과사용 유발 건병증의 In Vivo 모델을 위한 수동 발목 배굴곡 검사 시스템

Summary

이 프로토콜은 남용 유발 건병증의 생체 내 모델에 대해 쥐 아킬레스건에서 정량화 가능하고 통제된 피로 부상을 유도하는 데 사용되는 테스트 시스템을 제시합니다. 이 절차는 쥐의 발목을 관절 액추에이터에 고정하는 것으로 구성되며, 이 액추에이터는 맞춤형으로 작성된 MATLAB 스크립트로 수동 발목 배측굴곡을 수행합니다.

Abstract

건병증은 통증과 기능 상실을 초래하는 만성 힘줄 질환으로, 힘줄의 반복적인 과부하와 제한된 회복 시간으로 인해 발생합니다. 이 프로토콜은 수동 배측굴곡을 통해 쥐의 아킬레스건에 기계적 하중을 주기적으로 가하는 시험 시스템을 설명합니다. 맞춤형으로 작성된 코드는 피드백 제어 기반 순환 피로 하중 요법과 함께 하중 프로토콜의 효과를 평가하기 위한 사전 및 사후 순환 하중 측정으로 구성됩니다.

이 연구를 위해 25마리의 Sprague-Dawley 쥐를 사용했으며, 그룹당 5마리의 쥐가 500, 1,000, 2,000, 3,600 또는 7,200 사이클의 피로 하중을 받았습니다. 히스테리시스, 피크 응력, 로딩 및 언로딩 계수의 순환 전 및 사후 순환 로딩 측정 간의 백분율 차이가 계산되었습니다. 결과는 시스템이 적용된 하중 수에 따라 아킬레스건에 다양한 정도의 손상을 유발할 수 있음을 보여줍니다. 이 시스템은 피로로 인한 과사용 힘줄 손상의 생체 내 모델을 위해 아킬레스건에 정량화되고 생리학적으로 다양한 수준의 주기적 하중을 적용하는 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

Introduction

힘줄은 근육과 뼈를 연결하고 일생 동안 매일 반복적인 동작을 경험하기 때문에 통증과 제한, 기계적 기능 장애를 초래하는 과사용 부상에 매우 취약하여 인구의 30-50%에 영향을 미칩니다¹. 건병증은 반복적인 피로 동작과 부상 전 수준으로의 부적절한 치유로 인한 과사용 부상으로 간주되는 만성 질환입니다. 상지와 하지가 모두 일반적으로 영향을 받으며, 회전근개, 팔꿈치, 아킬레스건, 슬개건 ^2,3,4,5가 포함됩니다. 아킬레스건병증은 달리기 및 점프와 관련된 활동, 특히 육상, 중장거리 달리기, 테니스 및 기타 구기 종목에 종사하는 운동선수에게 흔하며, 달리기 선수의 ^7-9%에 영향을 미친다^6,7. 달리기와 점프로 인한 부상은 아킬레스건과 슬개건병증의 위험 요인인 제한된 발목 배굴을 유발할 수도 있다 ^8,9,10. 따라서 건병증에 대한 더 나은 평가와 특성화가 필요하며, 본 연구는 과사용 아킬레스건 손상에 대한 수동적 발목 배굴곡의 쥐 모델로 제공할 수 있습니다.

