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방법 논문

아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구를 위한 쥐 뒷다리 이식 모델

2K 조회수

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DOI:

10.3791/65801

⸱

2023년 12월 8일

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

이 논문에서

요약

쥐 뒷다리 이식에서 아킬레스건 삽입의 충돌로 인한 섬유연골 변화를 지속적인 세포 생존력으로 재현하는 맞춤형 실험 플랫폼 및 조직 배양 프로토콜을 제시하여 힘줄 충돌의 역학을 탐구하는 데 적합한 모델을 제공합니다.

초록

뼈에 대한 힘줄 충돌은 횡방향 압축 변형률이 현저하게 상승한 다축 기계적 변형 환경을 생성하며, 이는 글리코사미노글리칸(GAG)이 풍부한 매트릭스의 축적과 콜라겐 네트워크의 리모델링을 특징으로 하는 국부적인 섬유연골 표현형을 유도합니다. 섬유연골은 건강한 힘줄의 충돌 부위에서 정상적인 특징이지만, 과도한 GAG 침착과 콜라겐 네트워크의 무질서는 건병증의 특징입니다. 따라서 충돌은 건병증의 시작과 진행에 중요한 외적 요인으로 임상적으로 인식되고 있습니다. 그럼에도 불구하고 힘줄 충돌의 기저에 있는 기계생물학은 여전히 연구가 부족합니다. 힘줄 충돌에 대한 세포 반응을 밝히기 위한 이전의 노력은 세포에 단축 압축을 적용하고 체외에서 힘줄 외식을 절제했습니다. 그러나 분리된 세포는 기계적 반응에 중요한 3차원 세포외 환경이 부족하며, 시험관 내 및 절제된 외식물 연구 모두 충돌 부위의 해부학적 특징에 따라 생체 내 힘줄 충돌에 의해 생성된 다축 변형 환경을 재현하지 못합니다. 더욱이, 힘줄 충돌의 생체 내 모델은 기계적 변형 환경에 대한 제어가 부족합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구에 적합한 새로운 쥐 뒷다리 이식 모델을 제시합니다. 이 모델은 아킬레스건을 제자리에서 유지하여 국소 해부학적 구조를 보존하고, 수동적으로 적용된 발목 배굴곡 중에 종골에 아킬레스건 삽입이 충돌하여 생성된 다축 변형 환경을 재현하면서 세포를 원래 환경 내에 유지합니다. 이 모델에 필수적인 조직 배양 프로토콜을 설명하고 7일 동안 지속적인 이식 생존 가능성을 설정하는 데이터를 제시합니다. 대표적인 결과는 조직학적 GAG 염색이 향상되고 충돌에 이차적으로 콜라겐 섬유 정렬이 감소했음을 보여주며, 이는 섬유연골 형성 증가를 시사합니다. 이 모델은 다양한 기계적 부하 요법을 조사하는 데 쉽게 적용할 수 있으며 충돌에 대한 반응으로 아킬레스건의 표현형 변화를 중재하는 메커니즘을 식별하기 위해 관심 분자 경로를 조작할 수 있습니다.

서론

아킬레스건과 회전근개 힘줄을 포함한 많은 힘줄은 정상적인 해부학적 위치로 인해 뼈 충돌을 경험합니다1,2,3,4. 힘줄 충돌은 종방향 섬유 축에 횡방향으로 향하는 압축 변형을 생성합니다.5,6,7. 힘줄 충돌 부위는 수축된 둥근 세포(섬유연골세포)가 글리코사미노글리칸(GAG) 함량이 현저히 증가한 무질서한 콜라겐 네트워크 내에 내장되어 있는 독특한 섬유연골 표현형을 보여줍니다2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. 이전 연구에서는 힘줄 충돌에 의해 생성된 이질적인 기계적 환경이 기본 메커니즘은 불분명하지만 큰 응집체 프로테오글리칸, 특히 아그레칸의 침착을 유도하여 이 GAG가 풍부한 매트릭스를 유지한다고 제안합니다1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. 섬유연골은 건강한 힘줄의 충돌 부위에서 정상적인 특징이지만, 과도한 섬유연골 형성과 관련된 비정상적인 프로테오글리칸 대사는 만성적으로 충돌된 힘줄에서 불균형적으로 나타나는 흔하고 쇠약해지는 질병인 건병증의 특징입니다1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. 따라서 힘줄 충돌은 회전근개 질환 및 삽입성 아킬레스 건병증(IAT)을 포함한 가장 흔한 건병증을 유발하는 중요한 외인적 요인으로 임상적으로 인식되고 있습니다50,51,52. 현재 건병증의 치료는 비효율적입니다. 예를 들어, IAT 환자의 약 47%는 보존적 관리 실패 후 외과적 개입이 필요하며, 수술 후 결과는 다양합니다53,54,55,56. 충돌과 건병증 사이의 명백한 관계에도 불구하고, 충돌한 힘줄의 세포가 기계적 환경을 감지하고 반응하는 기계생물학적 메커니즘이 제대로 설명되지 않아 건병증 발병기전에 대한 이해가 모호하고 부적절한 치료가 발생합니다.

