Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

대식세포는 재생과 복구 과정에서 점점 더 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으며, 기존의 면역 기능을 넘어서는 것으로 나타났습니다 ^1,2. 실제로, 대식세포는 재생과 관련된 수많은 과정에 관여하며, 흉터 형성 및 섬유증뿐만 아니라 복구의 모든 단계에서 중요한 조절 활동을 나타냅니다 ^3,4. 조직 상주 대식세포는 다양한 세포 표현형을 유도하는 복잡한 메커니즘을 가진 매우 이질적인 세포 유형이며 장기 발달, 기능 및 항상성에 필수적인 역할을 합니다(⁵에서 검토). 조직 상주 대식세포는 처음에 난황낭과 태아 간의 전구체에서 발생하며, 이후 기존 대식세포의 수명과 이들이 상주하는 조직 또는 틈새에 따라 다양한 속도로 증식 또는 골수 유래 혈액 단핵구로 대체됩니다 ^6,7.

중요한 것은 조직에 상주하는 대식세포가 모든 조직에 분산되어 다양한 장기 기능에 기여한다는 것입니다. 틈새 특정 기능을 수행하기 위해 미세 환경에 의해 고유하게 프로그래밍됩니다. 이러한 이유로, 조직 내 대식세포의 국소화는 폐, 유선, 장, 피부 및 근육에서 관찰되는 독특한 개체군과 함께 대식세포의 기능에 대한 통찰력을 제공합니다 ^8,9,10. 유선이 발달하는 동안, 유관 대식세포는 유관 나무와 밀접하게 연관되어 있으며, 유관 대식세포의 고갈은 분지(branching)를 현저히 감소시킨다¹¹. 또한, 대식세포는 사춘기 중 형태 형성과 임신 중 폐포 형성에 필요하며, 상피를 적극적으로 모니터링합니다. 근육 손상의 경우, 대식세포의 특정 집단이 손상 부위 내에 "거주"하여 줄기 세포 증식에 필요한 증식 유도 신호를 제공하는 일시적인 틈새 시장을 제공합니다. 따라서, 그들은 복구 과정을 관장하는 데 있어 뚜렷한 대식세포 집단의 특수한 역할을 나타낸다². 폐에서도 간질성 대식세포가 IL-1B¹²의 방출을 통해 손상 관련 일시적 전구세포로 전환하기 위해 인터루킨(IL)-R1-R1 발현 폐포 II(AT2) 세포를 프라이밍하는 유사한 현상이 발생합니다. 또한, 최근 연구에 따르면 대식세포는 방사선 조사 후 쥐의 턱밑 타액선(SMG)의 재생에 필수적이며, 대식세포가 없으면 상피 재생이 방해를 받는다¹³. 종합하면, 이 데이터는 조직 손상 후 일시적인 염증성 틈새와 항상성 동안 대식세포 활성화 및 기능의 중요성을 강조합니다.

대식세포는 활성 세포이며, 그 기능은 직접 세포 간 접촉^(14,15)을 포함한 다양한 세포 유형과의 상호 작용뿐만 아니라 틈새 조절에 필수적인 수용성 인자 ^2,16의 분비와 같은 보다 간접적인 방법을 포함합니다. 고전적 면역형광 이미징은 이러한 상호작용을 밝히는 데 유용하지만, 시간상 단일 스냅샷만 묘사하여 매우 역동적인 재생 과정에 중요한 수많은 시점을 생략함으로써 한계가 있습니다^17,18. 타이밍의 중요성과 다양한 재생의 물결의 출현이 더욱 뚜렷하게 부각됨에 따라 이러한 과정을 더 자세히 분석하는 것이 필수적입니다.

방사선 치료는 암 진단을 받은 많은 사람들의 생명을 구하는 치료법입니다. 방사선 치료는 종양을 축소하거나 제거하는 데 효과적이지만, 방사선장에 있는 건강한 조직을 손상시키고 면역 반응을 유도할 수도 있습니다. 방사선 손상은 빠른 대식세포 모집 및 직간접적인 면역 조절 반응을 유도할 수 있다^19,20. 타액선은 두경^{부암 치료} 중에 종종 부주의하게 조사되어 상피 손상, 세포 위축 및 섬유증^23,24 또는 만성 구강 건조증을 초래한다²⁵.

