 통증, 산모와의 접촉 제한, 청각 자극, 과도한 조명 등 다양한 스트레스 요인에 직면하게 된다 ^7,8,9.

동물 모델의 활용은 이러한 과정과 관련된 기본 메커니즘에 대한 이해를 높이고 이 분야의 새로운 발전을 촉진하는 데 필수적입니다. 특히, 연구에서 미숙아 동물 모델을 사용하는 것은 미숙아에 대한 지식의 폭을 넓히는 데 크게 기여할 수 있으며, 미숙아의 통증 관리 중재에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있다¹⁰.

현재 미숙아를 구체적으로 다루는 설치류 모델은 제한적이며, 이러한 연구의 대부분은 주로 미숙아가 뇌¹¹, 폐 발달¹², 괴사성 장염¹³ 또는 면역 영양 연구¹⁴에 미치는 영향을 조사한다. 그러나 이러한 모델 중 어느 것도 통증 시스템의 성숙을 검사하지 않으며, 통증 시스템은 미숙아의 경우 특히 취약합니다.

조산과 그것이 조기 산후 통증 관리에 미치는 영향은 여전히 중요한 연구 분야입니다. 따라서 본 연구는 조산쥐 모델을 확립하여 문헌에 기여하는 것을 목표로 하였다. 이 모델은 신생아 핀찌르기 자극이 생애 후반기의 통증 역치에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공하여 미숙아 관련 통증에 대한 이해를 향상시킵니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 알페나스 연방대학교(Federal University of Alfenas)의 동물실험윤리위원회(Ethical Committee for Animal Experimentation)에서 채택한 실험동물의 관리 및 사용 가이드(Protocol 32/2016)를 따랐습니다.

1. 동물

1. 알페나스 연방 대학(Federal University of Alfenas)의 중앙 동물 시설(Central Animal Facility)에서 성인 수컷 및 무효 Wistar 암컷 쥐(약 8주령)를 얻습니다.
2. 12:12 h light : dark cycle에서 제어 된 온도 및 습도 조건에서 쥐를 수용하고 물리 치료 동물 시설 학부 (Alfenas 연방 대학)에서 차우와 물을 먹이 십시오.

2. 임신 확인

1. 1개월 동안 매일 아침 8:00에서 9:00 사이에 각 동물 케이지를 실험실로 이송합니다. 질 세척을 수행하려면 0.9% NaCl 용액 10μL가 포함된 플라스틱 피펫을 쥐의 질에 조심스럽게 넣습니다. 깊은 침투를 피하기 위해 얕은 삽입을 확인한 다음 부드럽게 빼내어 질 분비물을 모으십시오.
2. 수집된 질액을 개별 유리 슬라이드에 놓고 동물의 각 케이지에 별도의 슬라이드를 할당합니다.
   1. 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 각 쥐에서 염색되지 않은 물질을 한 방울 떨어뜨립니다. 콘덴서 렌즈를 사용하지 않고 10x 및 40x 대물 렌즈를 사용하여 광학 현미경으로 재료를 검사합니다.
   2. 그 특성에 따라 세 가지 뚜렷한 세포 유형을 식별할 수 있다: 둥글고 유핵화된 상피세포, 핵이 없는 불규칙한 각질화된 세포, 작고 둥근 백혈구¹⁵.
3. 암컷 Wistar 쥐를 강렬한 각질화와 질 박리로 노출시키는데, 이는 발정 주기의 특징이며 수컷 수용성이 증가했음을 나타냅니다. 케이지 당 2 마리의 암컷과 1 마리의 수컷을 배치하여 쥐를 짝짓기하십시오. 질 도말에서 정자와 발정기 세포의 존재를 확인하여 임신 0일을 결정합니다.

3. 임신한 댐과 그 자손의 분류 및 관리

1. 임신 단계에 따라 세 가지 유형의 임신 댐(각각 2개의 댐)을 폐기합니다: 조산, 만삭 및 대리 댐. 임신 22일째에 자연분만을 할 수 있도록 하고, 임신 22일째에 출산할 수 있도록 하고, 임신 댐의 배설물을 임신 그룹에 사용합니다.
2. 임신 19일째에 조산 댐에서 제왕절개를 시행하며, 이는 출산 예정일 3일 전입니다. 조산군을 위해 이 깔짚을 활용하십시오. 이 절차가 어미의 생존에 도움이 되지 않는다는 점을 감안할 때, 조산 댐의 제왕절개 2일 전에 자연 출산한 대리 댐에 조산 새끼를 맡기십시오.
3. 대리모 댐의 새끼를 몇 시간 동안 그녀와 함께 두어 그들의 냄새가 조산 새끼와 섞일 수 있도록 하십시오. 이 기간이 지나면 조산아 새끼를 소개하고 대리모의 원래 새끼를 제거한 후 이소플루란을 고용량으로 흡입하여 희생합니다.
   참고: 이 단계는 대리 댐이 이미 유선에서 우유 생산을 자극하여 조산 새끼를 효과적으로 간호할 수 있는 위치를 잡았는지 확인하는 데 필수적입니다¹⁶.