외식(Explant) 모델은 힘줄 기계생물학(tendon mechanobiology) 57,58 연구에 유용한 도구이다. 힘줄 충돌의 기계생물학을 이해하기 위한 첫 번째 단계로, 몇몇 선행 연구에서는 세포 또는 절제된 힘줄 외피 27,29,30,31,32,33,34,39에 간단한 단축 압축을 적용한 후 세포 반응을 탐구했습니다. 그러나, 시험관 내 세포에는 균주 전달을 촉진하고, 기계적 변형에 의해 방출되는 중요한 성장 인자와 사이토카인을 격리하며, 기계적 형질도입에 중요한 역할을 하는 국소 접착 복합체를 위한 기질을 제공하는 세포외 및 세포주위 기질이 부족합니다57,59. 또한, in vitro 및 excised explant 연구 모두 in vivo에서 힘줄 충돌에 의해 생성된 다축 기계적 변형 환경을 재현하지 못하며, 이는 충돌 영역 5,6의 해부학적 특징에 의존한다. 충돌된 아킬레스건 삽입의 맥락에서, 여기에는 후종골 윤활낭 및 Kager의 지방 패드60,61,62,63과 같은 주변 조직이 포함됩니다. 반대로, 힘줄 충돌(25,28,36,37,38,64,65,66)의 생체내 모델은 힘줄에 직접 가해지는 하중의 크기 및 빈도에 대한 최소한의 제어를 허용하며, 이는 힘줄 기계생물학을 연구하기 위한 생체내 모델의 잘 알려진 한계이다57,58,67,68,69,70입니다. 생체 내 힘줄 변형률 측정의 어려움을 감안할 때, 이러한 모델 내에서 생성된 내부 변형률 환경은 종종 제대로 특성화되지 않습니다.

이 원고에서는 전체 쥐 뒷다리 외식에서 종골에 대한 아킬레스건 삽입의 충돌을 재현하는 맞춤형 실험 플랫폼을 제시하며, 이 조직 배양 프로토콜과 짝을 이룰 때 식생 배양에서 7일 동안 생존력을 유지하고 힘줄 충돌의 생물학적 후유증을 연구할 수 있습니다. 이 플랫폼은 3D 프린팅된 폴리락트산(PLA) 베이스를 기반으로 제작되어 그립 부착 및 3D 프린팅된 PLA 체적 감소 인서트를 부착할 수 있는 기반을 제공합니다. 이 그립은 뒷다리의 꼬리 쪽이 위쪽을 향하도록 위쪽 다리와 무릎 근위부를 고정하는 데 사용되며, 초음파 프로브 또는 도립 현미경을 사용하여 위에서 아킬레스건을 이미지화할 수 있습니다(그림 1A). 부피 감소 인서트는 베이스의 트랙을 따라 미끄러지며 필요한 조직 배양 배지의 부피를 줄입니다. 뒷발을 감싼 땋은 선은 기본 디자인과 3D 프린팅된 PLA 클립을 사용하여 플랫폼 밖으로 라우팅됩니다. 줄을 당기면 뒷발이 배굴곡되고 아킬레스건 삽입이 종골에 부딪혀 횡방향 압박 변형률이 상승합니다 5,6 (그림 1A). 플랫폼은 조직 배양 배지에 잠긴 뒷다리 외출부를 유지하는 아크릴 욕조 내에 포함되어 있습니다. 팽팽한 끈을 접착 테이프로 욕조 외부에 고정하면 발목 배굴곡이 유지되어 아킬레스건 삽입의 정적 충돌이 발생합니다. 3D 프린팅 부품용 CAD 파일은 다양한 형식(보충 파일 1)으로 제공되므로 다양한 상용 및 무료 오픈 소스 CAD 소프트웨어로 가져와 실험 요구 사항에 맞게 수정할 수 있습니다. 제작을 위해 3D 프린터에 액세스할 수 없는 경우 저렴한 비용으로 부품을 인쇄하고 배송하는 온라인 3D 프린팅 서비스에 CAD 파일을 제공할 수 있습니다.

중요한 것은 삼두근-아킬레스 근 복합체가 무릎과 발목 관절 모두에 걸쳐 있다는 것입니다 71,72,73. 결과적으로 아킬레스건의 인장 변형은 무릎 굴곡의 영향을 받습니다. 무릎 신전은 아킬레스건에 긴장을 가하는 반면 무릎 굴곡은 긴장을 줄입니다. 먼저 무릎을 펴고 발목을 수동적으로 배측 굴곡함으로써 충돌된 삽입부의 압축 변형이 인장 변형에 중첩될 수 있습니다. 반대로 무릎을 구부린 상태에서 발목을 수동적으로 배측 굴곡하면 인장 변형이 감소하고 압축 변형이 남습니다. 현재 프로토콜은 이러한 세 가지 조건을 탐색합니다. 1) 정적 충돌의 경우 발을 경골에 대해 110° < 배굴곡하여 삽입을 방해하고 무릎을 구부려 긴장을 줄입니다. 2) 베이스라인 장력 그룹의 경우 무릎을 펴고 발목을 배굴곡 145° 이상으로 펴서 삽입 시 주로 인장 변형을 발생시킵니다. 3) 무부하 그룹의 경우, 외식은 외부에서 가해지는 하중이 없는 상태에서 무릎과 발목이 중립 위치에 있는 페트리 접시에서 배양됩니다. 위에서 언급한 각도는 발과 경골이 180° 각도로 평행하고 90° 각도로 수직인 좌표계를 기준으로 사진으로 측정한 것입니다.

프로토콜의 주요 단계에는 1) 뒷다리 외피 절개 및 피부와 족저 힘줄의 신중한 제거가 포함됩니다. 2) 48시간 덱사메타손 전처리 후 이식 배양; 3) 조직 절편 및 조직학적 염색; 4) 섬유연골 형성을 평가하기 위한 컬러 이미지 분석. 절개 후, 각 뒷다리 이식은 덱사메타손74가 보충된 배양 배지에서 48시간 동안 전처리됩니다. 각 마우스의 반대쪽 팔다리는 쌍별 비교를 위해 별도의 실험 그룹에 할당되어 생물학적 변동성을 제어하는 데 도움이 됩니다. 전처리 후, 외식을 위에서 설명한 대로 플랫폼에 배치하고 7일 더 배양합니다(그림 1B). 48시간 전처리 직후 외식재를 제거하는 전처리(0일) 그룹에 대한 추가 비교가 이루어집니다.

