방법 논문

효소 결합 면역흡착 분석법/면역형광 분광광도측정을 통한 식물 조직 내 칼로스 정량

DOI:

10.3791/65833

⸱

2026년 5월 22일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 식물 샘플 내 칼로스가 굳은칼로스 특이적 항체에 결합한 후 효소 표지 검출 항체를 통해 결합된 칼로스를 효소 활성 측정으로 정량하는 면역형광 분광광도(ELISA)를 사용하여 식물 조직에서 칼로스를 정량화합니다.

초록

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식물 조직에서 칼로스를 정량하는 기존 방법으로는 후형형광현미경, 형광분광광도계, 면역형광현미경, 칼로스 합성효소 및 β-(1,3)-글루카나제 활성의 간접 평가가 포함됩니다. 하지만 이들 방법 중 일부는 시간이 많이 걸리고, 굳은살에 특이적이지 않으며, 노동 집약적이며, 주관적이며, 높은 자가형광, 낮은 감도, 정량보다는 정성적이고, 소프트웨어 자원과 기술 역량 습득이 필요하다는 등 상당한 한계가 있습니다. 따라서 식물 조직에서 칼로스 정량화를 위한 대체 방법을 모색할 시급한 필요가 있습니다. 면역형광 분광광도법 또는 칼로스 특이적 항체를 사용하는 효소 연관 면역흡착 분석법(ELISA)이 현재의 칼로스 정량 방법의 일부 한계를 극복할 수 있을 것이라는 가설이 제기되었습니다. 생물학적 스트레스는 조직 배양에서 유래한 바나나 식물에 Xanthomonas vasicola pv를 접종하여 투여했습니다. 칼로스 생성을 유도한 musacearum (Xvm) 박테리아. 바나나 구근 조직 샘플은 접종 14일(dpi)에 새로운 면역형광 분광광도법을 사용하여 칼로스 정량화를 위해 채취되었습니다. Xvm 접종군과 대조군의 구근 생성은 바나나 유전자형 모두에서 유의미하게 변했습니다(독립 표본 t-test, p < 0.05). 여기서 설명한 면역형광 분광광도측정법은 굳은뼈에 대한 높은 특이성, 민감도, 신뢰성 및 재현성을 가진 다양한 식물 조직의 칼로스 정량화에 적용될 수 있습니다. 또한 96웰 플레이트를 사용하여 샘플링 및 분석 편향이 최소화된 고처리량 칼로스 정량 연구에 적합합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

칼로스는 β-1,3-글루칸의 다당류로, 다양한 고등 식물의 세포벽에서 자연적으로 발견되는 화합물입니다. 칼로스는 칼로스 신타스(CalS)에 의해 합성되며, β-(1,3)-글루카나제 1,2,3에 의해 분해됩니다. 성장과 발달, 그리고 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 반응 등 여러 생물학적 과정에 관여합니다 4,5,6. 병원체 감염 시, 유두에서 칼로스 침착이 증가하면 미생물의 추가 집락을 방지하여 인접 식물 세포 2,4,7,8,9,10,11,12 사이의 투과성 장벽 역할을 합니다 . 공격받은 조직 내 병원체 침입을 늦추어 칼로스 침착은 추가 방어 반응을 유도할 시간을제공합니다. 식물 조직 내 칼로스의 정확한 시공간 정량화는 다양한 생리학적 과정에서 칼로스의 역할을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 식물 조직에서 칼로스를 정량하는 현재 방법들, 즉 에피형광 현미경, 면역형광 현미경, 형광 분광광도법은 상당한 한계와 정량화 과제를 가지고 있습니다. 따라서 이러한 단점을 극복하기 위해 칼로스 정량화의 대체 방법을 모색할 시급한 필요가 있습니다. 면역형광 분광광도법 또는 효소 연관 면역흡착 분석법(ELISA)이 식물 샘플에서 칼로스 정량의 보다 효율적인 방법을 제공할 수 있다고 가설이 세워졌으며, 이는 높은 특이도, 민감도, 신뢰성, 재현성 및 고처리량 방법을 제공한다.