타액선은 상피세포(타액을 생성하는 침샘 세포와 타액을 운반하는 유관 세포 모두), 근상피 세포, 상피 전구 세포, 신경, 혈관, 면역 세포, 섬유아세포 및 세포외 기질(ECM)을 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 세포 유형과 구조로 구성되어 있습니다. 재생 반응에서 이러한 세포 유형 중 많은 것의 역할 및 반응은 이전에 26,27,28,29,30에서 설명되었다. 그러나 이러한 서로 다른 세포가 항상성과 재생 중에 어떻게 상호 작용하는지, 특히 대식세포와 같은 면역 세포가 어떻게 행동하는지에 대해서는 잘 연구되지 않았습니다. 이 원고는 SMG 대식세포와 생체 외 조직에서 관심 있는 다른 세포 간의 실시간 상호 작용을 연구하기 위해 새로 확립된 방법을 설명합니다. SMG는 비브라톰에서 슬라이스되고, 표면 마커를 염색하고, 최대 12시간 동안 이미징됩니다. 이 방법을 사용하면 대식세포에 의한 주변 세포의 식세포작용을 관찰할 수 있고, 대식세포 이동 역학을 연구할 수 있으며, 대식세포와 상피세포 간의 직접적인 세포 간 상호작용을 입증할 수 있습니다.

모든 절차는 영국 내무부의 승인을 받았으며 PPL PB5FC9BD2 및 PP0330540에 따라 수행되었습니다. 모든 실험은 ARRIVE 지침과 에든버러 대학의 지침을 따릅니다.

야생형 마우스를 상업적으로 획득하였다( 자료표 참조). Krt14^크리어; R26^mTmG 마우스는 Krt14^CreER/+ 마우스³¹ 과 R26^mTmG/mTmG 마우스³²를 교배하여 사내에서 사육하였다. 모든 실험에서 8-10주 된 암컷 쥐를 사용했습니다.

1. 기관단총 수집 및 내장

1. 생쥐/생쥐를 이산화탄소(CO₂) 농도 상승에 노출시켜 안락사시킵니다. 그런 다음 절개 부위에 70% 에탄올(EtOH)을 분사하고 가위와 겸자를 사용하여 주변 조직에서 SMG를 조심스럽게 절개합니다(그림 1A). 겸자를 사용하여 지방과 결합 조직을 제거하고 얼음처럼 차가운 Hanks Balanced Salt Solution(HBSS, 재료 표 참조)이 들어 있는 수집 튜브에 동맥을 넣습니다.
2. 집게를 사용하여 글랜드를 각각 약 1cm² 크기의 조각으로 분리합니다.
3. 4% 아가로즈를 50°C로 가열한 다음 35mm 접시에 직접 붓습니다.
4. 녹인 50°C 아가로스를 소량의 별도 접시에 붓고 여분의 아가로스에서 글랜드를 움직여 완전히 헹굽니다.
   알림: 이 단계는 땀샘에서 과도한 액체를 제거하는 데 필요합니다. 과도한 액체는 땀샘이 아가로스에 제대로 부착되는 것을 방해할 수 있습니다.
5. 샘의 4-6개 조각을 아가로스에 배치하여 평평하게 놓여 있고 동일한 평면에 있는지 확인합니다(그림 1A).
   알림: 땀샘이 한천 표면이나 접시 바닥에 닿지 않도록 하십시오.
6. 35mm 접시에 뚜껑을 덮고 아이스박스로 옮겨 얼음으로 덮습니다.
7. 아가로스가 굳을 때까지 5-10분 동안 기다립니다.

2. 단면

1. 메스를 사용하여 땀샘에 박힌 아가로스 블록 주위를 조심스럽게 자르고 접시에서 조직이 들어 있는 블록을 제거합니다. 약 5mm의 테두리를 남겨 둡니다.
2. 초강력 접착제 한 방울을 도포하여 아가로스 블록을 비브라톰의 단계( 재료 표 참조)에 부착하고 블록의 전체 바닥 표면이 초강력 접착제와 접촉하도록 합니다.
3. 초강력 접착제가 약 5분 동안 굳도록 합니다. 그런 다음 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 함유한 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 비브라톰 챔버를 채웁니다.
4. 비브라톰 챔버의 측면과 하단 모두에 얼음을 추가합니다.
   알림: 매우 추운 환경을 유지하고 필요에 따라 얼음을 교체하십시오.
5. 여분의 아가로스를 잘라내고 메스로 절개하여 각 샘 사이에 5mm의 간격을 만듭니다. 이렇게 하면 개별 슬라이스가 생성됩니다.
6. 비브라톰 블레이드를 아가로스 블록의 면에 맞추고 단면의 시작점과 끝점을 설정하여 원하는 슬라이스 두께를 얻습니다.
7. 절단 공정을 시작하기 전에 날이 블록에 닿지 않았는지 확인하십시오. 이 예방 조치는 실수로 큰 아가로스 조각을 절단하여 샘플의 일부를 잃는 것을 방지합니다.
8. 저속 및 고진동(예: 각 매개변수에 대해 1-10의 척도에서 속도 3 및 8-10의 진동 설정)에서 두께가 150μm인 단면을 절단합니다(그림 1A).
9. 단면이 잘려서 주변 PBS로 방출되면 붓을 사용하여 단면을 모아 P/S가 있는 미리 예열된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 미디어가 들어 있는 접시에 넣습니다.