소동물 모델을 사용한 이전 연구는 건병증의 발달과 표지자를 연구하는 것을 목표로 했습니다. 여기에는 트레드밀 운동, 반복적인 도달, 직접 힘줄 부하, 콜라겐 분해 효소 주사, 수술 및 체외 연구 11,12,13,14,15,16이 포함됩니다. 문헌은 이러한 건병증 모델을 사용하여 손상 마커를 식별함으로써 이익을 얻었지만, 한계에는 힘줄의 직접 하중의 경우와 같이 생리학적으로 관련이 없는 관절 동작으로 힘줄을 로드하고, 트레드밀 연구와 같이 적용된 하중을 직접 측정하지 않으며, 콜라겐분해효소 주사의 경우와 같이 생리학적 남용을 사용하지 않는 것이 포함됩니다. 다른 사람들 사이에서. 이를 위해 본 연구는 기존에 개발된 건병증 소동물 모델의 공백을 메우기 위해 과사용 유발 건병증 연구를 응용하여 아킬레스건에 정량화된 하중을 비침습적으로 적용하는 시스템을 개발하는 것을 목표로 했다. 우리는 시스템이 다양한 하중 주기에 걸쳐 기계적 특성의 재현 가능한 변화를 유도한다는 것을 입증하기 위해 파일럿 연구를 수행했습니다. 이 시스템은 생리학적으로 관련된 움직임과 하중을 통해 과도한 사용을 유도하는 동시에 하중 요법 중에 힘줄에 가해지고 경험되는 힘을 정량화하고 측정할 수 있습니다.

Protocol

이 연구는 Beth Israel Deaconess Medical Center에서 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 승인에 따라 수행되었습니다. 유도를 위해 5%의 이소플루란을 사용하고 유지를 위해 2.5%를 사용하여 동물을 마취시켰으며, 저체온증을 피하기 위해 주의를 기울였습니다.

1. 시험 시스템 설정

1. 스테퍼 모터로 패시브 발목 회전을 제어하여 일관된 회전과 토크를 적용합니다. 마이크로 컨트롤러로 스테퍼 모터를 제어합니다. 3D 위치 및 방향 시스템의 입력을 사용하여 회전 각도를 표시합니다. 토크 센서의 출력을 사용하여 임계값 한계에 도달하지 않은 경우 배굴곡 각도를 늘리기 위한 피드백 제어를 제공합니다.
2. 시작하려면 마이크로 컨트롤러, 토크 센서, 3D 전자기 포지셔닝 및 방향 시스템을 컴퓨터와 전원 공급 장치에 연결합니다. 자체 개발한 MATLAB 코드를 사용하여 맞춤형 시스템을 제어할 수 있습니다(그림 1). GitHub에서 MATLAB 코드 파일을 다운로드하고 GitHub 페이지 지침(https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem)에 나와 있는 코드 실행에 대한 구체적인 지침을 따르십시오.
3. 코드 파일과 함께 MATLAB을 엽니다. PDImfc 소프트웨어를 열어 3차원 전자기 위치 및 방향 시스템을 MATLAB 프로그램에 연결합니다. Connect(연결) | 연속 P&O | StartSockExport()를 호출합니다. 응용 프로그램을 백그라운드에서 열어 둡니다.

