방법 논문

Generation of induced pluripotent stem cell-derived iTenocytes via combined scleraxis overexpression and 2D Uniaxial tension(공막 과발현 및 2D 단축 장력 결합을 통한 유도만능줄기세포 유래 iTenocytes 생성)

DOI:

10.3791/65837

⸱

2024년 3월 1일

 ,  , 
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문에서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 공막의 과발현과 2D 바이오리액터를 통한 단축 스트레칭이 결합된 iPSC 유래 중간엽 기질 세포를 생성하여 iTenocyte를 생성하는 절차에 대해 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

힘줄과 인대 복구에 대한 오늘날의 과제는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 세포 기반 치료에 적합하고 효과적인 후보를 식별해야 합니다. 중간엽 기질 세포(MSC)는 힘줄 복구를 위한 잠재적인 조직 공학 전략으로 연구되어 왔습니다. 그들은 다능하고 생체 내에서 재생 잠재력을 가지고 있지만 자체 재생 능력이 제한되어 있으며 표현형 이질성을 나타냅니다. 유도만능줄기세포(iPSC)는 높은 자가 재생 능력과 탁월한 발달 가소성으로 인해 이러한 한계를 우회할 수 있습니다. 건세포 발달에서 공막(Scx)은 힘줄 분화의 중요한 직접 분자 조절자입니다. 또한 기계 조절은 배아 힘줄의 발달과 치유를 이끄는 핵심 요소인 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 힘줄 생성에 필수적일 수 있는 생물학적 및 기계적 자극의 시너지 효과를 캡슐화하는 프로토콜을 개발했습니다. iPSC는 중간엽 기질 세포(iMSC)가 되도록 유도되었으며 유세포 분석을 통해 고전적인 중간엽 기질 세포 마커로 특성화되었습니다. 다음으로, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 iMSC를 안정적으로 과발현하도록 형질주입했습니다(iMSCSCX+). 이러한 iMSCSCX+ 세포는 2D 바이오리액터를 사용하여 단축 인장 하중을 통해 iTenocyte로 더 성숙할 수 있습니다. 결과 세포는 초기 및 후기 힘줄 마커의 상향 조절과 콜라겐 침착을 관찰하는 것이 특징이었습니다. 이 iTenocytes 생성 방법은 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 잠재적으로 무제한의 기성품 동종 세포 소스를 개발하는 연구원을 지원하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

힘줄과 인대 복구의 현대 문제를 해결하기 위해서는 세포 기반 치료에 적합한 적절한 세포 후보가 필요합니다. 힘줄 복구를 위한 조직 공학의 한 가지 연구 방법은 골수 유래 중간엽 기질 세포(BM-MSC) 및 지방 조직 유래 기질 세포(ASC)를 잠재적 전략으로 탐색하는 것입니다. 이 세포는 다능 능력, 매우 풍부하며 생체 내에서 재생 잠재력을 가지고 있습니다. 또한 동물 모델에서 향상된 치유 능력과 향상된 기능적 결과를 보여주었습니다1. 그럼에도 불구하고 이러한 세포는 제한된 자가 재생 능력, 표현형 다양성, 특히 힘줄 형성 능력이 제한되어 있습니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 기술은 뛰어난 자가 재생 능력과 타의 추종을 불허하는 발달 적응성으로 인해 이러한 제약에 대한 솔루션을 제공합니다. 우리 연구팀과 다른 연구팀은 iPSC를 중간엽 기질 세포 유사 개체(iMSC)로 성공적으로 분화시켰습니다2,3. 따라서 iMSC는 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 동종 공급원이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

공막(SCX)은 힘줄 발달에 필수적인 전사 인자이며 분화된 건세포에 대해 가장 먼저 검출할 수 있는 마커로 간주됩니다. 또한 SCX는 유형 1a1 사슬 콜라겐 1(COL1a1), 모호크(MKX) 및 테노모듈린(TNMD)을 포함한 다운스트림 힘줄 분화 마커를 활성화합니다 4,5,6. 힘줄 성숙 중에 발현되는 다른 유전자로는 튜불린 중합 촉진 단백질 패밀리 멤버 3(TPPP3) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRa)7가 있습니다. 이러한 유전자는 힘줄의 발달과 성숙에 필수적이지만, 불행히도 힘줄 조직에만 국한된 것은 아니며 뼈나 연골과 같은 다른 근골격계 조직에서 발현됩니다 5,7.

힘줄 발달 중 마커의 발현 외에도 기계 자극은 배아 힘줄 발달 및 치유에 필수적인 요소입니다 4,5,6. 힘줄은 기계적으로 반응하며 성장 패턴은 환경에 따라 변화합니다. 분자 수준에서, 생체역학적 단서는 건세포의 발달, 성숙, 유지 및 치유 반응에 영향을 미친다8. 다양한 바이오리액터 시스템이 생리학적 부하와 생체역학적 단서를 모델링하는 데 활용되었습니다. 이러한 모델 시스템 중 일부에는 생체 외 조직 로딩, 이축 또는 단축 장력을 적용하는 2D 세포 로딩 시스템, 스캐폴드 및 하이드로겔을 사용하는 3D 시스템이 포함됩니다 9,10. 2D 시스템은 힘줄 특이적 유전자 또는 세포 운명의 맥락에서 세포의 형태에 대한 기계적 자극의 효과를 연구할 때 유리한 반면, 3D 시스템은 세포-ECM 상호 작용을 보다 정확하게 복제할 수 있습니다 9,10.

2D 로딩 시스템에서는 세포와 배양 기질 사이의 변형률이 균일하며, 이는 세포의 세포골격에 가해지는 하중을 완전히 제어할 수 있음을 의미합니다. 이축 로딩(bi-axial loading)과 비교하여, 일축 로딩(uniaxial loading)은 생리학적으로 더 관련성이 높은데, 이는 텐노사이트(tenocyte)가 생체 내 콜라겐 다발(collagen bundle)로부터 일축 로딩(uniaxial loading)을 주로 받기 때문이다 9. 일상 활동 중에 힘줄은 최대 6%의 변형률(11)까지 단축 인장 하중을 받는 것으로 나타났다. 특히, 이전 연구에서는 4%-5%의 생리학적 범위 내에서 로딩이 SCX 및 TNMD와 같은 힘줄 관련 마커 발현을 보존하고 콜라겐 생산을 증가시켜 테노겐 분화를 촉진하는 것으로 나타났습니다 9,10. 10% 이상의 균주는 외상적으로는 관련이 있지만 생리적으로는 관련이 없을 수 있다12,13.