이식 배양 후 뒷다리를 다듬고 포르말린을 고정하고 석회질을 제거하고 파라핀에 넣습니다. 시상 방향의 연속 절편은 근건성 접합부에서 종골 삽입까지 아킬레스건을 시각화하는 동시에 전체 힘줄을 통해 절편 깊이를 추적할 수 있습니다. 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 매개 dUTP X-nick 라벨링(TUNEL)은 세포사멸에 의한 이차적인 DNA 손상을 시각화하고 생존 가능성을 평가하는 데 사용됩니다. 톨루이딘 블루 조직학 및 맞춤형 컬러 이미지 분석을 수행하여 GAG 염색의 변화를 정량화합니다. 그런 다음 톨루이딘 블루 염색 조직 절편을 SHG 이미징에 사용하여 콜라주 섬유 조직의 변화를 특성화합니다(그림 1B).

제공된 대표적인 결과는 GAG가 풍부한 매트릭스의 조직학적 염색 변경과 모델 내에서 7일간의 정적 충돌에 의해 생성된 세포외 콜라겐 네트워크의 무질서를 시사합니다. 이 모델은 충돌 유도 섬유연골 변화의 기저에 있는 분자 메커니즘을 탐구하는 데 활용할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 연구는 로체스터 대학교 동물 자원 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 조직 배양 배지의 제조

  1. 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에서 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신 및 200μM L-아스코르브산을 사용하여 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(1x DMEM)에서 모든 외식을 배양합니다. 초기 48시간 전처리의 경우, 100nM 덱사메타손74가 보충된 70mL의 배양 배지에서 각 이식체를 배양합니다. 전처리 후, 덱사메타손 없이 7일 동안 팔다리를 배양하고 48-72시간마다 배지를 교체합니다.
    참고: 소 태아 혈청과 같은 혈청을 배양 배지에 첨가하는 것은 Wunderli, Blache 및 Snedeker57에서 제공한 권장 사항과 일치하는 것으로 권장되지 않습니다. 간단히 말해서, 무혈청 상태는 생체 내에 존재하는 무혈성, 영양분이 부족한 힘줄 미세환경을 더 잘 나타냅니다. 더욱이, 혈청 보충은 특정 배양 조건(75 ) 하에서 조직 분해를 촉진할 수 있고, 힘줄 병리학(57)의 두 가지 특징인 세포 증식 및 조직 외부로의 이동을 자극할 수 있다.
  2. 언로드된 그룹의 경우 각 explant를 70mL의 배지에서 배양합니다. 베이스라인 장력 및 정적 충돌 그룹의 경우, 각 플랫폼에는 팔다리를 물에 담그기 위해 약 125mL의 배양 배지가 필요합니다. 이 체적은 그립의 상부 다리 위치 및 3D 인쇄 매개변수(주로 채우기 밀도)에 따라 달라질 수 있습니다.

2. 외식성 해부 및 덱사메타손 전처리

  1. CO2 흡입 및 이차성 자궁경부 탈구를 통해 또는 기관 지침에 따라 마우스를 안락사시킵니다. 이 프로토콜은 1년 미만의 C57BL/6 마우스를 사용합니다. 뒷다리 크기는 나이가 들면서 증가하며 그립에 맞추기가 어려울 수 있습니다.
  2. 해부 전에 70mL의 예열된(37°C) 배양 배지를 멸균 생물 안전 작업대(BSC)의 100mm(직경) x 25mm(높이) 페트리 접시에 옮깁니다. 덱사메타손을 첨가하여 100nM 작업 농도를 달성합니다.
  3. 흡수성 언더패드를 사용하여 벤치탑에서 해부를 수행할 수 있으며, 뒷다리 이식물을 BSC로 옮기기 전에 해부를 통해 신속하게 작업할 수 있습니다. 이 해부에 필요한 매끄럽고 곧고 가는 팁 겸자를 포함하는 수술 도구를 조립하십시오. 톱니 모양의 이빨이 있는 곧고 가는 팁 겸자; 그리고 곧고 날카롭고 가는 가위.
  4. 뒷다리 이식 부위를 해부하려면 마우스를 앙와위 자세로 놓고 고관절을 확인합니다. 가는 가위를 사용하여 위쪽 다리의 근위 및 전방(두개골)을 덮는 피부를 통해 작은(5-10mm) 절개합니다.
  5. 절개 부위를 당겨 확장하고, 노출된 윗다리를 손가락으로 꼬집고, 피부를 원위부로 조심스럽게 당겨 뒷다리를 발목 높이까지 벗깁니다. 발의 등쪽을 따라 피부 아래에 가위 날을 부드럽게 삽입하고 발가락까지 뻗은 절개를 합니다. 피부를 말단부로 계속 당겨 완전히 제거합니다.
  6. 마우스를 배치하여 발목 근처의 종골의 후방(꼬리) 측면에 아킬레스건 삽입을 시각화합니다. 아킬레스건 삽입부에 근접한 족저건은 아킬레스건의 내측 경계에 바로 인접해 있으며 발의 발바닥 쪽을 향해 원위부로 뻗어 종골의 뒤쪽을 지나갑니다.
  7. 발바닥 힘줄을 제거하려면 두 힘줄 사이에 매끄럽고 가는 끝 겸자의 한쪽 끝을 조심스럽게 삽입하고 발바닥 힘줄 아래를 지나 팁을 내측으로 확장합니다. 팁을 근방으로 당겨 발바닥 근육을 찢습니다. 끝이 가는 톱니 모양의 집게를 사용하여 발바닥 힘줄의 분리된 근위 끝을 잡고 말단부로 당겨 제거합니다.
  8. 고관절에서 가는 가위를 사용하여 골반을 자르고 뒷다리를 분리합니다. 가위를 사용하여 남은 골반을 들어 올리고 대퇴골두를 노출시킵니다.
  9. 뒷다리 이식을 BSC로 옮기고 덱사메타손이 함유된 세포 배양 배지가 들어 있는 접시에 넣습니다. 접시를 인큐베이터로 옮기고 48시간 동안 전처리합니다.