칼로스 정량화의 골드 스탠다드 방법은 에피플루오레스코 현미경14, 15, 16, 17을 이용한 아닐린 블루 염색 칼로스 입자를 이미징하는 것입니다. 파란색으로 염색된 칼로스는 파란색 또는 자외선(UV) 여기에 노출되면 노란색 형광 입자로 나타나며, 이는 형광 칼로스 입자14, 15의 수를 수동으로 계산하거나 자동 칼로스 카운팅 소프트웨어로 셀 수 있습니다. 칼로스 입자의 수동 계수는 연구자에게 노동적이고 시간이 많이 소요되며 주관적이지만, 자동 계수는 소프트웨어 자원과 상당한 기술 역량을 확보해야 합니다. 자동 칼로스 카운팅에 사용되는 소프트웨어로는 ImageJ19, 20, 21, 22, 포토샵23, 칼로스메저24, 아이시18, 25, 일라스틱26 등이 있습니다. 아닐린 청색 염색된 칼로스는 형광 분광광도 17,19,27,28,29를 사용해 정량화할 수 있습니다. 그러나 후반형광 현미경과 형광 분광광도측정법과 관련된 높은 배경/자가형광 현상으로 인해 신호 대 잡음비가 낮아 이러한 방법들이 어렵고 신뢰성이 떨어집니다26. 더불어 아닐린 블루는 칼로스30 외에도 다른 β-1,3-글루칸을 염색할 수 있어, 칼로스 검출 및 정량을 위한 형광 현미경 및 형광 분광광도법 모두 부분적으로 비특이적이고 신뢰할 수 없습니다. 칼로스 특이적 항체를 기반으로 한 칼로스 정량을 위한 면역형광 현미경 방법도 여러 연구에서 사용되었습니다31, 32, 33. 이 방법은 아닐린 블루 염색 굳게뇌의 에피형광 현미경과 몇 가지 단점이 있지만, 여기서 사용되는 항체 덕분에 굳은살 특이적이라는 장점이 있습니다. 칼로스 정량화는 효소 활성 기반 방법으로도 수행되었습니다. 칼로스 정량을 위한 효소 활성 기반 방법으로는 칼로스 합성효소(CalS)20,33와 β-(1,3)-글루카나제 활성평가 34,35가 포함됩니다. 효소 활성 기반 방법은 에피플루오레센스 현미경, 면역형광 현미경, 형광 분광광도법에 비해 몇 가지 단점이 있습니다. 여기에는 칼로스의 간접 추정, 효소 추출 및 효소 활성 분석의 어려움, 식물 조직 내 칼로스의 고르게 분포되지 않은 점이 포함됩니다.

에피형광 현미경, 면역형광 현미경, 형광 분광광도계, CalS 및 β-(1,3)-글루카나제 분석 등 현재의 칼로스 정량 방법들의 단점 때문에, 다음과 같은 여러 장점을 제공하는 새로운 칼로스 정량 방법이 필요했습니다. 이 방법은 1) 높은 특이성, 민감도, 신뢰성 및 재현성, 2) 고처리량 능력과 함께 칼로스 정량 측정이 용이하다는 점입니다. 칼로스 정량을 위한 면역형광 분광광도법의 사용은 아직 탐구되지 않았습니다. 여기서는 면역형광 분광광도계를 기반으로 한 칼로스 정량화의 새로운 방법, 특히 효소 연관 면역흡착 분석법(ELISA)이 보고되었습니다. 이 방법은 다양한 식물이나 그 조직에서 칼로스를 정량화하는 데 최적화될 수 있으며, 칼로스에 대한 높은 특이성, 정밀도, 재현성, 그리고 고처리량 실험 능력을 갖추고 있습니다. 이 방법은 식물성 분석물에 대한 항체가 있다면 그 분석물에 대한 항체가 있다면 그 분석물을 정량화하는 데 수정할 수도 있습니다. 식물 조직 내 칼로스의 시공간적 정확하고 효율적이며 신뢰할 수 있는 분포를 보장하기 위해, 현미경, 분광광도계, 효소 활성 기반 방법 등 다양한 칼로스 정량 방법을 동시에 사용하는 것이 권장됩니다. 따라서 이를 통해 칼로스가 다양한 생리적·스트레스 반응에서 어떤 역할을 하는지 정확하고 효율적으로 이해할 수 있게 됩니다.