4. 제왕절개 수술

1. 2% 이소플루란으로 조산 댐을 부분적으로 마취하고 자궁경부 탈구를 사용하여 예상 출산일 3일 전에 안락사시킵니다. 안락사 후에는 자궁절제술을 통해 새끼를 하나씩 추출한다.
2. 하복부 정중선을 3cm 절개한 후 세로 2cm를 자릅니다. 이 절개에서 각 자궁관의 중간 부분에 있는 항간막 경계를 따라 절개합니다.
3. 자궁절제술을 통해 새끼 쥐와 태반을 부드럽게 추출합니다^17,18. 조속히 자손을 하나씩 추출하십시오.

5. 수술 후 관리 및 입양을 위한 새끼 준비

1. 입양 절차를 사용하여 수술한 어미가 수술 절차와 강아지의 성견 행동에 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 통증으로 인해 부적절한 행동을 보이는 것을 방지하십시오.
2. 출생 후 종이 타월을 사용하여 새끼 쥐의 기도를 청소하십시오. 대리 댐에 의한 식인 풍습을 방지하기 위해 새끼 쥐를 목욕시켜 청소하십시오. 새끼 쥐를 28°C의 물로 씻고 말리십시오.
3. 핏자국을 제거하고 가열된 적외선 조명 아래에서 새끼를 페트리 접시에 넣고 호흡이 규칙적이 될 때까지 약 28°C의 온도를 유지합니다.
4. 태반 바로 아래의 탯줄을 자르고 H₂O₂ 에 적신 면을 사용하여 탯줄에서 출혈을 막습니다. 마지막으로, 입양을 위해 위탁 엄마에게 제공하십시오.

6. 수양어머니 상호 작용 및 조산아 입양

1. 각 위탁모는 별도의 플라스틱 케이지에 새끼를 넣으십시오. 양도하기 전에 위탁 손에서 각 용어 강아지를 표시하십시오. 이 표시는 후속 모성 행동 분석에 매우 중요합니다. 입양 과정 전반에 걸쳐 위탁모 케이지의 무결성을 유지하십시오.
2. 처음에는 조산 새끼를 둥지 밖에 두십시오. 이 전략을 통해 대리모는 중립 영역에서 새로운 새끼의 냄새를 인식하고 익숙해질 수 있습니다. 또한 위탁 어미의 새끼 중 하나 또는 두 마리를 선택하여 조산 새끼와 함께 둥지 밖에 놓습니다. 이 혼합은 대리모가 자신의 새끼와 조산아를 모두 수집하도록 유도하여 새로운 새끼를 둥지에 받아들이고 통합하는 것을 촉진합니다.
3. 처음에는 입양한 자손을 생물학적 자손과 섞는다. 효과적인 채택을 확인합니다. 수양어미의 새끼를 둥지에서 꺼내 제물로 바치기¹⁹.
   참고 : 이 연구에서 조산 쥐의 생존 가능성은 100 %였으며 대리 댐에 의해 거부되지 않았습니다.

7. 깔짚 표준화

1. 대리모로 사육된 모든 새끼 그룹에서 수컷 8마리와 암컷 4마리로 한 마리당 새끼 크기를 유지합니다. 표준화 후 남은 새끼 쥐를 희생하십시오.

8. 실험 설계 및 프로토콜 구현

참고: 이 프로토콜의 목적은 다음 실험 절차의 개발을 위해 생존 가능한 조산 새끼를 얻는 것이었습니다.

1. 총 20개의 임산부 댐을 시술에 활용합니다. 그들을 각각 10개의 댐으로 구성된 두 개의 실험 그룹으로 나눕니다.
   1. PND 2에서 PND 15까지의 핀찌르 자극으로 첫 번째 그룹인 PP 그룹의 새끼를 자극합니다.
   2. 두 번째 그룹을 대조군 역할을 하는 CC 그룹으로 지정하고 이 그룹의 새끼는 핀찌르 자극을 받지 않습니다.
   3. 이 기간 동안 댐의 모성 행동과 새끼의 무게를 부지런히 모니터링하십시오.