3. Explant 배양 및 로딩 플랫폼

  1. 48시간 전처리가 끝나면 충분한 양의 배양 배지를 예열합니다(섹션 1). 이 시점부터 덱사메타손은 배양 배지에 첨가되지 않습니다. 이때, 전처리된(0일) 그룹의 팔다리를 고정, 석회질 제거 및 향후 절편, 염색 및 분석을 위해 파라핀에 매립할 수 있습니다.
  2. 언로드된 그룹의 경우 전처리 배지를 흡인하고 외식을 신선한 페트리 접시로 옮기고 각각 70mL의 배양 배지를 추가한 다음 인큐베이터로 돌아갑니다.
  3. 기준선 장력 및 정적 충돌 그룹의 경우 외형 플랫폼을 준비합니다. 그립 플래튼과 비슷한 크기의 사포 조각을 자릅니다. 정적 충돌 그룹의 경우 약 18인치 길이의 꼰 선 조각을 자르고 선 길이를 따라 중간에 느슨한 오버핸드 매듭을 미리 묶습니다. 알루미늄 호일 조각을 찢어 각 아크릴 수조를 덮고 70% 에탄올(EtOH)을 뿌립니다. BSC로 준비 사항을 전송합니다.
  4. 각 플랫폼에는 아크릴 수조, 베이스, 부피 감소 인서트, 클립 및 그립이 포함되어 있습니다. 각 그립에는 그립을 베이스에 부착하는 M5 x 0.8mm 나사 x 10mm 길이 나사 1개를 포함하여 2개의 플래튼과 3가지 유형의 나사가 포함되어 있습니다. 그립을 고정하기 위해 플래튼을 연장하는 M6 x 1mm 나사 x 20mm 길이 나사 2개; M3 x 0.5 mm 나사 x 14 mm 길이 스크류 4개와 4개의 압축 스프링이 결합되어 플래튼을 집어넣어 그립을 엽니다.
  5. 누출 시 모든 배양 배지를 포집할 수 있는 보조 용기에 모든 구성 요소를 넣습니다. 10% 표백제 용액≥ 담그고 최소 1시간 동안 담그십시오. 표백제 용액을 수돗물(필요에 따라 오토클레이브)로 헹구고 BSC로 이동합니다.
    알림: 오염 문제를 해결하려면 모든 수돗물을 고압멸균하거나 정제수를 사용하는 것이 좋습니다. 오염 문제를 해결할 때 추가 팁은 토론을 참조하십시오.
  6. M3 나사와 압축 스프링을 사용하여 플래튼을 그립에 부착하고, M5 나사를 사용하여 그립을 베이스에 고정하고, 플래튼에 맞물릴 때까지 M6 나사를 삽입합니다. 양면 테이프를 사용하여 플래튼에 사포를 부착한 다음 그립을 닫아 플래튼에 사포가 접착되도록 합니다. 모든 플랫폼에 대해 반복합니다.
  7. 플랫폼을 로드할 준비가 되면 그립을 완전히 열고 집게를 사용하여 아킬레스건의 표면 표면이 위를 향하도록 위쪽 다리와 무릎을 플래튼 사이에 놓습니다(그림 1A). 그립을 느슨하게 닫아 제자리에 부드럽게 고정합니다.
  8. 집게를 사용하여 노출된 대퇴골두나 발을 잡고 그립을 서서히 닫아 제자리에 고정하면서 무릎 굴곡 각도를 조작합니다. 기준선 장력 그룹의 경우 앞에서 설명한 대로 무릎 관절을 확장합니다. 무릎을 쭉 뻗은 상태에서 그립이 조여지면서 발목이 자연스럽게 펴집니다. 정적 충돌 그룹의 경우 앞에서 설명한 대로 그립 사이의 무릎 관절을 구부립니다.
  9. 정적 충돌 그룹의 경우 스트링의 오버핸드 매듭을 원위 발 주위에 놓고 조입니다. 외식구 아래에 있는 베이스의 슬롯과 클립 구멍을 통해 스트링을 배선합니다. 베이스를 아크릴 수조에 넣고 클립을 수조의 상단 가장자리에 고정합니다(그림 1A).
  10. 스트링을 당겨 경골에 대해 발을 최소 110°로 배구부리고 영구 마커를 사용하여 스트링이 클립에서 나올 때 표시합니다. 이 위치에서 외식의 사진을 찍어 나중에 배측 굴곡 각도를 정량화합니다(그림 1A).
  11. 베이스를 제거하고 베이스의 트랙을 따라 밀어 부피 감소 인서트를 부착합니다. 베이스(이제 부피 감소 인서트에 부착됨)를 아크릴 수조에 다시 놓고 클립을 상단 가장자리에 재배치합니다. 표시된 끈을 가이드로 사용하여 끈을 당겨 원래 배측 굴곡 각도로 돌아가고 테이프로 끈을 욕조 외부에 고정하여 정적 배측 굴곡을 유지합니다.
  12. 베이스라인 장력 그룹의 경우, 외식구가 그립 사이에 위치하면 부피 감소 인서트가 있는 베이스를 아크릴 수조에 놓고 배측 굴곡 각도의 정량화를 위해 사진을 찍기만 하면 됩니다.
  13. 125mL의 예열된(37°C) 배양 배지를 각 플랫폼에 추가하여 외식물을 담그십시오. 수조 상단을 알루미늄 호일로 덮고 보조 용기에 넣고 인큐베이터로 이동합니다. 추가 7일 동안 배양하고 48-72시간마다 배지를 교체합니다.
    알림: 수조 상단에 테이프를 붙이면 PLA 부품이 뜨는 것을 방지할 수 있습니다.