프로토콜

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1. 실험용 식물 접종

  1. 표준 절차36,37에 따라 Xvm 접종을 분리, 준비 및 확인하세요. 조직 배양에서 유래한 Musa balbisiana와 Mbwazirume 식물 10종을 무작위로 선별하고, 가장 어린 완전히 열린 잎 잎자루의 등쪽에 PCR 확인된 Xvm 접종구 200 μL(1 x 108 세포)을 접종합니다(그림 1)38.
  2. 마찬가지로, 무작위로 10개의 무사 발비시아나 와 음바지루메 바나나 식물을 선택해 200 μL 멸균 증류수(SDW)로 접종합니다.
  3. Xvm 접종 바나나 식물은 스크린하우스에서 25°C에서 12시간 빛, 12시간 어두운 광률을 적용하며 3일마다 물을 주며 유지하세요.
    참고: 재료 및 장비 목록과 버퍼 레시피는 각각 자 재표 와 표 1 을 참조하십시오.

2. 구대 조직 샘플 채취 및 샘플 준비

  1. 파괴 샘플링을 수행하여 실험 식물에서 구근 샘플을 채취하세요(그림 1).
  2. 접종 14일째(DPI)에 멸균 수술용 칼날로 약 2g의 구근 샘플을 신속히 절제하여 각각 라벨이 붙은 50mL 튜브에 넣습니다. Xvm 접종 식물과 대조 식물에서 각각 채취한 10개의 샘플 모두에 대해 이 작업을 수행하세요.
  3. 즉시 샘플이 담긴 50mL 튜브를 액체 질소에 담가.
  4. 샘플을 실험실로 옮겨 -80 °C에서 보관하다가 준비를 마친다. 샘플은 −80 °C에서 최대 1년 이상 최소한의 동결-해동 주기로 보관합니다.
  5. 샘플을 동결건조기로 72시간 동안 동결건조합니다(그림 1).
  6. 정확히 30mg의 동결건조 샘플을 2mL 튜브에 넣고, 그 튜브에 2개의 강철 자전거 구슬이 들어 있으며, 5mg으로 1분 동안 속도를 조절하여 미세한 분말로 분쇄합니다(그림 1).
  7. 분쇄된 샘플은 시원하고 건조한 실온에 보관하며, 충분히 밀봉하여 진행 준비가 될 때까지 보관하세요. 분쇄된 샘플은 상온에서 최대 4개월, 또는 −80°C에서 최대 1년간 최소 동결-해동 주기로 보관합니다.

3. 칼로스 추출 및 라미나린 표준 및 블랭크 준비

  1. 30mg의 분쇄된 구슬 샘플에서 칼로스를 추출하기 위해, 1M NaOH 800 μL 1을 추가하고 80°C에서 30분간 수조에서 배양하며, 10분마다 가끔 소용돌이가 일어나면서27,41 단계를 진행합니다(그림 1, 6단계).
  2. 샘플을 실온(약 5분)까지 식힌 후 15,294 x g 에서 5분간 원심분리합니다.
  3. 상원액(칼로스 추출물)을 멸균된 2 mL 튜브로 옮기고, 차단 버퍼(표 1)와 함께 1:2 비율로 희석합니다.
    참고: 희석 계수는 예비 실험과 최적화를 바탕으로 선택하세요. 칼로스 추출물의 희석이 필요할 수도 있고 아닐 수도 있습니다. 필요 시 블로킹 버퍼에서 희석을 수행하고, 서로 다른 샘플 유형에 맞게 표준 곡선 범위 내에 있도록 희석 비율을 최적화해야 합니다.
  4. 칼로스 추출물을 -20 °C에 보관하세요. 칼로스 추출물을 최대 6개월간 최소한의 동결-해동 주기로 보관하세요.
  5. 100 mg/mL 농축 라미나린 표준 액체를 1 M NaOH 6,42,43,44,45에 준비합니다.
    참고: 라미나린은 1-3-β-글루칸 중합자로, 면역형광 분광광도측정에서 칼로스 상당물의 표준으로 사용할 수 있습니다.
  6. 표준 상태를 80 °C에서 수욕에서 부드럽게 흔들어 모든 층상이 완전히 녹을 때까지 약 20-40분 정도 격화합니다.
  7. 용해된 표준물을 실온(약 10분)까지 냉각하세요.
  8. 블로킹 버퍼를 사용해 농축된 100 mg/mL에서 시작하여 80 mg/mL, 60 mg/mL, 40 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 1 mg/mL, 1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.1 mg/mL, 0.01 mg/mL 농도의 라미나린 표준 제약을 준비합니다.
  9. 빈 재료는 1M NaOH와 블로킹 버퍼를 1:2 비율로 혼합하여 준비합니다. 희석이 필요하다면, 칼로스 추출물을 준비할 때 사용한 희석 비율을 사용하세요.
  10. 라미나린 표준과 빈 상태는 −20 °C에 보관합니다. 표준과 빈 칼을 최대 6개월간 최소한의 냉동 해동 사이클로 보관하세요.

