이 논문에서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 공막의 과발현과 2D 바이오리액터를 통한 단축 스트레칭이 결합된 iPSC 유래 중간엽 기질 세포를 생성하여 iTenocyte를 생성하는 절차에 대해 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Generation of induced pluripotent stem cell-derived iTenocytes via combined scleraxis overexpression and 2D Uniaxial tension(공막 과발현 및 2D 단축 장력 결합을 통한 유도만능줄기세포 유래 iTenocytes 생성)
이 논문에서
요약
초록
힘줄과 인대 복구에 대한 오늘날의 과제는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 세포 기반 치료에 적합하고 효과적인 후보를 식별해야 합니다. 중간엽 기질 세포(MSC)는 힘줄 복구를 위한 잠재적인 조직 공학 전략으로 연구되어 왔습니다. 그들은 다능하고 생체 내에서 재생 잠재력을 가지고 있지만 자체 재생 능력이 제한되어 있으며 표현형 이질성을 나타냅니다. 유도만능줄기세포(iPSC)는 높은 자가 재생 능력과 탁월한 발달 가소성으로 인해 이러한 한계를 우회할 수 있습니다. 건세포 발달에서 공막(Scx)은 힘줄 분화의 중요한 직접 분자 조절자입니다. 또한 기계 조절은 배아 힘줄의 발달과 치유를 이끄는 핵심 요소인 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 힘줄 생성에 필수적일 수 있는 생물학적 및 기계적 자극의 시너지 효과를 캡슐화하는 프로토콜을 개발했습니다. iPSC는 중간엽 기질 세포(iMSC)가 되도록 유도되었으며 유세포 분석을 통해 고전적인 중간엽 기질 세포 마커로 특성화되었습니다. 다음으로, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 iMSC를 안정적으로 과발현하도록 형질주입했습니다(iMSCSCX+). 이러한 iMSCSCX+ 세포는 2D 바이오리액터를 사용하여 단축 인장 하중을 통해 iTenocyte로 더 성숙할 수 있습니다. 결과 세포는 초기 및 후기 힘줄 마커의 상향 조절과 콜라겐 침착을 관찰하는 것이 특징이었습니다. 이 iTenocytes 생성 방법은 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 잠재적으로 무제한의 기성품 동종 세포 소스를 개발하는 연구원을 지원하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
힘줄과 인대 복구의 현대 문제를 해결하기 위해서는 세포 기반 치료에 적합한 적절한 세포 후보가 필요합니다. 힘줄 복구를 위한 조직 공학의 한 가지 연구 방법은 골수 유래 중간엽 기질 세포(BM-MSC) 및 지방 조직 유래 기질 세포(ASC)를 잠재적 전략으로 탐색하는 것입니다. 이 세포는 다능 능력, 매우 풍부하며 생체 내에서 재생 잠재력을 가지고 있습니다. 또한 동물 모델에서 향상된 치유 능력과 향상된 기능적 결과를 보여주었습니다1. 그럼에도 불구하고 이러한 세포는 제한된 자가 재생 능력, 표현형 다양성, 특히 힘줄 형성 능력이 제한되어 있습니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 기술은 뛰어난 자가 재생 능력과 타의 추종을 불허하는 발달 적응성으로 인해 이러한 제약에 대한 솔루션을 제공합니다. 우리 연구팀과 다른 연구팀은 iPSC를 중간엽 기질 세포 유사 개체(iMSC)로 성공적으로 분화시켰습니다2,3. 따라서 iMSC는 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 동종 공급원이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
공막(SCX)은 힘줄 발달에 필수적인 전사 인자이며 분화된 건세포에 대해 가장....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
iTenocyte를 생산하기 위한 이 프로토콜은 iPSC에서 iMSCs(10일), iMSC에서 iMSCSCX+ (2주), iMSCSCX+ 에서 iTenocytes(최소 4일)의 세 가지 주요 단계로 수행할 수 있습니다. 프로토콜의 각 주요 단계는 실험 일정에 따라 일시 중지했다가 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 세포 배양과 관련된 방법의 경우 멸균 기술을 사용해야 합니다. 이 프로토콜의 모든 세포는 37°C, 5% CO2 및 95% 습도에서 성장해야 합니다.
1. 유도 중간엽 기질 세포(iMSC)로의 인간 iPSC 유도
- 실험 준비
- Iscove의 Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies(IMDM-EB) 배지를 준비합니다.