여기에서는 건세포 생성에 필수적일 수 있는 기계적 및 생물학적 자극의 시너지 효과를 고려한 프로토콜이 제시됩니다. 먼저 유세포 분석을 사용하여 MSC 표면 마커로 확인된 배아체를 성장 인자에 단기간 노출 시켜 iPSC를 iMSC로 유도하는 재현 가능한 방법을 설명합니다. 그런 다음 SCX(iMSCSCX+)의 안정적인 과발현을 갖도록 iMSC를 엔지니어링하는 렌티바이러스 형질도입 방법을 자세히 설명합니다. 추가 세포 성숙을 위해 iMSCSCX+ 는 피브로넥틴 코팅 실리콘 플레이트에 파종되고 CellScale MCFX 바이오리액터를 사용하여 최적화된 단축 장력 프로토콜을 거칩니다. tenogenic 잠재력은 이른 힘줄 마커와 늦은 힘줄 마커의 상향 조절과 콜라겐 침착을 관찰함으로써 확인되었다14. 이 iTenocytes 생성 방법은 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 무제한 기성품 동종 소스를 제공할 수 있는 개념 증명입니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iTenocyte를 생산하기 위한 이 프로토콜은 iPSC에서 iMSCs(10일), iMSC에서 iMSCSCX+ (2주), iMSCSCX+ 에서 iTenocytes(최소 4일)의 세 가지 주요 단계로 수행할 수 있습니다. 프로토콜의 각 주요 단계는 실험 일정에 따라 일시 중지했다가 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 세포 배양과 관련된 방법의 경우 멸균 기술을 사용해야 합니다. 이 프로토콜의 모든 세포는 37°C, 5% CO2 및 95% 습도에서 성장해야 합니다.

1. 유도 중간엽 기질 세포(iMSC)로의 인간 iPSC 유도

  1. 실험 준비
    1. Iscove의 Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies(IMDM-EB) 배지를 준비합니다.
      1. 8.5mL의 녹아웃 혈청 치환, 500μL의 MEM(Minimal Essential Medium) 비필수 아미노산, 0.385μL(110mM 스톡) 베타-메르캅토에탄올 및 500μL 항생제-항진균제(AAS)로 IMDM 기저 배지 50mL를 보충합니다(최종 농도: 각각 17%, 1%, 110μM, 1%)( 재료 표 참조).
    2. 중간엽 기질 세포(MSC) 배지를 준비합니다.
      1. 저포도당 440mL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 소 태아 혈청(FBS) 50mL, 항생제-항진균액(AAS) 5mL, L-글루타민 5mL(최종 농도: 각각 10%, 1%, 2mM)를 보충합니다.
    3. 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(폴리-HEMA) 코팅판을 준비합니다.
      1. 폴리-HEMA( 재료 표 참조) 10g을 멸균 병에 넣습니다.
      2. 병에 자석 교반기를 넣고 저으면서 500mL 95% EtOH를 천천히 추가합니다.
      3. 모든 EtOH가 추가되면 최소 1200시간 동안 추가로 낮은 열을 가하면서 교반 모드를 6rpm으로 켭니다. poly-HEMA 용액은 실온에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
      4. 멸균 조건에서 T75 플라스크에 2.5μg/cm2 in 9 mL를 추가합니다. 배양 용기의 크기에 따라 부피를 조절하십시오.
      5. 멸균 상태를 유지하면서 사용하기 전에 EtOH가 완전히 증발할 수 있도록 용기를 공기 중에서 건조시킵니다. 일반적으로 24-72시간이 소요됩니다.
    4. 젤라틴 코팅 플라스크를 준비합니다.
      1. NaOH로 유리병을 씻고 젤라틴 준비에 바칩니다. 세제를 사용하지 마십시오.
      2. 1% 젤라틴 용액(젤라틴 5g과 내독소가 없는 물 500mL)을 준비합니다. 유리병을 젤라틴 용액으로 30분 동안 고압멸균합니다.
      3. 젤라틴 용액을 식히면 실온에서 보관할 수 있습니다.
      4. T75 플라스크 1개에 플라스크당 5mL의 젤라틴 용액을 코팅하고 세포를 파종하기 전에 최소 1시간 동안 배양합니다. 젤라틴 코팅 플라스크는 1일 전에 준비할 수 있습니다.
    5. 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액을 준비합니다.
      1. PBS를 2% 소 혈청 알부민 및 0.1% 아지드화나트륨과 혼합합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
  2. 배아체(EB)의 생성
    참고: iPSC는 6웰 플레이트에서 배양해야 하며 사용 전에 70%-80% 밀도에 도달해야 합니다.
    1. 0일째에 384 투명 바닥 PCR 플레이트를 조직 배양 후드에 넣고 뚜껑 없이 15분 동안 UV를 제공합니다.
    2. iPSC에서 성장 배지를 제거하고( 재료 표 참조) PBS로 웰을 세척합니다.
    3. 0.5mL의 예열된 부드러운 세포 해리 시약( 재료 표 참조)을 각 웰에 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. iPSC가 단일 세포 또는 현탁액으로 들어 올려진 작은 응집체가 될 때까지 5분마다 세포를 관찰합니다.
    4. 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 1mL 피펫으로 세포 현탁액을 재현탁시켰습니다.
    5. 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
    6. 상층액을 제거하고 IMDM-EB 배지에 재현탁하고(1.1.1단계) 혈구계 또는 세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.
    7. 웰당 25μL의 셀 현탁액으로 384웰 플레이트의 웰당 5,000-25,000개의 셀을 달성하는 데 필요한 적절한 셀 현탁액을 계산합니다.
      알림: 일반적으로 2웰 플레이트의 70-3-6 합류점(80%-6%) 웰은 하나의 384웰 플레이트에서 EB를 만들 수 있습니다. EB당 세포의 크기는 경험적으로 결정됩니다. 전체 384웰 플레이트의 경우 9.6mL의 셀 현탁액을 사용해야 하며, 웰당 25μL를 사용해야 합니다.
    8. 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 세포를 다시 원심분리합니다.
    9. 상층액을 제거하고 미리 냉각된 15mL 코니컬 튜브에 적절한 부피의 IMDM-EB 배지와 10μM의 Y-27632 디하이드로클로라이드(스톡: 10mM, 1000x, 재료 표 참조)에 세포를 재현탁시킵니다.
    10. 원뿔형에 저온 용해성 기저막 매트릭스(384웰 플레이트 분량의 EB당 1mg)를 추가합니다( 재료 표 참조).
    11. 셀 현탁액 25μL를 각 웰에 분배합니다. 멸균 뚜껑을 플레이트에 놓고 450 x g , 4°C에서 7분 동안 회전합니다. 37 °C에서 48 시간 동안 배양합니다.
    12. 2일째에 3mL의 예열된 IMDM-EB 배지가 있는 100mm 플레이트로 세포를 옮깁니다.
    13. EB를 10mL의 IMDM-EB가 있는 전용 poly-HEMA 코팅 T75 플라스크로 옮깁니다. 배양 용기의 크기에 따라 부피를 조절하십시오. EB가 3일 동안 증가하도록 허용합니다.
    14. 5일째에 EB를 10mL의 IMDM-EB 배지와 함께 준비된 젤라틴 코팅 T75 플라스크로 옮깁니다. 배양 용기의 크기에 따라 부피를 조절하십시오. 일시 중단된 상태에서 3일 더 EB를 성장시킵니다.
    15. 8일째 되는 날에는 플라스크에 부착된 EB와 부착되지 않은 EB의 두 가지 유형의 EB가 관찰되는지 확인합니다. PBS로 플라스크에서 부착되지 않은 EB를 씻어냅니다.
    16. 부착된 EB에 TGFβ-1(10ng/mL)이 보충된 IMDM-EB 배지를 추가하고( 재료 표 참조) 2일 동안 성장시킵니다.
    17. 10일째에 배지를 MSC 배지로 변경합니다. 세포는 일주일에 두 번 먹여야 합니다. 70%가 합류하면 "표준 리프팅 셀 프로토콜"로 진행하여 세포를 다시 도금합니다. 젤라틴 코팅된 플레이트에 세포를 다시 플레이트합니다.
  3. 표준 리프팅 셀 프로토콜
    1. 부착 세포가 70% 합류에 도달하면 플레이트에서 성장 배지를 흡인하고 PBS로 세척합니다.
    2. 각 150mm 플레이트에 예열된 0.25% 트립신 5mL를 첨가하여 세포를 들어 올리고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 배양 용기의 크기에 따라 트립신 부피를 조정합니다.
    3. 현미경으로 대부분의 세포가 각 플레이트에서 들어 올려졌는지 확인합니다. 여전히 셀이 부착되어 있는 경우 플레이트의 측면을 가볍게 두드려 셀을 제거합니다.
    4. 예열된 성장 배지의 부피를 두 배로 추가하여 세포를 원뿔형 튜브에 수집합니다.
    5. 세포를 실온에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 다음 단계로 진행합니다.
  4. MSC 마커 발현을 위한 유세포 분석 평가
    참고: 골수 MSC와 같은 인간 MSC는 양성 대조군으로 사용해야 합니다.
    1. "표준 리프팅 셀 프로토콜"(1.3단계)을 수행합니다.
    2. 3mL의 FACS 완충액으로 상층액을 재현탁하고 전체 부피를 FACS 튜브로 옮깁니다.
    3. 실온에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. FACS 버퍼로 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.
    4. 염색된 튜브에 2μL의 마우스 항인간 CD90-FITC, 마우스 항인간 CD44-APC 및 항인간 CD105-PE( 재료 표 참조)를 추가하고 4°C에서 45분 동안 배양합니다.
    5. 아이소타입 대조 튜브에 20μL의 마우스 IgG2a-FITC, 마우스 IgG1-PB 및 마우스 IgG1-PE를 추가합니다( 재료 표 참조).
    6. 어두운 곳에서 4°C에서 15분 동안 배양합니다. FACS 완충액 3mL를 추가하고 300 x g (실온)에서 5분 동안 원심분리하여 모든 튜브를 세척합니다. 각 튜브에 대해 250μL의 FACS 버퍼에 세포를 재현탁시킵니다.
    7. 유세포 분석14를 사용하여 MSC 표면 마커의 발현을 분석합니다. 여기 및 방출 파장은 CD90-FITC, 495nm에서 여기 피크 및 519nm에서 방출 피크여야 합니다. CD44-APC, 640에서 여기 피크 및 660nm에서 방출 피크; CD105-PE, 561nm에서 여기 피크 및 574nm에서 방출 피크.