2. Ex-vivo 및 사후 분석

1. 13주 된 Sprague-Dawley 쥐 6마리를 CO₂ 흡입과 개흉술을 통한 2차 안락사 방법을 통해 안락사시킵니다. 종골과 근건접합부가 손상되지 않은 상태에서 오른쪽 아킬레스건을 절개합니다. -20°C에서 동결하여 나중에 기계적 테스트를 수행합니다. 힘줄을 해동하고, 미세 절개하고, 기계적 테스트를 준비한 후 힘줄의 최대 인장 강도(UTS)를 얻기 위해 실패에 대한 인장 하중을 수행합니다(0.1N까지 예압, 0.1 - 1N에서 10주기 동안 전처리, 0.1mm/s의 일정한 변위에서 파손에 대한 램프). UTS의 15%를 시스템의 입력으로 사용하여 3.4단계에서 설명한 대로 이후 단계를 위한 사전 컨디셔닝을 수행합니다.
2. 모멘트, 팔 및 변형률 측정을 위해 동일한 절차로 5마리의 다른 동물 그룹을 안락사시킵니다. 눈금자 옆에서 발목을 90° 배굴곡으로 하여 왼쪽 다리의 X-ray를 참조로 수행합니다. 피지에서 X선 영상을 열고, 이미지의 눈금자를 참조로 사용하고, 발목 관절의 회전 중심에서 발목 뒤쪽까지의 힘줄 모멘트 암을 측정하여 MATLAB 코드에서 입력으로 사용하여 2.1단계에서 설명한 프리컨디셔닝을 위한 입력 힘을 해당 토크 값으로 변환하고 데이터 분석을 위해 출력된 토크와 힘 간의 변환을 수행합니다.
3. 무릎을 완전히 펴기 위해 두 개의 부목을 테이프로 감아 왼쪽 뒷다리를 고정합니다. 발가락을 밀어 발목을 가볍게 배부어 발목 회전이 주변의 연조직을 침범하지 않고 고립된 힘줄로 인해 발생하고 긴장되도록 합니다. 장력이 없거나 무릎에 움직임이 있는 경우 부목을 다시 테이프로 감습니다.
4. 아킬레스건 주변의 피부를 제거하여 힘줄을 노출시킵니다. 1/32인치 알루미늄 비드에 접착제를 바르고 아킬레스건의 근심 접합부에 가장 가까운 자유 힘줄에 놓고 식염수가 든 면봉을 사용하여 과도한 접착제를 제거합니다. 조직의 촉촉함을 보장하기 위해 나머지 절차 동안 아킬레스건에 식염수를 반복적으로 도포합니다.
5. 하중을 가하기 전에 디지털 캘리퍼스를 사용하여 힘줄의 단면적을 측정하십시오. 힘줄이 타원이라고 가정하고 너비와 두께를 세 배로 측정합니다.
6. 쥐를 엎드린 자세로 전신 플랫폼에 놓습니다. 발목 주위에 지퍼 타이를 하고 발가락 주위에 다른 타이를 사용하여 발목을 조인트 액추에이터에 고정하고 두 개의 지퍼 타이로 무릎 분할을 고정합니다. 발목이 완전히 족저굴곡이 되도록 차축을 돌립니다.
7. 3D 전자기 위치 및 방향 시스템의 디지타이징 펜을 컴퓨터에 연결하고 전원 공급 장치를 켭니다.
8. 지정된 주기 수(이 연구에서는 안락사된 쥐 6마리가 7,200주기를 받음)에 대해 시스템 코드(3단계에서 자세히 설명)를 실행합니다.
9. 생체 외 변형률 측정을 위해 0, 500, 1,000, 2,000, 3,600 및 7,200 사이클에서 순환 하중 요법을 일시 중지하고 3D 디지타이징 펜을 번갈아 가며 3배로 사용하여 배굴곡(시스템의 물리적 제약으로 인한 작동 한계)의 0°에서 40°까지 5°씩 종골에서 알루미늄 비드까지의 힘줄 길이를 측정합니다.
10. 2.9단계에서 얻은 길이를 사용하여 다양한 각도에서 힘줄 변형률을 계산하며, 여기서 초기 길이는 각 사이클 번호에 대해 0° 배측굴곡입니다. 선형 피팅을 수행하여 각 사이클 번호에서 배측굴곡각과 변형률 간의 관계를 구합니다. 이 관계를 사용하여 데이터 분석을 위해 원시 각도 데이터를 변형률로 변환할 수 있습니다.
11. 0° 및 40°에서 힘줄 길이를 측정하고 0°에서 측정된 단면적을 사용하여 비압축성(일정한 부피)을 가정하고 배측굴곡에서 디지털 캘리퍼스를 사용하여 힘줄 단면적을 계산합니다. 각 사이클 수에서 이 단면적을 사용하여 데이터 분석을 위해 힘을 응력으로 변환합니다(응력 = 힘/단면적).