3. SMG 슬라이스의 배양 및 염색

1. 배양
   1. 0.4μm 필터가 포함된 6웰 플레이트의 각 웰에 1.5mL의 RPMI 배지를 추가합니다. 필터 아래에 기포가 끼지 않았는지 확인하십시오.
   2. 붓을 사용하여 각 필터에 1-6개의 조각을 옮기고 조각이 깨지지 않도록 주의합니다.
      알림: 슬라이스가 미디어에 잠기지 않고 필터 위에 떠 있는지 확인하십시오. 완전히 물에 잠기면 배양 중에 질식할 수 있습니다.
   3. 37°C에서 5%_CO2로 배양하고 3일마다 배지를 교체합니다(그림 1A).
   4. 시중에서 판매되는 방사선 조사기를 사용하여 10Gy 감마선의 단일 선량으로 실험판을 조사합니다( 재료 표 참조). 그런 다음 인큐베이터에 다시 넣습니다.
2. 라이브 이미징을 위한 염색
   1. 붓을 사용하여 필터에서 슬라이스를 부드럽게 들어 올려 웰당 500μL의 배양 배지가 들어 있는 24웰 플레이트에 넣고 슬라이스를 잠급니다.
   2. 관련 복합 항체 및 핵 염색( 재료 표 참조)을 적절한 농도로 배지에 첨가한다²⁷.
   3. 항체가 있는 슬라이스를 37°C에서 2시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다.
   4. 슬라이스를 배양 배지에 담그고 37°C에서 부드럽게 저어주면서 10분씩 3회 세척하여 세척합니다.

4. 장착 및 라이브 이미징

1. 겸자를 사용하여 양면 이미징 스페이서의 한쪽 면에서 테이프를 제거하고 접착면이 아래로 향하도록 유리 바닥 6웰 플레이트의 바닥에 부착합니다.
2. 50μL의 매체를 스페이서 중앙의 틈에 피펫팅합니다.
3. 붓을 사용하여 슬라이스를 미디어에 넣고 기포가 갇히지 않고 평평하게 놓이도록 합니다.
4. 피펫을 사용하여 틈에서 20μL의 배지를 조심스럽게 제거합니다.
5. 집게를 사용하여 스페이서의 윗면에서 테이프를 제거하고 그 위에 25mm 원형 커버슬립을 놓습니다. 너무 많은 힘을 가하여 커버슬립이 부러지지 않도록 주의하면서 스페이서의 가장자리를 눌러 커버슬립이 단단히 부착되도록 합니다(그림 1A).
6. 컨포칼 현미경에서 원하는 시간 또는 간격(예: 20x 물 대물렌즈를 사용하여 12시간 동안 15분마다)으로 슬라이스를 이미지화합니다.

턱밑 타액선의 손상에 대한 대식세포의 반응은 아직 알려져 있지 않습니다. 여기에는 땀샘 내의 특정 구조로 위치를 파악하고 이동하는지 여부와 이동하는 거리와 속도가 포함됩니다. 이는 정적 이미징 접근 방식으로는 파악하기 어려웠습니다.

이 문제를 해결하기 위해 대식세포-상피 세포 상호 작용을 실시간으로 연구하는 실시간 이미징 접근 방식이 개발되었습니다. 절편의 면역형광 염색은 내인성으로 표지된 계통 추적 마우스 모델과 결합되었습니다(그림 1A 및 그림 2A). 이 모델에서는 절편을 10Gy의 감마선 조사에 노출시켜 방사선 조사 손상을 유도하고 방사선 조사(IR) 후 2시간, 3일, 4일에 이미징했으며, 방사되지 않은 절편을 대조군으로 사용했습니다. 데이터는 Hoechst(광독성을 최소화하기 위해 레이저 425 사용), GFP(488), dTomato(561) 및 Alexa 647(640)의 4개 채널에서 수집되었습니다. z-stack을 수행하고, 2-3 μm마다 이미지를 캡처하고, 총 30-40개의 평면을 수집하여, 전체 높이를 80-90 μm로 만들었습니다.