2. iMSC 통과 및 확장

  1. 시약 준비
    1. MSC 동결 매체를 준비합니다.
      1. 저포도당 DMEM 30mL, DMSO 5mL, FBS 15mL를 혼합합니다(최종 농도: 각각 60%, 10%, 30%).
      2. 멸균 0.45μm 필터를 사용하여 용액을 여과합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
  2. 통과
    참고: 유도 후 iMSC는 플라스틱 조직 배양 플레이트에서 성장하기 위해 젖을 떼기 전에 젤라틴 코팅 플레이트에서 추가로 2개의 통로를 위해 성장해야 합니다. 또한 세포는 70%가 합류할 때 1:3 분할 비율로 통과해야 합니다.
    1. "표준 리프팅 셀 프로토콜"(1.3단계)을 수행합니다.
    2. MSC 배지에 세포를 재현탁시키고 플라스크당 20mL의 배지가 있는 T175 플라스크의 새로운 150mm 플레이트 3개에 세포를 균등하게 분배합니다. 세포를 37°C로 되돌립니다.
    3. 일주일에 두 번 성장 배지를 미리 예열된 MSC 배지로 교체하여 세포에 공급합니다.
  3. 결빙
    1. "표준 리프팅 셀 프로토콜"을 수행합니다.
    2. 세포를 1mL의 MSC 동결 배지에 재현탁시킵니다. 1mL의 세포 현탁액을 극저온 저장고에 넣고 -80°C에서 24시간 동안 냉동 용기에 보관한 후 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮깁니다.
  4. 녹고
    1. 15mL 코니컬 튜브에 10mL의 예열된 MSC 배지를 준비합니다.
    2. 냉동 공기를 꺼내 37°C 수조에 담그고 완두콩 크기의 얼음 공이 남을 때까지 휘젓습니다(약 1-2분).
    3. 세포 배양 후드에서 예열된 배지 1mL를 cryovial 및 피펫에 위아래로 천천히 추가하여 혼합합니다.
    4. 세포 현탁액을 cryovial에서 사전 예열된 배지를 사용하여 준비된 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 300 x g (실온)에서 5분 동안 원심분리합니다.
    5. 상층액을 제거하고 새 배지로 재현탁합니다. 총 부피가 20mL인 150mm 플레이트에 셀 현탁액을 추가합니다. 배양 플라스크의 크기에 따라 부피를 조절하십시오.
    6. 세포가 분리될 준비가 될 때까지 37°C에서 배양합니다.

3. 렌티바이러스 형질도입을 이용한 SCX를 과발현하기 위한 iMSC의 유전공학

참고: 프로토콜의 이 섹션을 완료하는 데 2주가 걸립니다.