3. 기계적 로딩 프로토콜

1. 이 연구 섹션에서는 25마리의 암컷 Sprague-Dawley 11주 된 쥐를 사용했으며, 각각 5마리의 쥐를 무작위로 할당하여 500, 1,000, 2,000, 3,600 또는 7,200 주기의 피로 부하를 받았습니다.
   알림: 사전 컨디셔닝, 초기 교정, 사전 및 사후 측정은 실행하는 데 약 15분이 소요되며 순환 피로 하중 요법은 사이클당 1초가 걸립니다. 따라서 쥐가 마취 중인 가장 긴 시간은 약 2시간이며, 이는 IACUC 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
2. 마이크로 컨트롤러, 토크 센서, 3D 전자기 포지셔닝 및 방향 시스템을 컴퓨터와 전원 공급 장치에 연결합니다. 자체 개발한 MATLAB 코드를 사용하여 맞춤형 시스템을 제어할 수 있습니다(그림 1).
3. 컴퓨터를 켜고 코드 파일이 있는 MATLAB을 엽니다. PDImfc 소프트웨어를 열어 3차원 전자기 위치 및 방향 시스템을 MATLAB 프로그램에 연결합니다. Connect(연결) | 연속 P&O | StartSockExport()를 호출합니다. 응용 프로그램을 백그라운드에서 열어 둡니다.
4. 유도실에서 흡입을 통해 5% 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 유도 후 수성 발열체가 부착된 전신 플랫폼에 동물을 고정하여 온도를 유지하고 노즈콘 부착물을 통해 2.5% 이소플루란으로 마취를 유지합니다. 마취 중 건조함을 방지하기 위해 눈에 젖은 연고를 사용하십시오.
5. 쥐를 엎드린 자세로 전신 플랫폼에 놓습니다. 발목 주위에 지퍼 타이를 하고 발가락 주위에 다른 타이를 사용하여 발목을 조인트 액추에이터에 고정하고 두 개의 지퍼 타이로 무릎 분할을 고정합니다. 발목이 완전히 족저굴곡이 되도록 차축을 돌립니다.
   알림: 지퍼 타이가 수축이나 병변을 일으키지 않는지 확인하고 조일 때 주의하고 필요한 경우 지퍼 타이와 피부 사이에 거즈를 놓아 보호층을 만듭니다.
6. 시스템 코드 실행과 관련된 다음 단계를 수행하려면 특정 하중 테스트에 해당하는 코드의 각 섹션에 대해 MATLAB에서 실행(Run on MATLAB)을 클릭하십시오.
7. 2.1단계를 기반으로 측정한 체외 당김에서 실패 테스트까지 아킬레스건의 최종 인장 응력 값을 기준으로 발목을 50회 순환하여 최종 인장 응력의 15%까지 순환합니다.
8. 힘줄을 12°까지 세 번 배측 굴곡하여 힘줄의 초기 보정을 수행합니다. 히스테리시스 곡선의 하중 영역에 대한 선형 영역의 기울기를 사용하여 곡선의 지수 영역을 계산합니다.
9. 곡선의 하중 영역 피크 기울기를 계산하여 곡선의 지수 영역을 얻을 때까지(자체 개발한 MATLAB 코드를 사용하여 계산) 또는 40°로 회전할 때까지(둘 중 먼저 발생하는 시점) 증가하는 각도로 발목을 점진적으로 배구부립니다.
10. 최종 획득 각도에서 사전 하중 기준선으로 5개의 주기적 기계적 측정을 수행합니다.
11. 지정된 주기 수(이 연구에서는 500, 1,000, 2,000, 3,600 또는 7,200 주기)에 대해 순환 피로 하중 요법을 수행합니다.
12. 50주기마다 히스테리시스 곡선의 하중 부분의 기울기(자체 개발한 MATLAB 코드를 통해 계산됨)를 계산하여 여전히 지수 영역에 있는지 확인합니다. 이 지수 영역에 도달할 때까지 이미 1°에 있지 않은 경우 배측굴곡각을 40° 늘립니다.
13. 순환 하중 요법이 완료된 후 힘줄의 기계적 특성을 측정하기 위해 처음에 선택한 각도에서 사후 하중 측정으로 5개의 순환 기계적 측정을 수행합니다.
14. 지퍼 타이와 부목을 제거합니다. 동물을 회수실로 돌려보냅니다. 동물은 충분한 의식을 회복할 때까지 방치되지 않으며, 그 후 케이지로 돌아갑니다. 부작용 임상 징후가 있는지 매일 동물을 모니터링하고 있는 경우 72시간마다 한 번씩 1.2mg/kg의 용량으로 부프레노르핀을 피하 투여하거나 조기 안락사를 시행합니다. CO2 흡입을 통한 7일간의 케이지 활동 후 동물을 안락사시키고 개흉술을 통한 2차 안락사 수단을 사용합니다.
    참고: 순환 하중 적용 및 기계적 측정은 토크 센서, 3D 프린팅 발목 관절 액추에이터 및 동물 침대, 3D 전자기 위치 및 방향 시스템, 배굴을 달성하기 위해 샤프트를 회전시키는 스테퍼 모터로 구성된 맞춤형 지그를 사용하여 수행^{되었습니다.} 이 시스템은 1.2단계에서 언급한 MATLAB 스크립트에 의해 제어됩니다. 토크 센서와 위치 및 방향 시스템은 시스템의 부하 프로토콜 전반에 걸쳐 토크 및 위치 데이터를 캡처합니다.