4. 고정, 석회질 제거 및 파라핀 임베딩

  1. 이식 배양 후 가위를 사용하여 발톱/원위 발가락을 다듬고 아킬레스건 근연부에 근접한 위쪽 다리를 잘라냅니다. 손질된 각 발목 관절을 폼 생검 패드가 늘어선 처리 카세트에 넣습니다. 발목을 카세트 모서리에 밀어 넣어 발목을 약 90° 배굴곡 위치에 놓고 카세트를 닫아 제자리에 고정합니다.
  2. 10% 중성 완충 포르말린(NBF)에 3일 동안 고정하고 빙초산으로 pH를 7.4-7.6으로 조정한 증류수(diH2O)에 용해된 14% 에틸렌디아메네테트라아세트산(EDTA)에서 2주 동안 석회질을 제거합니다.
  3. 염을 제거하려면 샘플을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세 번 헹군 다음 diH2O에서 각각 5분씩 헹굽니다. 파라핀 조직학을 위한 일상적인 시료 처리 수행: 등급이 매겨진 일련의 EtOH를 통해 탈수하고, 크실렌에서 투명하고, 파라핀 왁스로 침투시킵니다. 아래 섹션 5에 설명된 대로 내측에서 외측으로 진행되는 아킬레스건을 통해 시상 조직 절편을 얻기 위해 샘플을 파라핀에 배향하고 포함합니다(그림 1B).

5. 조직 절편

  1. 마이크로톰을 사용하여 단면이 블록 면과 평행이 될 때까지 샘플을 조심스럽게 다듬습니다. 관절의 내측 측면에서 발목을 심하게 다듬고 아킬레스건 삽입의 내측 경계에 도달하기 전에 멈춥니다.
  2. 샘플을 얼음 블록으로 옮겨 온도와 수분을 조정하고 블레이드를 교체합니다(또는 현재 블레이드의 새 부분으로 이동). 10μm 두께로 샘플을 계속 절편하고 명시야 현미경으로 아킬레스건 삽입부의 진입을 주의 깊게 식별합니다. 식별되면 전체 아킬레스건 삽입을 통해 단면 번호(즉, 조직 깊이)를 추적하는 연속 절편을 수행합니다.

6. 탈파라핀화/재수화 및 슬라이드 선택

  1. 아래의 각 분석에 대해 각 반대측 사지 쌍에서 수평이 일치하는 조직 절편을 선택합니다. 염색하기 전에 슬라이드 랙에 놓고 크실렌 3회 변화, 100% EtOH 2회 변화, 95% EtOH 2회 변화, 70% EtOH 1회 변화를 각각 5분씩 진행합니다. diH2O에서 수분 보충을 마칩니다.

7. 아킬레스건 생존력을 평가하기 위한 TUNEL

  1. TUNEL 라벨링의 경우 제조업체의 프로토콜에 따라 염색하십시오. 실온에서 20 μg/mL proteinase K에서 20분 동안 배양하고 diH2O에서 헹굽니다. 50 μL의 TUNEL 염색 용액(5 μL 효소 용액, 45 μL 라벨 용액)에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. diH2O. DIP와 커버슬립이 포함된 변색 방지 시약으로 마운트에 헹굽니다.
  2. 4x 대물렌즈가 장착된 형광 현미경을 사용하여 아킬레스건 삽입을 이미지화합니다. 모든 핵을 시각화하기 위한 DAPI 채널(여기/방출 파장 = 360/460nm), 세포사멸 핵을 시각화하기 위한 TUNEL(여기/방출 파장 = 540/580nm), 그리고 가능한 경우 명시야 채널을 포함합니다.
  3. 영상 분석의 경우, ROI 기반 처리에 적합한 영상 분석 소프트웨어(예: FIJI/ImageJ 또는 MATLAB)로 영상을 가져옵니다. 전체 아킬레스건을 윤곽으로 하는 관심 영역(ROI)을 정의하고(그림 2A), 배양할 때 해부 및 환경 조건의 급격한 변화로 인해 유도된 죽음에 매우 취약한 에피테논의 세포를 제외합니다.
  4. 이렇게 하려면 MATLAB에서 명시야 영상을 가져오고 drawpolygon() 함수를 사용하여 힘줄의 경계를 추적하고 둘러싸는 방식으로 ROI 선택을 수행합니다. MATLAB은 ROI에 대한 Polygon 객체를 생성하고, 이 객체를 DAPI 및 TUNEL 채널 영상에 적용하면 아킬레스건 내의 핵만 분석하기 위해 createMask()를 사용하여 ROI 외부의 픽셀 명암 데이터를 마스킹할 수 있습니다.
  5. DAPI 및 TUNEL 채널 이미지를 가져오고, 조직 절편에서 우연히 포획된 뼈, 근육 또는 지방과 같은 생존 불가능한 조직에서 세포사멸 핵의 최대 형광 강도로 정규화하여 자가사멸(TUNEL+) 핵을 정의하기 위한 형광 강도 임계값을 식별합니다. 이미지가 마스킹되면 아킬레스건 내 자가사멸 핵(TUNEL+ 핵/DAPI 핵)의 분율을 계산합니다.