  1. 배지 및 시약의 준비
    1. HEK293T/17 세포 배지를 준비합니다.
      1. Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 445mL에 FBS 50mL 및 AAS 5mL를 보충합니다(최종 농도: 각각 10%, 1%).
    2. MSC 렌티 패킹 배지를 준비합니다.
      1. 60°C 수조에서 30분 동안 실온 FBS 50mL를 가열하여 열 비활성화 혈청을 준비합니다.
      2. 445mL의 저포도당 DMEM을 열 비활성화 FBS 및 5mL의 L-글루타민과 결합합니다(최종 농도: 각각 10%, 2mM).
    3. transfection complex를 준비합니다.
      1. transfection 복합 성분(재료 표 참조)을 얼음 위에서 해동할 수 있습니다: 패키징 플라스미드 VSV-G 및 Delta, SCX 플라스미드 및 BioT15,16.
      2. 플라스미드를 부드럽게 소용돌이치고 회전시킵니다. DNA 농도를 측정합니다.
      3. DNA 농도와 transfection을 위한 플라스크의 수에 기초하여 필요한 각 성분의 부피를 계산합니다: 하나의 T75 플라스크에 대해 transfection 복합체는 750 μL 무혈청 배지(예: 무혈청 DMEM 또는 PBS), 7.5 μg SCX 플라스미드, 0.75 μg VSV-G 플라스미드, 6.75 μg Delta 플라스미드 및 22.5 μL BioT로 구성됩니다. 피펫팅 오류에 대한 추가 고려 사항.
      4. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 원심분리기에서 잠시 돌립니다. 실온에서 15분 동안 배양한 후 즉시 사용하십시오.
  2. 형질주입 및 렌티바이러스 생산
    주의: 3일째부터, 프로토콜은 렌티바이러스에 대한 작업을 수반하며, 따라서 격리 등급 2+ 작전 절차에 따라 작업을 수행해야 한다. 작업자는 장갑 2겹, 손목 덮개, 보안경, 마스크, 긴 바지 및 앞이 막힌 신발을 포함한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다. 피펫 팁, 플라스크 및 액체 배지를 포함한 모든 폐기물과 재료는 표백제(최종 1% 차아염소산나트륨)로 최소 20분 동안 오염을 제거해야 합니다. 진공 청소기를 사용하지 마십시오.
    1. HEK293T/17 세포를 파종합니다.
      1. transfection(0일) 약 18-24시간 전에 293T 세포를 들어 올려 T75 플라스크에 도금합니다. 다음 볼륨은 T75를 배양 용기로 가정합니다. 사용하는 세포 배양 용기에 따라 부피를 조절하십시오.
      2. 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 5mL의 PBS로 세척합니다.
        알림: 셀은 플라스크 표면에서 매우 쉽게 들어 올려집니다. 플라스크 측면에 PBS를 추가하고 셀에 용액을 직접 추가하지 마십시오.
      3. 각 플라스크에 예열된 0.25% 트립신 3mL를 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 원뿔형 튜브에 모으고 실온에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
      4. 상층액을 제거하고, 293T 배지에 재현탁하고, 혈구계 또는 세포 계수기를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.
      5. 세포를 5.3 x 104 cells/cm2 로 플레이트하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
      6. 다음날(1일차), transfection complex를 준비합니다. 세포의 성장 배지를 5mL의 예열된 MSC 렌즈 포장 배지로 교체합니다(단계 3.1.2).
      7. transfection complex를 세포에 적적식으로 추가합니다. transfection 복합체가 세포에 균일하게 노출되도록 접시를 부드럽게 기울입니다. 세포를 인큐베이터로 48시간 동안 되돌립니다.
        알림: 독성은 24시간(2일) 후에 관찰해야 합니다.
      8. 48시간(3일) 후 피펫을 사용하여 바이러스 함유 배지를 별도의 원뿔형 튜브에 조심스럽게 수집하고 300 x g (실온)에서 5분 동안 원심분리합니다.
      9. 293T 세포의 T75 플라스크에 5mL의 사전 예열된 MSC 렌티 패키징 배지를 추가하고 밤새 인큐베이터로 돌아갑니다.
      10. 원심분리 후 필터를 통해 상층액을 직접 피펫팅하여 0.45μm 제균 필터로 상층액을 여과합니다. 바이러스 함유 배지를 4°C에서 밤새 보관합니다.
      11. 또 다른 24시간(4일) 후 피펫을 사용하여 바이러스 함유 배지를 별도의 원뿔형 튜브에 다시 한 번 조심스럽게 수집하고 300 x g (실온)에서 5분 동안 원심분리합니다.
      12. 바이러스를 이전 채취일 바이러스와 결합하고 혼합하여 균질한 용액을 보장합니다. 이 시점에서 프로토콜은 실험 일정에 따라 일시 중지되고 나중에 다시 시작될 수 있습니다. 렌티바이러스를 분주하여 -80°C에서 동결시키거나, "SCX를 이용한 iMSC의 형질도입"(3.3단계)을 진행하면서 렌티바이러스를 얼음 위에 보관할 수 있습니다.
        참고: 렌티바이러스 부분 표본을 냉동 및 해동한 후에는 다시 얼리지 마십시오.
  3. SCX를 사용한 iMSC의 형질도입
    1. 역가 플레이트 transduction을 수행합니다.
      1. 0일째에 "표준 리프팅 셀 프로토콜"을 수행합니다.
      2. MSC 배지에서 세포를 재현탁시키고 혈구분석기 또는 세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.
      3. 6웰 플레이트에 4 x 103 cells/cm2를 추가합니다. 나머지는 20mL의 MSC 배지가 있는 추가 150mm 플레이트에 다시 플레이트합니다(이것이 컨트롤 플레이트가 됨). 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
      4. 다음 날(1일차)에 세포는 ~40% 합류해야 합니다. 렌티 포장 성장 배지를 예열하고 폴리브렌과 약 3mL의 렌티바이러스를 얼음 위에서 해동합니다(또는 바이러스 채취 당일에 해동한 경우 사용할 때까지 얼음 위에 보관).
      5. 원하는 역가(즉, 12.5%, 25%, 50%, 75%, 100%)에 따라 렌티 포장 성장 배지와 렌티바이러스를 웰에 추가합니다. 0.5μL의 폴리브렌을 첨가하여 5μg/mL의 최종 농도를 얻습니다(스톡 농도: 10mg/mL, 재료 표 참조).
      6. 모든 세포에 균일하게 노출되도록 플레이트를 빙빙 돌립니다. 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다.
    2. 유세포 분석을 통해 SCX 렌티바이러스 역가 효율을 평가합니다.
      1. 48시간 후 "표준 리프팅 셀 프로토콜"을 수행합니다.
      2. PBS에서 세포를 재현탁시키고 혈구계 또는 세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다. 세포를 실온에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
      3. 상층액을 제거하고 3mL의 FACS 완충액에 재현탁하여 세척합니다. 세포 현탁액을 유세포 분석 튜브로 옮기고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
      4. FACS 완충액을 2회 더 세척하고 최종 세포 펠릿을 300μL의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. 유세포 분석 기계를 사용하여 각 역가에 대한 GFP의 발현을 평가합니다.
      5. 역가와 세포 생존율 계수에 따라 형질도입을 진행하기에 적합한 렌티바이러스 역가를 결정합니다. 이 시점에서 프로토콜은 실험 일정에 따라 일시 중지되고 나중에 다시 시작될 수 있습니다.
    3. 대규모 SCX 변환을 수행합니다.
      알림: 나열된 부피는 1x 150mm 플레이트 또는 1x T175 플라스크당 것입니다. 이는 원하는 혈관 크기 및 형질도입 규모에 따라 적절하게 조정될 수 있습니다.
      1. 0일째에 "표준 리프팅 셀 프로토콜"을 수행합니다.
      2. MSC 배지에서 세포를 재현탁시키고 혈구분석기 또는 세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다. 세포를 4 x 103 cells/cm2로 파종합니다. 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
      3. 다음 날(1일차)에 세포는 ~40% 합류해야 합니다. 렌티 포장 성장 배지를 예열하고 폴리브렌과 미리 계산된 양의 렌티바이러스를 얼음 위에서 해동합니다.
      4. 결정된 역가에 따라 원하는 양의 렌티 포장 성장 배지와 렌티바이러스를 웰에 추가합니다. 5μg/mL의 폴리브렌을 추가합니다(원액 농도: 10mg/mL).
      5. 3일째에는 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. 새로 생산된 iMSCSCX+ 는 GFP를 형광으로 발해야 합니다. 바이러스 함유 배지를 사전 준비된 MSC 배지로 교체합니다. 이 시점에서 프로토콜은 실험 일정에 따라 일시 중지되고 나중에 다시 시작될 수 있습니다.