4. 면역형광 분광광도측정법에 의한 칼로스 정량

  1. 코팅 버퍼를 사용해 조제한 1차 항체(1-3-β-글루칸 지향 마우스 IgG) 100 μL를 폴리스티렌 ELISA 플레이트의 96개 웰 각각에 첨가합니다(그림 2).
  2. 플레이트를 파라핀 필름으로 단단히 밀봉한 후 냉장고에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양하세요.
  3. 다음 날, 접시를 벤치 위에 올려놓고 실온(약 10분)까지 두세요.
  4. 표준 블롯 및 세척 절차로 플레이트를 세척하세요46. 간단히 세척 버퍼 200 μL(표 1)을 웰에 추가하고, 디지털 셰이커를 사용해 500 rpm에서 30초간 소용돌이로 돌린 후 휴지에 블롯을 합니다. 이 세척 과정을 두 번 반복합니다(그림 2). 웰이 완전히 마르지 않도록 하고, 무균 마이크로피펫 팁을 사용해 웰의 바닥과 벽에 닿지 않도록 기포를 제거하세요.
  5. 각 웰에 차단 버퍼 200 μL를 추가하고(그림 2), 판을 파라핀 필름으로 단단히 밀봉합니다. 37°C에서 4시간 부화하세요. 위에서 언급한 대로 접시를 세척하세요(그림 2).
  6. 지정된 웰에 10개의 Xvm 접종 식물과 10개의 대조군 식물에서 추출한 칼로스 추출물을 100 μL를 추가하세요. 다른 우물에 100 μL 라미나린 기준물을 추가하세요. 블랭크 100 μL을 다른 웰에 추가합니다(그림 2).
  7. 플레이트를 파라핀 필름으로 단단히 밀봉한 후 냉장고에서 4°C에서 하룻밤 배양하세요. 위에서 언급한 대로 접시를 다시 세척하세요(그림 2).
  8. 각 웰에 블로킹 버퍼를 사용해 조제한 1차 항체(1-3-β-글루칸 지향 마우스 IgG) 100 μL를 첨가합니다(그림 2).
  9. 플레이트를 파라핀 필름으로 단단히 밀봉하고 37 °C에서 4시간 배양한 후 위 그림 2에 따라 세척합니다.
  10. 각 웰46,47에 항마우스 IgG-알칼리성 인산효소 2차 항체 100 μL을 첨가합니다 (그림 2).
  11. 판을 파라핀 필름으로 단단히 밀봉한 후 냉장고에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양하세요. 그 다음 위에 표시된 대로 플레이트를 세척합니다(그림 2).
  12. 신선하게 준비된 파라-니트로페닐 인산염(pNPP) 용액 100 μL를 1 mg/mL 농도로 웰에 첨가합니다(표 1).
  13. 플레이트를 실온에서 30분48분간 부화시킵니다.
    참고: 배양 시간은 식물 샘플과 사용되는 표준에 따라 다를 수 있습니다. 이 연구에서 라미나린이 30분으로 가장 좋은 측정값을 보였습니다.
  14. 각 웰48 에 신선하게 준비된 정지 용액(0.5 M NaOH)을 100 μL을 첨가하여 반응을 종료합니다(그림 2).
  15. 플레이트를 마이크로플레이트 리더기(37°C로 평형)로 옮기고, 중간 속도로 1분간 흔들고, 흡광도는 405 nm48 에서 측정합니다(그림 1, 그림 2).

5. 데이터 분석

  1. 405 nm 거리에서 라미나린 흡수율을 라미나린 농도(μg/mL)에 대해 단순 선형 회귀분석을 수행하여 표준 곡선을 얻습니다. 표준 곡선의 방정식은 다음과 같습니다.
    Y = β1X + β0
    여기서 Y는 405 nm에서의 라미나린 흡수, β1 은 회귀선의 기울기(피어슨 상관계수), X는 로그10 (라미나린 농도 μg/mL), β0 은 y-인터셉트입니다.
  2. 구근 샘플의 칼로스 농도를 샘플 흡광에서 블랭크 흡광도를 빼서 계산합니다. 그 다음 표준 곡선을 사용해 라미나린 상당량(LE)으로 칼로스 농도를 μg/mL 단위로 추정합니다.
  3. 분포의 정규성 데이터를 샤피로-윌크 검정으로 검토하고, 분산의 동분산성은 레벤 검정(α > 0.05)으로 검사합니다.
  4. 독립 표본 t-검정을 활용하여 Xvm 접종군과 대조군 간의 칼로스 생성을 비교하세요(p≤ 0.05).