8. 섬유연골 형성을 특성화하기 위한 톨루이딘 블루 조직학

  1. 수분이 재수화되면(섹션 6), 수평이 일치하는 조직 절편이 있는 슬라이드 랙을 반대측 외피 쌍에서 빙초산을 사용하여 pH를 4.0으로 조정한 0.1M 아세트산나트륨 완충액의 0.4% w/v 톨루이딘 블루 O로 옮깁니다. 실온에서 10분 동안 배양한 다음 diH2O에서 각각 30초 동안 3번 헹굽니다.
  2. 95% EtOH의 3회 변화와 100% EtOH의 2회 변화를 각각 30초 동안 탈수합니다. 크실렌을 각각 1분씩 세 번 교체하여 씻어냅니다. 크실렌 기반 장착 매체가 있는 커버슬립.
  3. 아킬레스건 삽입의 24비트 RGB(Red-Blue-Green) 컬러 이미지를 얻습니다. 예를 들어, 이 프로토콜의 경우 어댑터를 사용하여 디지털 컬러 카메라를 4x 대물렌즈가 있는 간단한 명시야 현미경의 접안렌즈에 연결합니다.
  4. 아킬레스건 삽입 시 압박 힘줄 섬유연골(CTF)16 내 톨루이딘 블루 염색의 차이를 정량화하려면(그림 3A,B) RGB 이미지를 여러 ROI를 정의하고 관리할 수 있는 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다. 옵션에는 선택 및 ROI 관리자 툴(FIJI/ImageJ) 또는 영상 처리 툴박스(MATLAB)가 있습니다. 먼저 픽셀/길이 배율을 설정합니다.
    참고: 소프트웨어 선택은 연구자의 재량에 달려 있으며 MATLAB 또는 FIJI/ImageJ에 국한되지 않습니다. 저자는 MATLAB 코드(보충 파일 2), 구현을 설명하는 문서(보충 파일 3) 및 샘플 이미지(보충 파일 4)를 제공했습니다. 연구원은 이 코드를 다른 프로그래밍 언어로 변환하여 필요하거나 선호하는 경우 다른 소프트웨어에서 사용할 것을 권장합니다.
  5. 선택한 소프트웨어에 표시된 이미지를 사용하여 심부 힘줄 경계와 종골의 교차점을 식별합니다. 여기에서 CTF의 깊은 경계를 설정하기 위해 깊은 힘줄 경계를 따라 근방 800μm를 추적합니다. 예를 들어, MATLAB의 drawpolyline() 함수를 사용하여 RGB 영상 위에 대화형 방식으로 다중선을 그릴 수 있습니다. MATLAB은 선의 꼭짓점을 포함하는 Polyline 객체를 생성하며, 이 꼭짓점은 800μm 길이로 처리 및 트리밍할 수 있습니다.
  6. 이 위치에서 국소 섬유 방향에 수직인 표면 힘줄 경계에 연결되는 선분을 그려 CTF의 근위 경계를 만듭니다.
  7. 심부 힘줄 경계와 종골의 교차점으로 돌아가 CTF를 부착 영역 섬유연골(AZF)16에서 분리하는 뚜렷한 조수 표시를 따라 표재성 힘줄 경계에 연결되는 선분을 그려 CTF의 원위 경계를 정의합니다(그림 3A,B). 마지막으로, 둘러싸고 있는 표재성 힘줄 경계를 추적하여 CTF의 표재성 경계를 생성합니다.
  8. 삽입 전반에 걸친 GAG 염색의 공간적 변화를 설명하기 위해 전체 CTF를 4개의 사분면으로 나눕니다(그림 3A,B). 깊고 피복적인 CTF 경계의 중간점을 선분과 연결하여 원위/근위 경계를 만듭니다. 이 경계의 중간점을 통과하여 섬유 방향을 따라 원위 및 근위 CTF 경계의 중간점을 연결하여 표면/심부 경계를 만듭니다.
  9. 이 6개의 경계는 전체 CTF를 나타내는 ROI를 정의하는 데 사용할 수 있는 정보를 제공할 뿐만 아니라 CTF를 세분화하는 4개의 사분면도 제공합니다. 예를 들어, MATLAB에서 각 개별 ROI(CTF, 사분면 1-4)의 경계를 정의하는 꼭짓점을 벡터로 컴파일하고 images.roi.Polygon()을 사용하여 각 ROI에 대해 닫힌 Polygon 객체를 생성합니다.
  10. ROI가 정의된 상태에서 FIJI의 색 변환기 플러그인, MATLAB의 rgb2hsv() 함수 또는 적절한 변환 방정식76을 적용하는 다른 소프트웨어를 사용하여 RGB 픽셀 데이터를 HSV(Hue-Saturation-Value) 색 공간으로 변환합니다. 그런 다음 HSV 데이터를 2D 색조 채도 공간에 투영할 수 있으며, 여기서 색조와 채도의 각 조합은 고유한 색상을 인코딩합니다(그림 3C).
  11. 각 ROI 내에서 ROI의 평균 얼룩 색상을 설명하는 평균 색조 및 채도를 계산합니다. 예를 들어, MATLAB에서는 각 ROI 내에서 색조-채도 픽셀 데이터를 분석하기 위해 createMask()를 사용하여 이미지를 마스킹하기 위해 각 ROI를 정의하는 Polygon 객체를 사용하여 이를 달성할 수 있습니다.
  12. 골막 섬유연골(periosteal fibrocartilage, PF)16 내에서 또 다른 작은 ROI를 정의하고(그림 3A, B) 평균 색조와 채도를 계산합니다. 그런 다음 CTF의 각 ROI의 평균 색상을 PF의 ROI로 분리하는 유클리드 거리를 계산합니다(그림 3C).
    figure-protocol-1
    참고 : 유클리드 거리 계산은 ROI의 평균 색상과 전형적인 섬유 연골 조직 16,17,77 인 PF의 평균 색상 사이의 유사성 정도를 설명합니다. 유클리드 거리가 작을수록 외관상 섬유연골이 더 많은 ROI 색상을 나타냅니다.
  13. 이 거리를 사용하여 섬유연골 점수를 계산하는데, ROI 색이 PF 색과 동일한 경우 최대값 1을 가정하고 ROI 및 PF 색이 색조 채도 색 공간 내에서 최대 분리에 도달하는 경우 최소값 -1을 가정합니다.
    figure-protocol-2
  14. 각 사지의 조직 절편에 대한 각 ROI 내에서 색조, 채도 및 섬유연골 점수에 대한 평균 데이터입니다. 반대쪽 사지 그룹 간에 쌍을 이루는 통계적 비교를 수행합니다.