9. 이유식 후 평가 및 행동 검사

1. PND 22에 자손을 젖을 뗍니다. 성별에 따라 분류하고 약 8주가 될 때까지 각각 최대 4마리를 수용할 수 있는 케이지에 수용합니다.
2. 그 후, 이 동물들은 전자 폰 프레이 테스트를 사용하여 고통스러운 자극에 대한 민감성을 평가합니다. 특히 CFA로 인한 염증으로 인한 통증에 초점을 맞춥니다.
3. 잠재적인 깔짚 관련 영향을 완화하려면 각 실험 그룹의 각 배설물에서 1마리의 수컷 쥐와 1마리의 암컷 쥐를 선택하여 성체가 되는 동안 행동 테스트를 받으십시오.
4. 암컷 자손 쥐의 통각 반응에 대한 호르몬 요인 간섭을 피하기 위해 단일 실험에서 각 동물을 사용하십시오. 특히, 발정 주기의 발정기 동안 암컷에 대한 테스트가 수행되도록 하십시오.

10. 반복적인 신생아 통증 유도

1. 이전 연구에서 설명한 것과 유사한 핀찌르기 기법을 사용하여 반복적인 신생아 통증을 유발합니다²⁰. 출생 후 2일차(PND 2)부터 새끼 쥐에 대해 매일 핀찌르기 자극을 시작하고 PND 15까지 이 연습을 계속합니다.
2. 22G 바늘을 오른쪽 뒷발의 발바닥 중간 부분에 얕은 깊이로 조심스럽게 삽입합니다.
   1. 관통력이 과도한 부상을 입히지 않고 자극하기에 충분한지 확인하십시오. 이 나이에 발을 완전히 통과할 위험을 고려하여 더 깊은 침투를 방지하기 위해 게이지를 보정하십시오.
   2. 출혈이 발생하면 면봉을 사용하여 즉시 출혈을 중지하십시오. 일반적으로 이 개입은 몇 초 동안만 지속됩니다. 자극을 4회 투여하고 각 자극 사이에 2분의 간격을 유지하여 하루에 총 8번 찌릅니다.
3. 산모 분리 및 신생아 처리와 관련된 잠재적인 교란 요인을 최소화하려면 새끼 쥐를 최대 5분 동안 댐에서 분리하십시오. 대조군에 동일한 분리 기간을 적용합니다. 각 자극 세트에 따라 즉시 새끼 쥐를 댐 ^5,21,22로 되돌려 놓으십시오.

11. 모성 행동 평가

1. 산모의 행동을 평가하기 위해, PND 2에서 PND 15까지의 두 실험 그룹(그룹당 n = 10)에서 댐의 행동을 평가한다. 두 세션으로 평가를 수행합니다: 아침에 새끼 쥐에 대한 핀찌르 자극 전(08:00에서 09:30 사이)과 오후 한 번, 새끼 쥐에 대한 핀찌르 자극 후(15:00에서 16:30 사이).
2. 이 세션 동안 각 엄마의 행동을 3분마다 부지런히 관찰하고, 기록하고, 점수를 매겨 하루에 한 학기당 30번의 관찰을 할 수 있습니다. 이는 산모 한 명당 하루에 총 60건의 관찰이 누적되는 것입니다.

12. 모성 및 비모성 행동의 기록

1. 그루밍 또는 핥기(신체 또는 항문생식기 부위), 수유, 새끼 위에 누워서 "담요"와 같은 자세로 아치형 등을 유지하기, 수유하는 동안 등이나 옆으로 수동적으로 누워, 둥지 만들기에 참여, 모성 자기 손질(자기 청소를 통한 가슴 자극 포함)과 같은 행동을 포함하는 모성 행동 매개변수를 기록합니다.
2. 먹이 주기, 케이지 하우징 탐색, 탐험하지 않음, 모성 자기 그루밍의 부재와 같은 행동을 포함한 비모성 행동 매개변수를 문서화합니다.
3. 데이터를 전체 모성 행동과 비모성 행동의 백분율로 제시합니다. 기록된 대상 동작 관측치 수를 총 관측치 수로 나누고 결과에 100 ^5,23,24를 곱합니다.

13. 깔짚 무게 평가

1. 핀찌르기 자극 단계(PND 2-15) 전반에 걸쳐 각각 8개의 깔짚으로 구성된 PP 및 CC 그룹 모두에서 깔짚의 무게를 모니터링합니다.
2. 핀찌르기 자극 단계(PND 2-15) 동안 각각 8개의 깔짚으로 구성된 PP 및 CC 그룹 모두에서 깔짚의 무게를 지속적으로 확인하십시오.