결과

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알려진 라미나린 표준 농도는 분광광도측정법을 통해 분석되었고, 이에 대응하는 흡광도 값이 기록되었습니다. 이 데이터를 바탕으로 라미나린 표준 농도를 x축에, 흡광도를 y축에 표시하여 Beer-Lambert 플롯을 구성했습니다. 회귀선의 방정식은 y = 0.5079x − 0.04534(그림 3)49였다. Beer-Lambert 플롯은 상관계수 (r)가 0.9988, 결정 계수(r2)가 0.9975로 높았으며, 이는 농도와 흡광도 사이에 강한 선형 관계가 있음을 나타냈으며, 종속 변수(흡수도)의 분산 최대 0.9975는 독립 변수(농도)로 설명되었다. 그림 3; p<0.0001). 따라서 이 모델은 라미나린과 굳은뇌의 농도를 예측하는 데 적합하고 정확하며 신뢰할 수 있었습니다. 바나나 코름 샘플 내 칼로스 농도는 분광광도계를 통해 흡광도를 측정하고, 흡광도 값을 사용해 칼로스 농도를 계산하여 결정했습니다.

면역형광 분광광도측정법 검사에서는 Xvm 접종 식물에서 두 바나나 유전자형에서 대조군에 비해 유도된 칼로스가 유의미하게 증가하는 것으로 나타났습니다(독립 표본 t-검정, p < 0.05; 그림 4). 대조군에서 14 dpi 시의 칼로스 생산량은 각각 음바지루메와 발비시아나의 경우 1474.34 mg/mL, 1037.11 mg/mL였습니다(그림 4). Xvm 접종 결과, Xvm 접종 Mbwazirume와 M. balbisiana의 식물 구근에서 각각 14 dpi의 칼로스가 4190.78 mg/mL와 1996.07 mg/mL가 나타났습니다(그림 4). Xvm 접종은 대조군에 비해 칼로스 생산량이 1.9배에서 2.8배 증가했습니다(독립 표본 t-test, p < 0.001; 그림 4).

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그림 1: 새로운 면역형광 분광광도측정법에 의한 칼로스 정량화에 포함된 주요 단계의 개략 도서. 이 그림은 바나나 조직에서 칼로스 정량화에 필요한 주요 단계를 보여주는데, 여기에는 조직 배양에서 유래한 식물 양육, Xvm 접종, 구근 조직의 파괴적 샘플링, 샘플의 동결 건조, 칼로스 추출, 그리고 새로운 면역형광분광광도법에 의한 칼로스 정량 등이 포함됩니다. 이 수치는50개가 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: 칼로스 정량을 위한 면역형광 분광광도법의 상세 도식. 이 그림은 칼로스 정량화를 위한 면역형광 분광광도법 방법을 상세히 시연하며, ELISA 플레이트에 다양한 성분이 어떻게 적재되는지, 그리고 칼로스가 최종적으로 분광광도계로 정량화되는 과정을 보여줍니다. 이 수치는50개가 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: 단백질 정량화. Beer-Lambert 플롯은 알려진 농도와 흡광도 측정값(405nm)의 라미나린 표준 기준을 기반으로 하며, 코름 샘플의 흡광도 측정값에서 칼로스 농도(라미나린 등가물, LE로 간주)를 계산하는 데 사용됩니다. 이 도형은49번 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: 칼로스 농도 비교. Xvm을 접종한 M. balbisiana와 Mbwazirume 바나나 식물의 구근 구대(독립 샘플 t-검정, α ≤ 0.05)에 따른 평균 칼로스 농도(평균 ± SEM, n = 9) 비교 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

