방법 논문

쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색

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DOI:

10.3791/65836

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2023년 11월 21일

 ,  ,  ,  , 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig-Maximilians-University Munich (LMU), 2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex), LMU Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), 4Interfaculty Center for Endocrine and Cardiovascular Disease Network Modelling and Clinical Transfer (ICONLMU), LMU Munich

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 쥐 폐 정맥의 현미경 유도 분리 및 면역형광 염색을 보여줍니다. 좌심방, 폐정맥 및 해당 폐가 포함된 조직 샘플을 준비하고 심장 Troponin T 및 Connexin 43에 대해 염색합니다.

초록

폐정맥(PV)은 심방 부정맥에서 이소성 박동의 주요 원인이며 심방세동(AF)의 발생과 진행에 중요한 역할을 합니다. PV에는 심근세포로 구성된 심근 슬리브(MS)가 포함되어 있습니다. 다발성경화증은 이소성 전기 충격을 생성하는 능력을 포함하여 심장 작동 심근과의 유사성을 보존하기 때문에 심방세동의 시작 및 유지와 관련이 있습니다. 설치류는 널리 사용되며 심근세포가 혈관 벽 전체에 널리 존재하기 때문에 폐 정맥 심근을 연구하는 데 우수한 동물 모델을 나타낼 수 있습니다. 그러나 쥐 PV의 정확한 미세해부 및 준비는 작은 장기 크기와 복잡한 해부학적 구조로 인해 어렵습니다.

PV와 함께 쥐 좌심방(LA)을 분리하기 위한 현미경 유도 현세해부 프로토콜을 시연합니다. 심장 Troponin-T(cTNT) 및 connexin 43(Cx43) 항체를 사용한 면역형광 염색을 수행하여 LA 및 PV를 전체 길이로 시각화합니다. 10x 및 40x 배율의 이미징은 PV 구조에 대한 포괄적인 보기와 심근 구조에 대한 자세한 통찰력을 제공하며, 특히 MS 내에서 connexin 43의 존재를 강조합니다.

서론

심방세동(AF)은 가장 흔한 지속 부정맥이다1. 심방세동 유병률은 더욱 증가하여 2060년에는 유럽에서 ~1,790만 명의 환자가 발생할 것으로 예상됩니다1. 심방세동은 심근경색, 심부전 또는 뇌졸중의 발병에 필수적인 위험 요소이기 때문에 임상적으로 매우 중요하며, 이는 엄청난 개인적, 사회적, 사회경제적 부담을 초래한다1. 심방세동은 수십 년 동안 알려져 왔지만, 심방세동의 병태생리학은 아직 완전히 이해되지 않았다2.

이미 1990년대 후반에 여러 연구에서 폐정맥(PV)이 심방세동을 유발하는 이소성 박동(ectopic beats)의 주요 원인이기 때문에 심방세동을 시작하고 유지하는 데 큰 영향을 미친다는 사실이 입증되었습니다3. PV는 구조적으로 다른 혈관과 다르다는 것이 입증되었습니다. 일반적인 혈관에는 평활근 세포가 포함되어 있지만, PV의 튜니카 배지에는 심근세포도 포함되어 있다4. 설치류에서, 이 심장 근육계는 폐내 및 폐외 부분뿐만 아니라 오리피스 영역

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프로토콜

동물 관리 및 모든 실험 절차는 뮌헨 루트비히-막시밀리안-대학의 동물 관리 및 윤리 위원회의 지침에 따라 수행되었으며, 마우스를 사용한 모든 절차는 Regierung von Oberbayern(ROB 55.2-2532)의 승인을 받았습니다. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532 참조. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). C57BL6/N 마우스를 상업적으로 획득하였다.

1. 준비

  1. 3 mg의 아가로스와 100 mL의 1x 트리스 완충 식염수를 500 mL 삼각 플라스크에 혼합하여 500 % 아가로스 겔을 준비합니다. 용액을 600W의 전자레인지에서 겔이 균질해질 때까지 2-3분 동안 가열합니다.
  2. 직경 100mm의 페트리 접시에 젤을 부드럽게 부어 해부 접시를 준비합니다. 페트리 접시 반을 젤로 채웁니다. 균일한 일관성을 보장하기 위해 젤에서 거품을 제거합니다. 젤이 굳을 때까지 해부 접시를 식히십시오.
  3. 표 1에 제공된 레시피에 따라 고정 용액, 투과화 용액, 차단 완충액 ....