14. 기계적 임계값 테스트

1. 이 실험에서는 PP 및 CC 그룹의 쥐(8주령)에게 각각 100μL의 부피로 식염수 또는 CFA를 주입합니다. 그 후, 기계적 통각과민을 평가하기 위해 검사 15-30분 전에 철망 바닥이 있는 아크릴 케이지(42cm × 24cm × 15cm)에 개별적으로 놓습니다.
2. 테스트에서 0.5mm² 폴리프로필렌 팁(Electronic von Frey)이 장착된 휴대용 힘 변환기를 사용하여 뒷발 굴곡 반사를 유도합니다.
   1. 오른쪽 뒷발의 5개 원위 발 패드 사이에 팁을 점차적으로 적용하고 반응이 관찰될 때까지 압력을 높입니다.
      참고: 발 후퇴가 발생하면 자극이 자동으로 멈추고 그 강도가 문서화됩니다. 테스트는 명확한 움찔 반응과 발 철수로 끝납니다. CFA의 피하 투여는 장기간의 염증을 유발하며, 24 시간에 최고조에 달하고 적어도 7 일 동안 지속된다²⁵.
3. 식염수 또는 CFA⁴ 투여 전과 후 4시간, 7시간, 10시간, 24시간에 동물에 대한 시험을 실시한다. 그램(g) 단위로 측정된 인출 임계값으로 결과를 제시하고 세 가지 측정을 평균하여 계산합니다.
4. 암컷 자손의 통각 수용 반응에서 잠재적인 호르몬 요인의 간섭을 방지하려면 발정 주기의 발정기 동안에만 검사를 수행해야 합니다.

15. 데이터 분석

1. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 표시합니다. 집단 간에 통계적으로 유의한 차이를 식별하려면 모계 대 비모계 매개변수 평가 및 깔짚 무게 평가와 같은 요인을 고려하여 반복 측정과 함께 이원 분산 분석(ANOVA)을 적용합니다.
2. 구체적으로, 모계 매개변수에 대한 PND 및 핀픽 자극을 분석하고 배짚 무게 평가를 위한 von Frey: CFA 및 핀프릭 자극을 분석합니다. 필요한 경우 Bonferroni 테스트를 사용하여 사후 분석을 수행합니다.

결과

이 연구에서는 산모가 신생아 시기에 핀찌르기 실험을 받았는지, 조산아 또는 만삭이었는지에 관계없이 산모와 비모성 행동에 차이가 없었다(그림 1). 조산아의 입양모의 모성 행동과 관련하여, 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)은 PND(산후 일)의 영향은 있었지만 오전 8시에 관찰된 산모의 행동을 평가하는 데 있어 핀찌르기 자극이나 두 요인 간의 상호작용의 영향은 없는 것으로 나타났다[PND factor: F_{(13, 140)} = 6.31, p < 0.001; pinprick stimulus factor: F _{(1, 140)} = 1.04, p = 0.30; 핀단자 자극 x PND 상호 작용 : F _{(13, 140)} = 0.55, p = 0.88; 그림 1A]; 또는 오후 3시 [PND 계수 : F _{(13, 140)} = 16.97, p ...

토론

이 연구에서 우리는 산모의 모성 및 비모성 행동이 신생아 핀찌르기 실험에 영향을 받지 않는 것을 관찰했다. 이러한 경향은 모성이 아닌 행동에까지 확대되었다. 또한, 핀단자 자극 기간 동안 조산아의 체중 증가는 대조군과 핀단자 그룹 간에 유의한 차이가 없었다. 발 철수 역치 분석 결과, 대조군에 비해 핀찌르기 및 CFA 그룹의 수컷과 암컷 새끼 모두 눈에 띄게 감소한 것으로 나타났습니다. 특히 눈에 띄는 것은 대조군/CFA 그룹에 비해 핀찌크/CFA 투여군에서 CFA 주사 후 4시간 후에 발 철수 임계값이 추가로 감소한 관찰이었습니다. 이러한 미묘한 결과는 신생아 핀찌르기 자극이 산모의 행동, 새끼의 체중 증가 및 통각 반응에 미치는 다면적인 효과를 강조하며, 결과를 해석할 때 조산과 만기 조건을 모두 고려하는 것의 중요성을 강조합니다.

통각 수용 반응에 대한 우리의 탐구는 조산아의 반복적인 바늘 찌르기 자극으로 인해 성...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.9% NaCl 솔루션	Concare, 브라질
와이어 그리드 바닥이 있는 아크릴 케이지(42cm × 24cm × 15cm)	Insight Equipamentos, 브라질
Complete Freund's Adjuvant(CFA)	Sigma Aldrich, 브라질
Electronic von Frey,	Insight Equipamentos, 브라질
H2O2(과산화수소)	ACS Cientifica, 브라질
적외선 조명	Carci, 브라질
Isoflurane (2%)	Cristá lia, 브라질
정립 현미경	Nikon, 브라질	ECLIPSE Ei	현미경(10x 및 40x 대물 렌즈 포함)