4. 데이터 분석

1. 사전 측정 데이터와 사후 측정 데이터를 MATLAB에 별도로 불러옵니다.
2. 2.2단계에서 측정된 모멘트 암과 방정식 (1) 및 (2)를 사용하여 2.11단계에서 얻은 적용된 하중 지정된 수에서 측정된 단면적을 기준으로 토크를 응력으로 변환합니다.
   (1)
   (2)
3. 2.10단계에서 얻은 변환을 기반으로 각도를 변형률로 변환합니다.
4. 사전 및 사후 측정 사이클에 대한 평균 히스테리시스(로딩 곡선과 언로딩 곡선 사이의 면적), 피크 응력(사이클의 최대 응력 값) 및 로딩 및 언로딩 계수(로딩의 마지막 50%와 언로딩 곡선의 처음 60%의 선형 맞춤)를 계산합니다.
5. 사전 및 사후 측정 주기 사이의 4.4단계에서 기계적 특성의 백분율 변화를 계산합니다.

Results

적용된 사이클의 수가 증가함에 따라 생체 내 힘줄의 기계적 특성이 더 크게 감소했습니다. 3,600 및 7,200 사이클 그룹에 비해 500 사이클 그룹의 히스테리시스와 로딩 및 언로딩 모듈이 현저히 감소했습니다(p < 0.05)(그림 2). 500 사이클에서 3,600 사이클 그룹으로 사이클당 피크 응력이 크게 감소했지만 500 사이클 그룹과 7,200 사이클 그룹 사이에는 유의한 감소가 없었습니다. 3,600 및 7,200 사이클 그룹에 대한 히스테리시스, 피크 응력, 로딩 및 언로딩 계수가 일관되게 감소했습니다. 힘줄 샘플의 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(eosin) 및 마손(Masson)의 삼색(Trichrome) 염색 이미지는 더 둥근 세포, 과세포성, 섬유 파괴 및 섬유 압착을 동반한 더 높은 배측굴곡 주기와 함께 더 높은 수준의 미세 구조 손상을 확인했습니다(그림 3). 이 논문의 결과는 배측굴곡 주기가 높을수록 아킬레스건 손상 수준이 증가한다는 것을 보여줍니다.

그림 1: 수동 발목 배측굴곡 시험 시스템. (A) 전원 공급 장치, (B) 마이크로 컨트롤러, (C) 스테퍼 모터, (D) 토크 센서, (E) 3D 전자기 포지셔닝 및 방향 센서, (F) 3D 프린팅 발목 마운트, (G) 3D 프린팅 동물 침대, (H) 3D 프린팅 노즈 콘 홀더. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 대표적인 순환 하중 응력-변형률 곡선. 히스테리시스 곡선은 0, 500, 1,000, 2,000, 3,600 및 7,200 사이클에서 나타납니다. 화살표는 싸이클 수가 증가함에 따라 피크 응력이 감소하는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 힘줄 샘플의 대표적인 조직학적 염색 이미지. 이 연구에서 500, 1,000, 2,000, 3,600 및 7,200 사이클 그룹에 대한 힘줄의 Hematoxylin 및 Eosin(왼쪽) 및 Masson의 Trichrome(오른쪽) 염색 이미지는 적용된 사이클 수를 늘리면 더 둥근 세포, 과세포성(별), 섬유 파괴 및 섬유 압착(화살표)이 발생한다는 것을 보여주었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 연구는 생체 내 과사용 유발 건병증 모델을 위해 수동 발목 배굴곡 시스템으로 쥐 아킬레스건에 주기적으로 하중을 가하는 방법을 제시합니다. 이 시스템의 중요성은 아킬레스건을 분리하고, 힘줄에 외과적으로 접근하지 않고도 정량화 가능한 하중을 가하고, 생체 내 힘줄 특성을 측정할 수 있는 능력에 있습니다.