- 8.5mL의 녹아웃 혈청 치환, 500μL의 MEM(Minimal Essential Medium) 비필수 아미노산, 0.385μL(110mM 스톡) 베타-메르캅토에탄올 및 500μL 항생제-항진균제(AAS)로 IMDM 기저 배지 50mL를 보충합니다(최종 농도: 각각 17%, 1%, 110μM, 1%)( 재료 표 참조).
- Iscove의 Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies(IMDM-EB) 배지를 준비합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
인간 iPSC와 iMSC의 분화
앞서 설명한 바와 같이, iPSC를 iMSC로 분화하기 위한 현재의 프로토콜은 배아체(embryoid body)의 형성을 포함한다(2). 이 과정은 iPSC에서 iMSC를 유도하는 데 약 10일이 걸립니다(그림 1A). 그러나 새로 생성된 iMSC를 최소 두 번 통과하는 것이 좋습니다. 이는 젤라틴 코팅 플레이트의 필요성을 없애는 데 도움이 될 뿐만 아니라 안정적인 MSC 발현을 확립하는 데 도움이 됩니다. 분화 후 6번의 통과 후에 수행된 유세포 분석 정량화는 CD44(83.1%), CD90(88.4%) 및 CD105(99.2%)를 포함한 고전적인 MSC 표면 마커의 높은 발현으로 거의 순수한 세포 집단을 보여줍니다17,18(
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜에서 iTenocyte는 (1) iMSC에 대한 iPSC의 유도, (2) 렌티바이러스 벡터를 사용한 SCX의 과발현, (3) 2D 단축 장력을 통한 세포 성숙의 세 가지 주요 단계를 통해 생성됩니다.
iPSC를 iMSC로 구별하기 위해 제시된 프로토콜은 이전에 그룹2에서 설명했습니다. 이 발표 이후, 임상시험에서 iMSC를 사용하기 위한 확립된 프로토콜(21,22,23)과 상업적으로 이용 가능한 분화 키트를 포함하여 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. iMSC의 삼계보 잠재력에 대한 검토도 이전에 조사된 바 있다2. 방법론은 다르지만, 모든 프로토콜은 MSC 표면 마커의 안정적인 발현을 보장하기 위해 여러 통로에 대한 i.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
모든 저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH/NIAMS K01AR071512 및 CIRM DISC0-14350에서 Dmitriy Sheyn에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 두 개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 Simon Knott 실험실(Cedars-Sinai Medical Center, Department of Biomedical Sciences)에서 기증한 것입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-메르캅토에탄올 | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | 세포 해리 시약 |
| 항생제-항진균 용액 | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC 마우스 anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC 마우스 IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark 소 태아 혈청 | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| 소 혈청 알부민 | Millipore Sigma | A3733 | |
| 콜라겐 유형 I 알파 1 체인 인간 Taqman 프라이머 | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| 콜라겐 유형 III 알파 1 체인 인간 Taqman 프라이머 | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, 저포도당, 피루베이트, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음 | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle의 최소 필수 매체 (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectin 소 혈장 | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC 마우스 안티 휴먼 CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| 젤라 | 시그마 알드리치 | G1890 | |
| 염소 안티 마우스 IgG1-PE | 바이오 라드 | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, 페놀 레드 | 써모피셔 | 21056023 | |
| iPSC: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC 핵심 시설 | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Isotype Control 항체, 마우스 IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut 혈청 교체 | Thermofisher | 10828010 | |
| L-아스코르브산 | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-글루타민 | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | 기저막 매트릭스 |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | 스트레칭 장치 |
| MEM 비필수 아미노산 용액 | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk human Taqman 프라이머 | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A 인간 Taqman 프라이머 | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene 감염/형질 주입 시약 | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| 재조합 인간 TGF-beta 1 단백질 인간 Taqman 프라이머 | RnD 시스템 | 240-B | |
| Scleraxis 인간 Taqman 프라이머 | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) 인간 태그 ORF 클론 | OriGene | RC224305L4 | |
| 실리콘 플레이트 | CellScale | N/A | |
| 아지드 나트륨 | Millipore 시그마 | S2002 | |
| Tenascin C human Taqman 프라이머 | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin human Taqman 프라이머 | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Thrombospondin 4 human Taqman 프라이머 | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Transfection 시약, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| 단백질족 구성원 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
참고문헌
- Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
- Sheyn, D., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