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결과

우리는 12-16주 된 쥐 10마리에서 PV의 미세 해부, 염색 및 이미징을 수행했습니다. 프로토콜에 따라 모든 실험용 마우스에서 LA와 함께 PV를 성공적으로 미세 해부하고 8개 마우스에서 PV를 포괄적으로 볼 수 있는 섹션을 얻었습니다. 개요 이미지는 LA-PV 접합부의 PV 오리피스(PVO) 영역, 폐 외 PV(PVex)(폐 힐럼과 LA-PV 접합부 사이의 PV) 및 폐 내 PV(PVin)(폐 조직으로 둘러싸인 PV)를 식별하기 위해 10배 배율로 촬영되었습니다(그림 2). 언급된 영역의 확대 이미지는 40x 배율 대물렌즈에서 획득되었습니다(그림 3).

PVO, PVex 및 PVin 에서 전형적인 근육 줄무늬가 있는 특정 cTNT 신호를 발견했습니다(그림.......

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토론

이 프로토콜을 통해 쥐 심장의 PV를 구별 및 분리하고 면역형광 염색을 수행하는 방법을 공유합니다. 장기 적출 후, 심장과 폐를 멸균된 자당 용액에서 탈수한 후, 현미경 유도 하에 심방과 폐엽에서 심실을 분리하였다. 그 후, 심장 베이스는 PV를 시각화하기 위해 준비되었으며, 그 후 hilum에서 폐에서 PV를 절단했습니다. 후속 면역형광 염색은 조직을 O.C.T. 화합물에 매립하고, 빙정체로 절단하고, cTNT 및 Cx43에 대한 면역형광 염색을 수행함으로써 냉동 기법을 사용하여 수행되었습니다.

PV를 분리하는 것은 심방세동 부정맥 발생에서 PV의 역할을 연구하는 데 유용할 수 있습니다. 그러나 마우스의 PV 분리는 까다롭습니다. PV는 크기가 작을 뿐만 아니라 주요 기관지와 심장 기저부의 눈에 띄는 혈관 뒤에 숨겨져 있어 검출이 매우 복잡합니다. 이 프로토콜은 쥐 PV를 조사할 수 있는 간단하고 투명한 방법을 제공하며 형태학적 특성을 자세히 연구할 수 있는 경제적 접근 방식을.......

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 독일 심혈관 연구 센터(DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), 중국 장학위원회(CSC201808130158 to R.X.), 독일 연구 재단(DFG; 혈관 의학 임상 과학자 프로그램(PRIME), MA 2186/14-1 to P. T.), Corona Foundation(S199/10079/2019 to SC).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
접착 슬라이드Epredia10149870
AF568-2차 항체InvitrogenA11036숙주: 염소, 반응성: 토끼
AgaroseBiozym LE840104
Alexa Fluor 488-2차 항체세포 신호 전달 기술4408S숙주: 염소, 반응성: 마우스
Anti-Connexin 43 /GJA1 항체Abcamab11370다클론 항체, 클론: GJA1, 숙주: 토끼 
항-cTNT 항체InvitrogenMA5-12960단클론 항체, 클론: 13-11, 호스트: 마우스
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA2153
브러시Lukas 5486사이즈 6
커버 슬립Epredia24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70Epredia 설정: 표본 온도: -18 > C, 블레이드 온도 : -25 > C
DFC365FX 카메라Leica 
DM6 B 형광 현미경Leica 
드라이아이스
Dubecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 1x conc.Gibco14040133500 mL
Dumont #5FS 집게F.S.T.91150-202 개 필요
파인 가위F.S.T.14090-09
형광 장착 매체DAKOS3023
Graefe 집게F.S.T.11052-10
Hoechst 33342InvitrogenH3570세포핵 대조염색
ImageJFIJI분석 및 처리 소프트웨어
LAS XLeica Leica DM6 B
Microtome blades S35Feather207500000
Microwave
Normal goat serumSigma-AldrichS26-M
O.C.T. compoundTissue-Tek4583
Paraformaldehyde 16%Pierce28908methanol-free
파스퇴르 피펫용VWR612-1681
페트리 접시TPP93100100 mm 직경
로커 3D 디지털IKA Sch ü ttler00040010000
슬라이드 염색 용기EasyDipM900-12
시편 금형Tissue-Tek Cryomold455725 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 염색 시스템StainTray631-192320 슬라이드용 염색 시스템
Sterican NeedleBraun4657705G 27 - Student Vannas Spring Scissors F.S.T 프로토콜에서 주입(<강한>단계 2) 및 고정(<강한>단계 3 및 4)에 사용됩니다
.91500-09
슈퍼 PAP 펜 리퀴드 블로커슈퍼 PAP 펜N71310-N
주사기브라운4606108V10 mL
트리스 베이스로슈트리스-RO구성 요소 1x 트리스 버퍼 식염수(TBS)
트리톤 X-100시그마-알드리치T8787
트윈 20시그마-알드리치P2287
이미징 소프트웨어

참고문헌

  1. Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
  2. Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Hea....

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