버퍼구성저장
블로킹 버퍼10g의 소 혈청 알부민(BSA; 1% w/v)을 PBS 1L에 용해.-20 °C에서 최대 6개월간
코팅 버퍼탄산나트륨 1.59 g(Na2CO3), 중탄산나트륨 2.93 g(NaHCO3), 아지드 나트륨 0.2 g(NaN3)을 탈이온화된 H2O 1L에 용해, pH 9.6.-20 °C에서 최대 12개월간
공액 버퍼PVP 2g(2% w/v)을 블로킹 버퍼 1L에 녹였습니다.-20 °C에서 최대 6개월간
파라-니트로페닐 인산염(pNPP) 용액기질 완충제에 파라-니트로페닐 인산염(pNPP)을 1 mg/mL의 작동 농도로 용해합니다-20 °C에서 최대 12개월간
인산염 완충 식염수(PBS)염화나트륨 8.0g(NaCl), 단염성 인산칼륨 0.2g(KH2PO4), 이염성 인산나트륨 1.15g(Na2HPO4), 염화칼륨 0.2g(KCl), 아지드나트륨 0.2g(NaN3), 탈이온화 H2O 1L에 용해, pH 7.4.-20 °C에서 최대 12개월간
차단 완충제 내 1차 항체제조사의 지시에 따라 동염 1차 항체를 재구성하여 농축된 토목을 얻습니다. 획득한 재구성된 1차 항체 재고를 차단 버퍼 내 희석하여 작동 농도인 2 μg/mL로 만듭니다.-20 °C에서 최대 6개월간
코팅 버퍼 내 1차 항체제조사의 지시에 따라 동염 1차 항체를 재구성하여 농축된 토목을 얻습니다. 재구성된 1차 항체 토지를 코팅 버퍼 내 희석하여 작동 농도인 2 μg/mL로 만듭니다.-20 °C에서 최대 6개월간
2차 항체1:1000 2차 항체 농축액: 결합 완충제-20 °C에서 최대 6개월간
기판 버퍼디탄놀라민 97mL, 아지드 나트륨 0.2g(NaN3)을 탈이온화된 수로 1L, pH 9.8에 녹인다-20 °C에서 최대 12개월간
워시 버퍼Tween 20 0.5mL(0.05% v/v), PBS 1L에 용해, pH 7.5-20 °C에서 최대 12개월간

표 1: 버퍼 레시피.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

면역형광 분광광도법이 바나나 구근의 칼로스 정량에 처음으로 적용되었습니다. 이 방법은 1M NaOH 추출물의 칼로스 성분을 칼로스 특이적 항체 47,51,52를 이용해 정량하는 데 사용되는 효소 면역분석법(EIA)을 기반으로 합니다. 간단히 말해, 이 새로운 면역형광 분광광도 기반 굳마 특이적 정량 분석 방법은 마이크로플레이트에 굳꼭질 특이적 항체를 코팅하여 식물 추출물의 칼로스에 결합시키고, 이어서 굳을로스에 특이적인 2차 항체를 적용하는 방식이었습니다. 효소와 연결된 항체(알칼리성 인산효소)를 검출하여 2차 항체와 복합체를 형성합니다. 그 후 기질인 파라-니트로페닐 인산염(pNPP)이 첨가됩니다. 샘플 내 칼로스의 정량화는 알칼리성 인산효소가 pNPP 분자에서 인산기를 절단하여 노란색 화합물(p-니트로페놀)을 형성하는 능력에 의존합니다. 노란색의 강도는 405nm 분광광도계를 사용해 검출되었고, 흡광도는 샘플 내 칼로스 농도와 정비례하는 알칼리성 인산효소 활성과 상관관계를 보였습니다. 반응은 0.5M NaOH를 첨가하여 pH를 높여 알칼리성 인산효소 활성을 억제함으로써 중단되었다.

반면, 칼로스 위치 및 정량의 표준 방법은 에피플루오레센스 현미경법으로, 칼로스를 아닐린 블루 플루오로크롬53으로 염색하는 잘 확립된 방법입니다. 간단히 말해, 이 방법은 아닐린 블루 염료가 베타-1,3-글루칸(굳은살)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 데 기반합니다. 이 복합물의 아닐린 블루는 자외선(파장 365-375 nm)을 이용해 여기됩니다. 아닐린 블루 염료가 여기되면 푸른 형광을 방출하여 식물 조직 내 칼로스를 특이적으로 시각화할 수 있게 됩니다53. 아닐린 블루 염색 칼로스의 정량화는 식물 조직에서 나오는 형광의 양을 정량화하는 일련의 영상 기법을 따릅니다. 형광은 식물 조직 내 칼로스(칼로스)의 양에 비례합니다. 후형광 현미경은 생물학적 스트레스 하에서 칼로스의 시각화 및 정량화에 사용되었습니다54.