9. 교원질 네트워크 조직에 있는 변화를 조사하는 SHG 화상 진찰

  1. 20x 대물렌즈가 장착된 유능한 현미경 시스템을 사용하여 Toluidine blue 염색 절편의 SHG 이미징을 수행합니다. 단면 두께를 통해 z-스택을 획득하고 필요에 따라 타일 스캔을 수행하여 아킬레스건 삽입을 완전히 캡처합니다.
  2. SHG 이미지를 선호하는 이미지 분석 소프트웨어로 가져오고 섹션 8의 Toluidine blue 이미지 분석에 대해 설명된 대로 아킬레스건 삽입 시 CTF를 포함하고 세분화하는 ROI를 정의합니다(그림 4A,B).
  3. SHG 이미지를 MATLAB으로 가져오는 경우 섹션 8에 설명된 대로 MATLAB에서 CTF ROI를 정의하는 방법을 사용하십시오. ROI를 정의한 후에는 MATLAB에서 ROI 꼭짓점을 .txt 파일로 내보내고 파일 > 가져오기 > XY 좌표를 사용하여 FIJI로 가져와서 ROI 좌표를 FIJI로 전송합니다. 선택 항목을 오버레이하고 분석을 위해 ROI 관리자에게 보냅니다.
  4. 콜라겐 조직을 정량화하려면 푸리에 스펙트럼 분석을 수행하는 피지의 방향성 플러그인을 사용하여 ROI에 걸쳐 있는 작은 창에서 섬유 배향의 분포를 계산합니다. 분산이라고 하는 이 분포의 확산은 섬유 정렬과 반비례합니다.
    참고: 콜라겐 섬유는 정렬/조직의 부재보다는 힘줄의 총 곡률로 인해 CTF를 가로지르는 다른 창에서 다양한 방향을 취할 수 있습니다. 콜라겐 조직의 변화와 삽입 시 힘줄의 총 만곡을 더 잘 구별하려면 더 작은 ROI를 정의해야 합니다.
  5. SHG 이미지를 FIJI로 가져오고 픽셀/길이 스케일을 설정합니다. 최대 픽셀 강도 데이터를 2D 합성 영상에 투영하고 ROI Manager에 ROI를 추가할 수 있습니다. 각 CTF ROI를 영상에 순차적으로 오버레이하고 ROI 내에 일정한 크기의 작은 하위 ROI 10개를 그려 ROI 매니저에 하위 ROI를 추가합니다.
  6. 각 하위 ROI 내에서 FIJI에서 방향성 플러그인을 실행하여 광섬유 분산을 계산합니다. 각 CTF ROI 내의 하위 ROI에 대한 평균 분산 데이터 및 각 explant의 섹션에 대한 각 CTF ROI 내의 평균 분산 데이터. 반대쪽 사지 그룹 간에 쌍을 이루는 통계적 비교를 수행합니다.

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결과

TUNEL 염색 조직 절편의 대표 이미지는 실험군에서 7일간의 식생 배양 후 아킬레스건 체내 최소 세포사멸 핵을 보여줍니다(그림 2A). 이러한 이미지의 정량화는 조직 배양 프로토콜이 로딩 조건에서 7일간의 이식 배양 후 아킬레스건 내에서 평균 최대 78%의 생존율을 유지한다는 증거를 제공합니다(그림 2B).

정성적으로 향상된 톨루이딘 블루 염색은 하중이 가해지지 않은 대조군에 비해 7일 동안 정적 충돌이 발생한 후 높이 평가되며(그림 3A,B), 특히 이전에 최대 횡방향 압축 변형률 5,6을 측정한 종골에 인접한 깊은 사분면에서 더욱 그렇습니다. 이러한 톨루이딘 블루 염색 조직 절편의 ...