4. iMSCSCX+ 패세이징 및 확장

  1. 프로토콜의 2단계에 설명된 대로 iMSC와 동일하게 iMSCSCX+ 의 패싱, 확장, 동결 및 해동을 수행합니다.

5. 기계적 하중

참고: 이 섹션은 최소 4일이 소요되지만 세포 수축이 관찰되는지 여부에 따라 더 길어질 수 있습니다.

  1. 실험 준비
    1. 실리콘 플레이트를 준비합니다.
      1. 2개의 실리콘 플레이트를 오토클레이브합니다( 재료 표 참조). 후, 멸균 조건에서 오토클레이브 백에서 실리콘 플레이트를 제거하고 150mm 플레이트에 넣습니다.
      2. 15mL 코니컬 튜브에 130μL의 피브로넥틴(100x, 재료 표 참조)과 13mL의 멸균 PBS를 결합합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞습니다.
      3. 400μL의 피브로넥틴 용액을 실리콘 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 최소 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
      4. 사용하기 전에 피브로넥틴 용액을 흡인하고 플레이트를 세포 배양 후드에서 최소 30분 동안 자연 건조시켜 피브로넥틴 용액이 완전히 증발하도록 합니다.
        참고: 피브로넥틴 용액은 웰에서 미리 제거할 수 있으며, 현재 코팅된 플레이트는 사용할 때까지 최대 2주 동안 37°C에 둘 수 있습니다.
    2. MSC 스트레치 미디어를 준비합니다.
      1. 15mL 코니컬 튜브에 140μL의 아스코르브산(스톡: 100x, 최종 농도: 50μg/mL)을 14mL의 예열된 MSC 배지에 첨가하여 MSC 스트레치 배지를 준비합니다.
        참고: 아스코르브산은 모든 배지 교체 전에 MSC 여과지에 신선하게 첨가해야 합니다.
  2. 실리콘 플레이트에 iMSCSCX+ 파종
    1. "표준 리프팅 셀 프로토콜"(1.3단계)을 수행합니다.
    2. MSC 배지에서 세포를 재현탁시키고 혈구분석기 또는 세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.
    3. 1.25 x 104 cells/cm 2를 얻는 데 필요한 셀 현탁액의 부피를 계산합니다.
    4. 15mL 코니컬 튜브에서 이 부피의 MSC 스트레치 배지를 제거합니다. 대상 셀을 추가합니다. 새로운 세포 현탁액을 균질하게 반전시킵니다.
    5. 400μL의 새 셀 현탁액을 두 실리콘 플레이트의 모든 웰에 추가합니다.
    6. 150mm 플레이트에 뚜껑을 다시 덮고 37°C에서 24시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다.
  3. 단축 장력
    1. 다음날 스트레칭 장치( 재료 표 참조)를 ddH2O와 70% 에탄올로 헹굽니다. 기기를 닦고 세포 배양 후드에 넣고 15분 동안 UV를 씌웁니다.
    2. 파종된 플레이트를 회수하고 웰에 세포가 잘 부착되어 있는지 확인합니다.
    3. 인큐베이터(정적 제어)에 한 플레이트를 남겨두고 나사를 실리콘 플레이트의 구멍에 맞춰 두 번째 시드된 실리콘 플레이트를 스트레칭 장치에 넣습니다. 멸균을 보장하기 위해 장치의 뚜껑을 교체하십시오.
    4. 씨를 뿌린 실리콘 플레이트가 있는 장치를 전자 소스( 재료 표 참조)에 부착하고 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
    5. 프로그램에서 순환 스트레칭 프로토콜을 4% 정현파 변형률, 0.5Hz, 하루 2시간 으로 설정합니다. 시작 버튼을 한 번 눌러 스트레칭을 시작합니다. 스트레칭은 즉시 시작해야 합니다.
    6. 최소 3일 동안 세포를 늘립니다. 매일 세포를 모니터링하고 세포 수축이 관찰될 수 있는 경우 스트레칭 프로토콜을 중지합니다. 이틀에 한 번씩 새로운 MSC 스트레치 미디어로 교체하십시오.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 iPSC와 iMSC의 분화
앞서 설명한 바와 같이, iPSC를 iMSC로 분화하기 위한 현재의 프로토콜은 배아체(embryoid body)의 형성을 포함한다(2). 이 과정은 iPSC에서 iMSC를 유도하는 데 약 10일이 걸립니다(그림 1A). 그러나 새로 생성된 iMSC를 최소 두 번 통과하는 것이 좋습니다. 이는 젤라틴 코팅 플레이트의 필요성을 없애는 데 도움이 될 뿐만 아니라 안정적인 MSC 발현을 확립하는 데 도움이 됩니다. 분화 후 6번의 통과 후에 수행된 유세포 분석 정량화는 CD44(83.1%), CD90(88.4%) 및 CD105(99.2%)를 포함한 고전적인 MSC 표면 마커의 높은 발현으로 거의 순수한 세포 집단을 보여줍니다17,18(그림 1B). 형태학적 측면에서 iMSC는 골수 MSC와 매우 유사하며 길쭉하고 섬유아세포와 유사해야 합니다(그림 1C).