별도의 연구에서는 후진형광현미경과 면역형광분광광도법49를 사용하여 칼로스 침착을 확인하였습니다. 데이터에서 몇 가지 차이가 관찰되었으나, 통계 분석은 후진형광 현미경과 면역형광 분광광도법 데이터가 대체로 일치함을 보여주어 칼로스 검출 두 방법 모두의 일관성을 나타냈다49. 두 방법의 결과는 대체로 일치했으나, 보다 신뢰할 수 있는 평가를 위해 에피플루오레스펜스 현미경과 면역형광 분광도법이 상호 보완하는 것이 바람직합니다. ELISA 기반 방법은 굳결 특이적이고 민감하며 신뢰할 수 있지만, 프로토콜 최적화와 모든 농도와 흡광도에 맞는 최적 적합 표준 곡선을 찾는 데 초기에는 시간이 많이 소요됩니다.

칼로스 정량화 방법 중 일부는 번거로운 17,32,55, 시간이 많이 걸리는 26,56, 굳은살 특이적이지 않으며, 아닐린 블루는 칼로스30 외에도 다른 β-1,3-글루칸을 염색시킬 수 있어 고비용과 정교한 칼로스 계수 소프트웨어가 필요합니다 23,24,26, 상당한 기술적 역량이 필요하며, 형광 분광광도법과 관련된 높은 배경/자가형광 때문에 칼로스 정량화가 어렵고 신뢰할 수 없다26. ImageJ 소프트웨어와 같은 자동화된 이미지 분석 워크플로우를 기반으로 한 Callose 정량화 방법은 ImageJ용 Trainable Weka Segmentation(TWS)과 같은 이미지 분석 플러그인의 적절한 훈련이 필요하며, 이는매우 번거롭습니다.

면역형광 분광광도 기반 검사법은 특이성, 민감성, 사용 용의성 및 재현성 때문에 매우 선호됩니다. 하지만 검출 시스템과 그 감도는 특정 분석 프로토콜과 사용되는 장비에 따라 다를 수 있다는 점을 유의해야 합니다.

여기서는 면역형광 분광광도법을 기반으로 한 칼로스 정량의 새로운 방법을 설명한다. 여기서 설명한 방법은 다양한 식물 조직과 종에서 칼로스의 정량화에 적용할 수 있으며, 올로스에 만족스러운 특이성, 높은 정밀도, 재현성을 갖추게 됩니다. 이 방법은 다양한 칼로스 정량화 방법에 추가된 것으로, 식물의 성장 및 발달 과정에서 칼로스 수치 변화를 모니터링하고 다양한 자극이나 치료에 반응하는 데 사용할 수 있습니다. 더불어 96웰 플레이트 사용은 주관적인 샘플링 및 분석을 줄여 고처리량 칼로스 정량화에 적합하게 만듭니다. 칼로스는 갓 수확된식물 조직에서 쉽게 추출할 수 있지만, 이 새로운 프로토콜에 따라 동결 건조가 포함된 샘플 준비 단계가 샘플을 최대 1년까지 보관할 수 있는 이점을 제공하며, 상온에서 부패하기 쉬운 생물학적 샘플을 먼 실험실 간에 저장 및 운송할 수 있게 합니다. 이로 인해 새로운 샘플 채취를 위해 전체 실험을 반복적으로 설정하지 않고도 칼로스 추출을 반복할 수 있습니다.

고처리량 칼로스 정량 실험에는 면역형광 분광광법이 권장되며, 후형광 현미경과 면역형광 현미경은 칼로스 정량 및 식물 조직 내 칼로스의 조직 국소화에 모두 사용할 수 있습니다. 식물 조직 내 칼로스의 시공간적 정확하고 효율적이며 신뢰할 수 있는 분포를 보장하기 위해, 현미경, 분광광도계, 효소 활성 기반 방법 등 다양한 칼로스 정량 방법을 동시에 사용하는 것이 권장됩니다. 따라서 이를 통해 칼로스가 다양한 생리적·스트레스 반응에서 어떤 역할을 하는지 정확하고 효율적으로 이해할 수 있게 됩니다. 향후 연구에서는 에피형광 현미경, 면역형광 현미경, 형광 분광광도법, 면역형광 분광광도법, 효소 활성 기반 방법 등 칼로스 정량 측정을 포괄적이고 동시에 평가할 수 있습니다.

공개 사항

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저자들은 이해 충돌이 없음을 선언한다.