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토론

이 연구에서 설명한 조직 배양 프로토콜과 결합된 실험용 쥐 뒷다리 이식 플랫폼은 아킬레스건 삽입 시 충돌 유도 섬유연골 형성의 역학을 연구하는 데 적합한 모델을 제공합니다. 이 이식 모델의 유용성은 7일간의 정적 충돌 후 톨루이딘 블루 염색에서 유의미하고 공간적으로 이질적인 변화와 함께 세포 생존율의 유지를 나타내는 대표적인 결과로 입증됩니다. 이러한 발견은 기계적 충돌에 이차적으로 GAG가 풍부한 기질 분자의 변화된 대사를 시사하며, 이는 다른 모델 및 임상 연구와 일치합니다 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자들은 P30AR06965가 부분적으로 자금을 지원한 로체스터 대학교 근골격계 연구 센터의 조직학, 생화학 및 분자 이미징(HBMI) 코어의 Jeff Fox와 Vidya Venkatramani가 제공한 지원과 도움에 감사드립니다. 또한 저자들은 다광자 현미경 검사에 도움을 준 로체스터 대학 의료 센터의 광학 현미경 및 나노스코피 센터(CALMN)에 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 R01 AR070765 및 R01 AR070765-04S1, 1R35GM147054 및 1R01AR082349의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
흡수성 언더패드VWR82020-845벤치탑 해부
아크릴 수조Source OneX001G46CB1배양 매체에 잠긴 외식 플랫폼 포함
오토클레이브 빈Thermo Scientific13-361-20보조 격납고로 사용되며 두 개의 플랫폼을 보유
Base--보충 파일로 제공되는 CAD 파일에서 3D 인쇄
꼰 라인KastKing30lb 테스트발을 감싸고 발목 배굴을 적용하는 데 사용됩니다
클립--보충 파일로 제공되는 CAD 파일에서 3D 인쇄
커버 유리 Fisherbrand12-541-034직사각형, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYLVWR8312-4Xylene 기반 마운팅 미디어로 Toluidine 블루 염색 조직 커버슬립 섹션
덱사메타손MP Biomedical LLC194561CAS#50-02-2
디메틸 설폭사이드(DMSO),D12345CAS#67-68-5에 의한 무수 Invitrogen, 덱사메타손을 농축 원액에 용해시키는 데 사용
양면 테이프Scotch Brand34-8724-5195-9그립 플래튼에 사포를 부착하기 위해
Dulbecco의 Modified Eagle Medium (1X DMEM)ThermoFisher의 Gibco11965092 고포도당, (-) 피루브산, (+) 글루타민
EDTA 테트라소듐 염 이수화물Thermo Scientific ChemicalsJ15700. A1CAS#10378-23-1, 시료 석회질 제거 에탄올을 위한 14% EDTA 용액을 만드는 데 사용
, 200 프루프Thermo ScientificT038181000CAS#64-17-5, 1 L 공급
폼 생검 패드Leica3801000가공 카세트와 함께 사용, 고정 및 석회질 제거 집게 중 발목 관절을 원하는 위치로 유지하는 데 도움이
됨, #SS 표준 InoxDumont11203-23직선, 매끄럽고, 미세함 팁
겸자, Micro-Adson 4.75"Fisherbrand13-820-073톱니 모양의 이빨이 있는 직선 미세 팁
가넷 사포, 50-D GritNortonM600060 01518또는 기타 거친 그릿 사포
빙하 아세트산Fisher ChemicalA38S-500CAS#64-19-7, Toluidine 블루 조직학에 사용되는 아세트산 나트륨 완충액의 pH 조정용 및 14% EDTA 석회질 제거 용액
그립ADMETGV-100NT-A4프로토콜에 설명 된 스테인레스 스틸 바이스 그립, 나사 및 스프링이 포함되어 있습니다
Histobond 접착 현미경 슬라이드VWR16005-108뒷다리의 시상 단면 explants는 모든 염색 프로토콜을 통해이 슬라이드에 안정적으로 부착
세포 사멸 검출 키트, TMR RedRoche12156792910TUNEL 분석
라벨링 테이프Fisherbrand15-959또는 선호하는
L-아스코르브산Sigma-AldrichA4544-100GCAS#50-81-7의 기타 라벨링 테이프, 배양 배지 제형용
중성 완충 포르말린, 10%Leica3800600샘플 고정용, 5갤런 공급
Nunc 페트리 접시Sigma-AldrichP7741-1CS직경 100mm x 높이 25mm,
Penicillin-streptomycin (100X)Gibco151401225mL에서 500mL 추가 1X DMEM을 사용하여 1% v/v(1X) 작업 농도
폴리락트산(PLA) 1.75mm 필라멘트해치박스-3D 프린터 압출기와 호환되는 필라멘트 직경을 선택하십시오. 선택한 색상으로.
가공 카세트Leica3802631고정, 석회질 제거 및 파라핀 임베딩용
ThermoFisher의 DAPI Invitrogen을 사용한 Prolong Gold Antifade ReagentP36931후 조직 절편을 커버슬립하기 위한 마운팅 미디어
TUNEL 프로토콜
가위, 미세FST14094-11직선, 날카로운
슬라이드 염색 세트, 12-플레이스메르세데스 과학 MER 1011용 12개의 얼룩 접시 및 슬라이드 디퍼가 있는 랙
, Toluidine 블루 조직학용 완충액을 만드는 데 사용됨
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome BladeVWR25608-964파라핀 절단용
Toluidine Blue OThermo Scientific Chemicals348601000CAS#92-31-9
부피 감소 인서트-보충 파일로 제공되는 CAD 파일에서 3D 인쇄
XylenesLeica3803665조직 학적 염색을 위해 4 갤런 공급
용 . ThermoFisher . 됩니다. 현장 ThermoFisher의 프로토콜에 설명된 대로 70mL의 배양 배지에 외식이 잠긴 상태로 유지 TUNEL Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6 Toluidine 블루 조직학 아세트산 나트륨, 무수 Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3

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