이 기법을 사용하여 막 결합 토마토(mT) 신호와 Caspase3/7 활성을 분석한 결과, 기관형 절편이 상피 구조를 유지하고 배양에서 생존하며 세포 사멸을 최소화한다는 것이 분명해졌습니다. 이 데이터는 7일 동안 배양된 R26mTmG 마우스(32)의 턱밑샘의 방사선 조사되지 않은 절편이 mT 신호 및 상피 구조를 유지한다는 것을 보여주었습니다(그림 1B). 그러나, 체외 방사선 조사 후 3일째 되는 날에, 아시나 및 유관 세포 위축이 뚜렷하게 나타났으며(그림 1B; acini 및 ductal structure는 각각 흰색 점선과 녹색 점선으로 강조 표시됨), in vivo radiation injury13와 일치하였다. 방사선 조사가 이루어지지 않은 절편에서는 세포사멸이 무시할 수 있었지만, 방사선 조사 후 4일에 조사된 절편에서 카스파제 3/7+ 세포의 증거가 있었으며(그림 1C; 녹색 화살표), 생체 내 손상33,34과 유사했다. 또한, 방사선 조사된 절편은 방사선 조사되지 않은 대조군에 비해 γH2AX38 상승에 의해 표시된 바와 같이 생체 내 DNA 손상 34,35,36,37을 재현했습니다(그림 1D,E). 따라서, 기관형 타액선 절편은 배양에서 양호한 생존력을 나타냈고, 방사선 조사에 대한 생체내 조직과 유사하게 반응하였다.

그 후, 실시간 세포 간 상호 작용을 조사했습니다. GFP 표지 상피 전구 세포(Krt14CreER-GFP)와 직접 상호 작용하는 대식세포는 IR 후 3일에 12시간 동안 관찰되었습니다(그림 2A 및 비디오 1). 놀랍게도, 대식세포는 몇 시간 동안 상피 전구 세포에 근접해 있었고, 종종 전체 12시간 이미징 기간 동안 접촉을 유지했습니다. 또한, 대식세포에 의한 상피세포의 실시간 식세포작용이 관찰되어 대식세포가 절편 배양 모델에서 전통적인 기능을 수행함을 확인할 수 있었습니다(그림 2B, 동영상 2 및 동영상 3). 이 기술은 또한 대식세포가 항상성 동안과 방사선 조사 손상 후 조직 내의 높은 밀도로 인해 상대적으로 고정되어 있음을 확인했습니다. 이것은 처음으로 타액선 대식세포가 항상성 동안 또는 방사선 조사 손상 후에 광범위하게 이동하지 않는다는 것을 보여줍니다. 그러나 대식세포는 유의미한 이동을 보이지 않았지만 주변 조직은 방사선 조사 후 증가된 역동성을 보였으며 여러 대식세포가 표지된 상피 세포 클러스터 주변에서 활발하게 상호 작용했습니다. 또한 핵 염색만을 기반으로 하는 이 기술을 통해 시간 경과에 따른 절편 내 세포 이동을 시각화할 수 있었으며, 종종 전체 덕트가 조직 내에서 '이동'하는 것처럼 보였습니다(비디오 4). 배양 과정에서 시간이 지남에 따라 절편이 평면에서 스페로이드 형태의 형태로 이동한다는 것이 분명해졌으며, 이는 절편 내 세포 이동이 잠재적인 재편성 사건과 유사한 구형 구조로의 재배열로 인한 것일 수 있음을 시사합니다.

마지막으로, 이 분석에 의해 생성된 라이브 이미징 데이터는 이동과 같은 세포 거동을 정량적으로 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 개별 세포를 검출 및 분할할 수 있으며(그림 3A), 시중에서 판매되는 이미징 및 분석 소프트웨어를 사용하여 이동을 측정할 수 있습니다( 재료 표 및 비디오 5 참조). 또한 가장 가까운 물체 분석을 수행하여 세포(이 경우 대식세포)가 관심 있는 다른 세포(이 경우 Krt14CreER-GFP+ 세포)에 더 가깝게 이동하는지 여부와 이 역학이 시간이 지남에 따라 어떻게 변하는지 확인할 수 있습니다(그림 3B).