렌티바이러스 형질도입을 이용한 SCX를 과발현하기 위한 iMSC의 유전공학
Lentivirus는 2개의 패키징 플라스미드와 함께 SCXB를 삽입하여 SCX-GFP+를 발현하는 pLenti-C-mGFP 벡터로 HEK293T/17 세포를 transfection하여 생성되었습니다. 형질주입은 BioT(μl) 대 DNA(μg)의 1.5:1 비율로 BioT 방법15,16을 사용하여 수행하였다.

HEK293T/17 세포는 형질주입 전 5.3 x 104 cells/cm2 18-24 시간의 밀도로 파종되었습니다. transfection 시 세포는 저효율 역가를 피하기 위해 80%-95% 밀도에 도달해야 합니다(그림 2B1, 왼쪽). 플라스미드 칵테일을 첨가한 후 24시간 이내에 약간의 독성이 관찰되었으며, 이는 48시간에 최고조에 달했습니다(그림 2B2). SCX 렌티바이러스 벡터는 GFP 접합체이므로 GFP 발현은 48시간 후에 관찰할 수 있어야 합니다(그림 2B3). GFP 발현과 결합된 높은 독성의 존재는 성공적인 transfection의 신뢰할 수 있는 지표입니다. 렌티바이러스는 48시간 및 72시간에 수집하고, 유세포 분석 및 유전자 발현 분석을 사용하여 형질도입 효율을 평가하였다. GFP 양성 세포의 절대 강도는 SCX 통합의 대용물로 사용되었으며, 역가가 높을수록 훨씬 더 높았습니다(그림 3A). SCX-GFP+ 세포의 백분율로 측정된 transduction 효율은 렌티바이러스 부하에 따라 용량-반응 효과를 입증했습니다(그림 3B). 다른 통로에서 iMSCSCX+ 의 유세포 분석도 전이유전자 발현 수준이나 형질도입된 세포의 비율에 변화가 없는 높은 안정성을 보여주었습니다(그림 3C). 또한, 분류하지 않고 4주 동안 규칙적으로 배양한 후 iMSCSCX+ 는 SCX의 안정적인 과발현을 유지했습니다(그림 3D). 대규모 transduction은 75% 렌티바이러스를 사용하여 역가를 기반으로 수행되었습니다(그림 2C).

iMSCSCX+의 기계적 로딩
iMSCSCX+ 세포는 스트레칭 프로토콜을 시작하기 전에 세포 부착을 허용하기 위해 1.25 x 104 cells/cm2(그림 4A,B)의 세포 밀도로 변형 가능한 실리콘 플레이트에 파종되었습니다. 최종 파종 밀도는 단층 과잉 증식을 방지하기 위해 최적화되었습니다. 과도하게 높은 파종 밀도가 조기 세포 수축과 조기 세포 사멸을 초래했다는 점은 주목할 가치가 있습니다(그림 4D). 정적 대조군의 경우, 세포는 동일한 플레이트에 도금되었지만 스트레칭을 거치지 않았습니다. iMSCSCX+ 세포는 2D 바이오리액터에서 하루 2시간 동안 4% 단축 변형률 및 0.5Hz에서 최소 3일, 최대 7일 동안 스트레칭되었습니다. 이 스트레칭 요법은 생리학적으로 관련이 있는 것으로 기술된 것과 일치한다9. 며칠 동안 스트레칭을 한 후, 무작위 세포 조직을 나타낸 정적 그룹과 비교하여 어느 정도의 세포 조직을 관찰할 수 있습니다(그림 4C). 액틴 필라멘트의 팔로이딘 염색은 정적 플레이트에서 관찰되는 무작위 세포 조직과 달리 세포가 늘어나는 방향에 수직으로 성장하는 것처럼 보이는 방식을 더욱 강조합니다(그림 4E). 새로 생성된 iTenocyte를 특성화하기 위해, 이전에 보고된 바와 같이 유전자 발현 분석을 위해 3일 및 7일에 세포를 수집하였다14. 유전자 발현 분석은 0일째에 iMSC만 있는 것에 비해 3일과 7일 모두에서 tenogenic 유전자(SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX 및 TPPP3)5,7,19,20에서 상당한 상향 조절이 있기 때문에 iMSCSCX+ 세포가 기계적 반응성이 있음을 보여줍니다(그림 5A). 또한, 스트레칭 7일 후 배지 내 콜라겐 침착은 iMSCSCX+ 스트레칭 그룹에서 다른 모든 그룹에 비해 유의하게 높았습니다(그림 5B).