2010년, Fung et al.은 맞춤형 테스트 시스템을 갖춘 쥐의 슬개건 피로 모델을 제시했습니다¹⁴. 그들의 연구는 힘줄을 노출시켜 슬개건에 직접 하중을 가하는 방법을 제시했습니다. 이 방법은 또한 힘줄에 정량화 가능한 피로 하중을 가하지만, 하중을 직접 가하면 피부 절개 및 후속 봉합에 추가적인 염증성 상처 치유 반응이 발생할 수 있습니다. 당사의 방법을 사용하면 비침습적으로 적용된 하중은 측정된 생물학적 반응이 외부 요인이 아닌 전적으로 하중 프로토콜에 기인하도록 합니다.

이 로딩 프로토콜의 중요한 구성 요소는 피드백 제어 루프입니다. 히스테리시스 하중 곡선의 기울기를 확인하고 필요한 경우 배굴곡 각도를 증가시킴으로써 시스템은 아킬레스건을 지속적으로 피로하게 합니다. 무릎 부목은 배측 굴곡이 무릎과 기타 주변 연조직을 움직이는 대신 힘줄에만 부담을 주기 때문에 중요한 단계입니다. 부목이 올바르게 수행되었는지 확인하려면 부목 후 발목을 수동으로 작동시켜 뻣뻣한 힘줄을 느끼고 순환 하중 단계 전에 생성된 히스테리시스 곡선을 모니터링합니다.

이 연구의 한계 중 하나는 변형률 값이 상대적으로 크다는 것입니다. 그러나 인간 아킬레스건의 수동적 배굴곡과 유사하며 아킬레스건과 비복근의 신장에 의해 발생할 수 있다¹⁸. 또 다른 한계는 토크와 응력 사이의 변환이 생체 외 에서 측정된 평균 힘줄 단면적과 발목 관절 주위의 모멘트 암으로 제한된다는 것인데, 이는 동물마다 다를 수 있습니다.

만성 건병증의 병리학과 초기 단계는 아직 밝혀지지 않았습니다. 나이 및 기타 위험 요인과 함께 과용은 만성 건병증의 발병에 기여하는 주요 요인입니다. 재현 가능한 과사용 부상은 당사 시스템을 통해 피로 순환 하중 시합을 여러 번 적용하여 시뮬레이션할 수 있습니다. 또한, 이 시스템의 비침습성은 건병증의 중요한 바이오마커를 이해하기 위해 장기간에 걸친 힘줄 손상 및 치유 반응의 생물학적 및 구조적 변화를 평가할 수 있도록 합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/32 "알루미늄 구슬
2.5 % 이소 플루란
3D 디지타이징 펜	Polhemus, Vermont, NH, USA
3D 전자기 포지셔닝 및 방향 센서	Polhemus, 버몬트, NH, 미국
% 이소 플루란
맞춤형 장치: 1) 조립, 센서, 3D 프린트된 동물 침대 및 발목 마운트 액추에이터			원고
MATLAB 코드	MATLAB, Natick, MA, USA
Microcontroller	Ivrea, Italy	Arduino UNO, Rev3
노즈 콘
메스와 메스 홀더			No. 11 메스
Sprague-Dawley 쥐	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		11-13 주 된
스테퍼 드라이버	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503	DM542T
스테퍼 모터	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503	23HE30-2804S
직선 펜치
토크 센서 어셈블리	Futek Inc., Irvine, CA, USA	FSH03985, FSH04473, FSH03927
물 가열 패드