감사의 글

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이 연구는 빌 & 멜린다 게이츠 재단의 지원을 받았으며, 연구비 번호는 INV 009894/OPP1134098. 연구의 설계에는 자금 지원자들이 관여하지 않았으며; 데이터 수집, 분석 또는 해석에 관해; 원고 작성 과정에서; 또는 결과를 발표할지 결정하는 데 있어서도 말이다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알루미늄 호일  킴-페이 EA 리미티드, 나이로비, 케냐
분석적 균형  메틀러-톨레도 AG, 스위스 그라이펜제ML204/01
비드비터 96BioSpec Products Inc., 오클라호마주 바틀스빌, 미국1001유로
블롯 페이퍼 & nbsp;킴-페이 EA 리미티드, 나이로비, 케냐
소 혈청 알부민(BSA) 서모피셔 사이언티픽, 매사추세츠, 미국B14
원심분리기, 5425R에펜도르프, 함부르크, 독일5406000240
복합 냉장고-냉동고 (4 & deg; C 및 마이너스; 20 & deg; C) 하이얼 메디컬 및 실험실 유한회사, 중국 칭다HYCD-282
디탄놀라민 PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLU191287
디지털 셰이커, 믹스메이트에펜도르프, 함부르크, 독일5353000529
인산이나트륨 (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLU141679
ELISA 플레이트, 96웰, 평평한 바닥, 투명, 폴리스티렌, 고바인딩사르스테트 AG & KG 중대, Nü 음브레히트, 독일82.1581.200
iMark 마이크로플레이트 리더용 필터, iMark 680, 405nm라섹 인터내셔널 Pty. Ltd., 케이프타운, 남아프리카BRD1681011
동결건조기, 버티스와 대시; 벤치탑 " K” 시리즈; 모델: 4KBTXLLabWrench, 캐나다, 미국448053
염산(HCl)과 nbsp;PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLU141020
등온선 강제 대류 인큐베이터, IFA-54-8에스코 라이프사이언스 그룹, 싱가포르2100002
라미나린 알파 아에사르, 매사추세츠, 미국J66193
마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL & nbsp;에펜도르프, 함부르크, 독일022363204
마이크로 원심분리기 튜브 2 mL & nbsp;제네시 사이언티픽 코퍼레이션, 캘리포니아, 미국24번과 대시; 283
마이크로피펫 (30– 300 & mu; L), 12채널, 2100 시리즈 에펜도르프, 함부르크, 독일EP-12-300R
마이크로피펫 팁 epT.I.P.S.  싱글에펜도르프, 함부르크, 독일022363204
마이크로피펫 (0.5– 1000 & mu; L), 연구  플러스에펜도르프, 함부르크, 독일3123000900
마이크로플레이트 흡수도 리더기, iMark바이오-래드 연구소, Inc., 캘리포니아, 미국1681135EDU
마이크로플레이트 매니저 6 버전 6 소프트웨어  바이오-래드 연구소, Inc., 캘리포니아, 미국1689520
파라필름폴 마리엔펠트 GmbH & KG 중대, 라우다-크&움름; 니그스호펜, 독일740751
파라-니트로페닐 인산염 (pNPP)독일 다름슈타트 메르크 KGaA20-106
pH 측정기, HI9126한나 인스트루먼트, 우네스킷, 로드아일랜드, 미국02310048991
폴리비닐피롤리돈(PVP) PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLUA2260
염화칼륨(KCl)PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLUA2939
인산칼륨 (KH2PO4) PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLU141509
정밀 수욕, GP10서모 피셔 사이언티픽 주식회사, 코네티컷주 뉴인턴, 미국TSGP10
1차 항체(1-3-&β;-글루칸 지향 마우스 IgG) 바이오 서플라이즈 오스트레일리아 Pty Ltd., 멜버른, 호주400-2
시약 저장소  서모피셔 사이언티픽 주식회사, 미국 매사추세츠15075
알칼리성 인산효소(항생쥐 IgG-알칼리 인산효소)와 결합된 2차 항체;시그마 라이프 사이언스, 뉴저지, 미국A5153
나트륨 아지드(NaN3)와 nbsp;PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLUA1430
탄산나트륨(Na2CO3) PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLU141648
염화나트륨(NaCl)과 nbsp;PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLUA2942
탄산수소나트륨(NaHCO3)과 nbsp;PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLU141638
수산화나트륨 (NaOH)PanReac AppliChem ITW 시약, Quí 스페인 바르셀로나의 마이카 SLU141687.1210
트윈-20바이오매틱 코퍼레이션, 온타리오, 캐나다A4031
초순수 증류수서모피셔 사이언티픽, 매사추세츠, 미국10-977-015

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