figure-results-1
그림 1: iMSC 분화 회로도 및 유세포 분석 특성화. (A) iMSC 유도를 위한 iTenocyte 생성 및 타임라인의 전체 개략도. Papalamprou A. et al.14의 허가를 받아 복제했습니다. (B) 유세포 분석 정량화는 분화 후 6개 통과 후 iPSC 유래 MSC에 대한 고전적인 MSC 표면 마커를 발현하는 세포의 높은 비율을 보여줍니다. Sheyn D. et al.2의 허가를 받아 각색했습니다. (C) 분화 후 세포의 위상차 이미지는 섬유아세포와 유사한 형태를 보여줍니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: iMSCSCX+ 생산 회로도. (A) 2세대 SCX 렌티바이러스 벡터를 사용한 transfection 및 iMSC의 transduction의 전체 개략도. Papalamprou A. et al.14의 허가를 받아 복제했습니다. (나1) 플라스미드 칵테일을 첨가하기 전의 HEK293T/17 세포. (나2) HEK293T/17 세포는 48시간 후에 GFP를 발현하고 독성을 나타냅니다. (나3) HEK293T/17 세포에서 관찰할 수 있는 GFP의 발현은 성공적인 transfection을 나타냅니다. (C) 생성된 iMSCSCX+ 세포(75% 역가)는 핵에서 SCX-GFP+ 를 발현합니다. 스케일 바 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 유세포 분석 및 유전자 발현을 통한 transduction 효율 측정. GFP 양성 세포의 절대 강도는 유세포 분석을 사용하여 SCX 통합을 위한 프록시로 사용되었습니다. 벡터 역가는 렌티바이러스 MOI를 평가하기 위해 모든 세포에 대한 유세포 분석을 통해 검증되었습니다. (A) 바이러스 역가당 절대 형광. (B) SCX-GFP+ 세포의 백분율로 평가된 형질도입 효율. 형질도입 효율에 대한 렌티바이러스 부하의 용량-반응 효과는 흐름 결과가 GFP+ 세포의 백분율로 제시되었을 때 관찰되었습니다. MOI, 감염의 다중성, n = 3개의 독립적인 형질도입. 역가를 비교하기 위해 일원 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용했습니다. 데이터는 평균± SD입니다. *p < 0.05. (C) 여러 차례의 passaging 후 iMSCSCX+ 의 유세포 분석은 안정적인 전이유전자 발현 수준의 변화와 형질도입된 세포의 비율에 변화가 없음을 나타냅니다. 100% 역가로 형질도입된 iMSC는 P3에서 분열을 멈췄습니다. (D) SCX-GFP+ 렌티바이러스 벡터(75%, MOI = 2.9 e5 TU/mL)로 transduction한 iMSC를 분류하지 않고 4주간의 정규 배양에서 SCX의 유전자 발현을 평가했습니다. SCX 발현은 iMSCSCX+ 에서 현저하게 상향 조절되어 4주 후 SCX의 안정적인 과발현을 보여주었습니다. TU, 형질 주입 장치; data는 평균± SD, **p > 0.01입니다. Papalamprou A. et al.14의 허가를 받아 복제했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: iMSCSCX+ 를 2D 바이오리액터에 파종하고 주기적 스트레칭을 거칩니다. (A) 2D 바이오리액터 개략도. Papalamprou A. et al.12의 허가를 받아 복제했습니다. (B) 세포는 먼저 유연한 실리콘 플레이트에 파종되고 37°C에서 배양되어 2D 바이오리액터에서 주기적으로 늘어나기 전에 부착할 수 있습니다. (C) iMSCSCX+ 를 2D 바이오리액터에서 최대 7일 동안 연신하였다. 정적 제어의 경우 세포는 동일한 플레이트에 도금되었지만 스트레칭은 없었습니다. (다1) 7일 후 정적 제어판은 세포의 확률적 배열을 나타냅니다. (다2) 7일 후 늘어난 플레이트는 상대적으로 더 많은 세포 조직을 보여줍니다. (D) 준수하지 말아야 할 것의 세 가지 예. 세포 파종 밀도가 너무 높거나 세포가 너무 많은 날 동안 늘어나면 세포가 분리되기 시작합니다. (1일차) 세포는 약간만 과도하게 자랍니다. 노란색 화살표는 조기 세포 수축의 시작을 나타냅니다. (2일) 중간 정도의 과성장. 세포가 플레이트에서 분리되기 시작합니다. (3일차) 심각한 수준의 과잉 성장. 세포는 더 이상 단층에서 자라지 않고 3D 구조를 형성합니다. 블랙 스케일 바 = 400 μm. 백색 스케일 막대 = 1000 μm. (E) 7일간의 스트레칭 후(또는 정적 플레이트의 경우 배양 중) 액틴 필라멘트(빨간색)에 대해 팔로이딘으로 세포를 고정하고 핵(파란색)에 대해 DAPI로 대조염색했습니다. 흰색 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 2D 바이오리액터에서 Scx 과발현 및 단축 스트레치에 의한 tenogenic marker 유전자 발현 자극. (A) iMSCSCX+ 를 2D 바이오리액터에서 7일 동안 연개했습니다. 정적 제어의 경우 세포는 동일한 플레이트에 도금되었지만 스트레칭은 없었습니다. 유전자 발현 분석 결과 iMSCSCX+ 는 기계적 반응성이 있는 것으로 나타났습니다. ND = 감지 없음. 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 각 시점에서의 유전자 발현을 비교했습니다. d0입니다. N = 8/그룹. (B) 2D 생물반응기에서 7일간의 스트레칭 후 콜라겐 침착. 데이터는 SD± 평균입니다. n = 8/그룹; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Papalamprou A. et al.12의 허가를 받아 복제했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서 iTenocyte는 (1) iMSC에 대한 iPSC의 유도, (2) 렌티바이러스 벡터를 사용한 SCX의 과발현, (3) 2D 단축 장력을 통한 세포 성숙의 세 가지 주요 단계를 통해 생성됩니다.

iPSC를 iMSC로 구별하기 위해 제시된 프로토콜은 이전에 그룹2에서 설명했습니다. 이 발표 이후, 임상시험에서 iMSC를 사용하기 위한 확립된 프로토콜(21,22,23)과 상업적으로 이용 가능한 분화 키트를 포함하여 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. iMSC의 삼계보 잠재력에 대한 검토도 이전에 조사된 바 있다2. 방법론은 다르지만, 모든 프로토콜은 MSC 표면 마커의 안정적인 발현을 보장하기 위해 여러 통로에 대한 iMSC의 분화 후 확장의 필요성을 강조합니다. 이 단계에서 약 70% 합류점에서 1:3 분할 비율을 사용하면 통과 후 4-6일 이내에 상대적으로 합류하는 플레이트가 생성됩니다.

형질도입을 위한 최적의 titer를 선택할 때는 세포 생존율과 효율성 사이의 균형을 맞추는 것이 중요합니다. 100% 역가로 transduction된 iMSC는 가장 높은 수준의 SCX-GFP 양성 세포를 나타낼 수 있지만, 이러한 세포가 DNA 유도 독성으로 인해 transduction 후 3개의 통로 분열을 멈췄다는 점은 주목할 가치가 있습니다(그림 3C). 따라서 100% 미만의 역가를 사용하는 것이 좋습니다. 실리콘 플레이트를 파종하기 전에 유세포 분석을 사용하여 SCX-GFP 수준을 재평가하는 것이 좋습니다. 데이터가 효율이 원하는 임계값 미만임을 나타내는 경우, 특히 in vivo 응용 분야의 경우 파종 전에 iMSCSCX+ 세포를 분류하는 것이 좋습니다.

iMSCSCX+ 세포를 실리콘 플레이트에 파종한 후에는 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 늘어나기 전에 세포가 부착될 수 있도록 해야 합니다. 실리콘 플레이트에서 기술된 1.25 x 104 cells/cm2의 세포 밀도는 정적 장력(24)에 기여할 수 있는 단층 과성장을 방지하도록 최적화되었다. 또한, 연구에 따르면 다양한 강성의 기질에서 합류 배양에서 직접 세포 간 접촉이 세포 거동을 변경할 수 있음을 시사합니다 24,25,26. 파일럿 실험 중에 실리콘 플레이트에서 일부 눈에 띄는 세포 분리가 관찰되었으며, 특히 이후 시점에서 관찰되었습니다(그림 4D). 이는 과잉 합류(overconfluence)로 인한 ECM 세포 시트의 형성에 기인할 수 있다24. 따라서 중요한 매개변수에는 세포 밀도와 스트레치 시합 수가 포함됩니다. 현재 방법에서는 유전자 발현 분석을 통한 테노겐 잠재력의 평가를 위해 3일째 및 7일에 세포를 수집했습니다. 그러나 2D 바이오리액터에서 세포를 최소 3일 동안 스트레칭하고 과잉 증식 및 세포 분리를 방지하기 위해 스트레칭 및 정적 플레이트를 모니터링하는 것이 좋습니다.