그림 1: 정밀하게 절단된 타액선 조직 절편에서 생체 내 반응의 재현. (A) 실험 프로토콜의 개략도. (B) 신선한 턱밑샘(SMG) 조직, 7일 동안 배양된 조작되지 않은 SMG 절편 또는 3일 또는 7일 전에 10Gy 감마선 조사의 단일 선량으로 조사된 SMG 절편에서 얻은 막 결합 토마토의 대표 이미지. 흰색 점선은 acinar 구조의 예를 나타내고 녹색 점선은 ductal 구조의 예를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. (C) 2시간 또는 4일 전에 10Gy 감마선 조사의 단일 선량으로 조사된 조작되지 않은 SMG 절편 또는 SMG 절편에서 얻은 Caspase-3/7 발현의 대표 이미지. 녹색 화살촉은 양성 핵을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. (D) 3일 전에 10Gy 감마선 조사의 단일 선량으로 조사한 조작되지 않은 SMG 절편 또는 SMG 절편에서 얻은 γH2AX 발현의 대표 이미지. 스케일 바 = 20 μm. (E) 2시간 및 3일 전에 10Gy 감마선 조사의 단일 용량으로 조사된 조작되지 않은 SMG 절편 또는 SMG 절편에서 EpCAM+ 상피 세포에서 γH2AX의 대표적인 발현. SSA = 측면 산란 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 대식세포-상피세포 상호작용 및 식세포작용의 실시간 이미징. (A) KRT14+ 전구세포와 그 자손(Krt14CreER-GFP+ 세포) 및 방사선 조사 후 대식세포 간의 상호 작용에 대한 순차적 정지 이미지. 살아있는 세포 이미징은 90분 동안 세포 역학을 캡처합니다. 눈금 막대 = 20μm. 연결된 비디오는 비디오 1입니다. (B) 상피 세포를 식세포화하는 대식세포의 순차적 정지 이미지. 살아있는 세포 이미징은 60분 동안의 과정을 보여줍니다. 흰색 화살표는 대식세포를 가리키고 노란색 화살표는 식세포작용이 진행되는 세포핵을 나타냅니다. 눈금 막대 = 50μm. 연결된 비디오는 비디오 2입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 세포 역학 분석을 위한 실시간 이미징. (A) 이동과 같은 세포 행동 매개변수를 분석하기 위한 개별 세포 식별 및 분할을 보여주는 이미지( 비디오 5 참조). 세포는 개별 세포 및 추적 구별을 위해 무작위로 유사 채색됩니다. 스케일 바 = 100 μm. (B) 10개의 시점에 걸쳐 플로팅된 개별 Krt14CreER-GFP+ 세포에 가장 가까운 물체까지의 거리(μm)를 정량화합니다(5분마다 캡처된 이미지). 웰당 평균값으로 표시되는 데이터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: 방사선 조사 후 KRT14+ 전구 세포/자손과 대식세포 간의 동적 상호 작용을 보여주는 실시간 이미징. 슬라이스는 실시간 이미징 전에 단일 10Gy 감마 방사선 조사에 노출되었습니다. Krt14CreER-GFP+ 세포는 녹색, 대식세포(F4/80+)는 빨간색, 핵은 청록색으로 표시됩니다. 비디오는 15분마다 캡처된 이미지와 함께 12시간 배양 기간에 걸쳐 단일 z 스택으로 구성됩니다. 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2: 상피 세포를 집어삼키는 대식세포를 캡처한 라이브 이미징. 대식세포(F4/80+)는 빨간색으로 표시되고 핵은 청록색으로 표시됩니다. 비디오는 단일 z 스택으로 구성되어 있으며 15분마다 촬영된 이미지로 12시간 배양 기간에 걸쳐 있습니다.비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 3: 상피 세포를 집어삼키는 대식세포를 보여주는 최대 투영 라이브 이미징. 대식세포(F4/80+)는 빨간색으로 표시되고 핵은 청록색으로 표시됩니다. 이 비디오는 총 80μm( 비디오 2에는 단일 평면이 표시됨)의 z-스택 이미지를 최대 투영하고 15분마다 촬영한 이미지로 12시간 배양 기간에 걸쳐 있습니다.비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 4: 방사선 조사 후 배양에서 타액선 상피의 동적 거동을 보여주는 라이브 이미징. 슬라이스는 라이브 이미징 전에 단일 10Gy 감마 방사선 조사를 받았습니다. 대식세포(F4/80+)는 빨간색으로, 핵은 청록색으로 표시됩니다. 이 비디오는 15분마다 캡처된 이미지와 함께 12시간 배양 기간에 걸쳐 단일 z-스택으로 구성됩니다.비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 5: 시간 경과에 따른 정량적 세포 이동 추적. 이 비디오는 라이브 이미징 비디오에서 세포 추적의 개별 추적을 보여줍니다. 화살표는 셀 트랙을 나타내며 셀은 개별적으로 의사 색상입니다. 비디오는 단일 z 스택으로 구성되어 있으며 15분마다 촬영된 이미지로 1시간 배양 기간에 걸쳐 있습니다.비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.