몇 번의 스트레치 시합 후에 어느 정도의 세포 정렬과 조직을 관찰할 수 있습니다(그림 4C1,E). 이는 시험관 내 단축 변형에 대한 반응으로 변형 축에 수직인 세포 정렬이 관찰되는 많은 연구와 일치합니다 24,27. 이에 비해 정적 플레이트는 확률적 세포 조직을 표시합니다(그림 4C2,E).

우리가 아는 한, MSC를 건세포 또는 리가멘토세포로 분화시키기 위한 SCX 과발현 및 기계적 자극의 시너지 효과를 탐구한 연구는 소수에 불과하다 24,28,29. Gaspar et al.은 여기에 설명된 것과 유사한 2D 바이오리액터 시스템을 사용했지만 더 높은 수준의 총 변형률(12시간/일 동안 1Hz에서 10%)을 적용했습니다. 흥미롭게도, 그들은 BM-MSC와 인간 건세포에서 SCX, TNMD 및 COL1a1의 발현 변화를 감지할 수 없었습니다. 그러나, 이것은 그들의 연구에서 사용된 더 높은 적용 균주에 기인할 수 있다24. Chen et al.은 다층 시트로 조립된 hESC-MSC에서 SCX를 과발현하기 위해 렌티바이러스 벡터를 사용했습니다. 그들은 단축 순환 하중(최대 21일 동안 2시간/일 동안 1Hz에서 10% 변형률)을 적용하고 COL1a1, COL1a2, COL14 및 TNMD의 상향 조절과 ECM 증착 증가를 관찰했습니다29. Nichols et al.은 전장 쥐 Scx cDNA로 C3H10T1/2 세포를 일시적으로 transfection하고 단축 고리 변형(1%, 1Hz, 최대 14일 동안 30분/일) 하에서 3D 콜라겐 하이드로겔에서 세포를 배양했습니다. 우리의 발견과 유사하게, 그들의 그룹은 변형되고 과발현된 구성물에서 SCX 및 COL1A1의 상승된 발현을 관찰했지만, 주기적 스트레칭에 대한 반응으로 TNMD 발현의 변화는 발견하지 못했다28.

또한 MKX와 같은 다른 힘줄 관련 마커의 과발현을 고려하는 것이 흥미로울 수 있습니다. Tsutsumi et al.은 C3H10T1/2 세포에서 MKX를 과발현하고 3D 시스템에서 주기적인 기계적 스트레칭을 적용하는 복합적인 효과를 탐구했습니다. 그들은 콜라겐 피브릴 다발 및 액틴 필라멘트30의 정렬과 함께 SCX, COL1a1, DCN 및 COL3a1의 상당한 상향 조절을 입증했습니다.

iTenocyte를 생성하는 이 방법에는 한계가 있다는 것을 인정하는 것이 중요합니다. 상업적으로 이용 가능한 2D 바이오리액터는 개념 증명 작업에 유리하지만 크기가 수율을 제한합니다. 이러한 세포가 고처리량 분석에 필요하거나 힘줄 복구 요법을 위한 잠재적인 기성 세포 공급원으로 필요한 경우 더 큰 규모로 단축 스트레칭을 구현할 수 있는 시스템을 탐색하는 것을 고려해야 합니다. 또한, 추가 조사는 안정적인 tenogenic 발현을 확인하기 위해 iTenocyte의 확장을 포함해야 하며, in vivo 재생에 대한 기여도를 평가하는 것은 tenogenic 잠재력을 평가하는 데 중요합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 NIH/NIAMS K01AR071512 및 CIRM DISC0-14350에서 Dmitriy Sheyn에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 두 개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 Simon Knott 실험실(Cedars-Sinai Medical Center, Department of Biomedical Sciences)에서 기증한 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메르캅토에탄올 Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920세포 해리 시약
항생제-항진균 용액Thermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
APC 마우스 anti-human CD44BD Biosciences559942
APC 마우스 IgG2 K isotype controlBD Biosciences555745
BenchMark 소 태아 혈청GeminiBio100-106
BiglycanThermofisherHs00959143_m1
소 혈청 알부민Millipore SigmaA3733
콜라겐 유형 I 알파 1 체인 인간 Taqman 프라이머ThermofisherHs00164004_m1
콜라겐 유형 III 알파 1 체인 인간 Taqman 프라이머ThermofisherHs00943809_m1
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD8418
DMEM, 저포도당, 피루베이트, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음Thermofisher11054020
Eagle의 최소 필수 매체 (EMEM)ATCC30-2003
Fibronectin 소 혈장Sigma AldrichF1141
FITC 마우스 안티 휴먼 CD90BD Biosciences555595
젤라시그마 알드리치G1890
염소 안티 마우스 IgG1-PE바이오 라드STAR117
HEK 293T/17ATCCCRL-11268
IMDM, 페놀 레드써모피셔21056023
iPSC: 83i-cntr-33n1Cedars-Sinai iPSC 핵심 시설N/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control 항체, 마우스 IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
KnockOut 혈청 교체Thermofisher10828010
L-아스코르브산Sigma AldrichA4544
L-글루타민Thermofisher2503081
MatrigelCorning354230기저막 매트릭스
MechanoCulture FXCellScaleN/A스트레칭 장치
MEM 비필수 아미노산 용액Thermofisher11140050
Mohawk human Taqman 프라이머ThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
혈소판 유래 성장 인자 수용체 A 인간 Taqman 프라이머ThermofisherHs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)Sigma Aldrich192066
Polybrene 감염/형질 주입 시약Millipore SigmaTR-1003
재조합 인간  TGF-beta 1 단백질 인간 Taqman 프라이머RnD 시스템240-B
Scleraxis 인간 Taqman 프라이머ThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) 인간 태그 ORF 클론OriGeneRC224305L4
실리콘 플레이트CellScaleN/A
아지드 나트륨Millipore 시그마S2002
Tenascin C human Taqman 프라이머ThermofisherHs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman 프라이머ThermofisherHs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman 프라이머ThermofisherHs00170261_m1
Transfection 시약, BioTBioland Scientific LLCB01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermofisher25200072
단백질족 구성원 3ThermofisherHs03043892_m1
Y-27632 dihydrochlorideBiogems1293823
돼지 껍질에서 추출한 틴

참고문헌

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