방법 논문

단백질체학 및 인산염체학 분석을 위한 생체 유체에서 세포외 소포체의 화학적 친화성 기반 분리

DOI:

10.3791/65844

⸱

2023년 10월 27일

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1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

이 논문에서

요약

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본 프로토콜은 기능성 자성 비드를 이용한 요로 세포외 소포체의 효율적인 분리를 위한 상세한 설명을 제공한다. 또한 웨스턴 블로팅(western blotting), 단백질체학(proteomics) 및 포스포프로테오믹스(phosphoproteomics)를 포함한 후속 분석도 포함됩니다.

초록

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생체액의 세포외 소포체(EV)는 최근 액체 생검 분야에서 상당한 주목을 받고 있습니다. 거의 모든 유형의 세포에서 방출되는 이 세포는 숙주 세포의 실시간 스냅샷을 제공하며 단백질, 특히 세포 기능과 질병 발병 및 진행의 주요 역할을 하는 인산화와 같은 번역 후 변형(PTM)이 있는 단백질을 포함한 풍부한 분자 정보를 포함합니다. 그러나 현재 EV 분리 방법의 낮은 수율과 불순물로 인해 생체 유체에서 EV를 분리하는 것은 여전히 어렵기 때문에 EV 인단백질과 같은 EV 화물의 다운스트림 분석이 어렵습니다. 여기에서는 인간의 소변 및 다운스트림 단백질체학 및 EV 분리 후 인산염체 분석과 같은 생체 유체로부터 EV를 분리하기 위한 기능성 자성 비드를 기반으로 하는 빠르고 효과적인 EV 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 소변 EV의 높은 회수율과 EV 단백질체 및 포스포프로테옴의 민감한 프로파일을 가능하게 했습니다. 또한 이 프로토콜의 다양성과 관련 기술 고려 사항도 여기에서 다룹니다.

서론

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세포외 소포체(EV)는 모든 유형의 세포에서 분비되는 막에 캡슐화된 나노 입자이며 혈액, 소변, 타액 등과 같은 생체 유체에 존재합니다.1,2,3,4. EV는 숙주 세포의 생리학적 및 병리학적 상태를 반영하는 다양한 생체 활성 분자의 화물을 운반하므로 질병 진행에 중요한 요인으로 기능합니다 4,5,6. 또한, 광범위한 연구를 통해 증상이 시작되거나 종양이 생리적으로 감지되기 전에 EV 기반 질병 마커를 식별할 수 있다는 것이 입증되었습니다 5,6,7.

인산화는 세포 신호 전달 및 조절의 핵심 메커니즘으로 작용합니다. 따라서 인단백질은 비정상적인 인산화 사건이 조절되지 않는 세포 신호 전....

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프로토콜

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모든 소변 샘플은 정보에 입각한 동의 후 건강한 개인으로부터 수집되었습니다. 실험은 인체 샘플과 관련된 모든 윤리 기준을 준수했으며 퍼듀 대학교 인간 연구 보호 프로그램의 지침을 준수했습니다.

1. 시료 채취

  1. 15mL 원뿔형 원심분리 튜브에 12mL의 소변 샘플을 원심분리하여 2,500 x g, 4°C에서 10분 동안 세포 파편과 큰 세포사멸체를 제거합니다.
  2. 상층액 10mL를 새 15mL 튜브에 옮기고 EV 분리를 진행합니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 샘플은 -80°C에서 보관하고 사용 시 37°C에서 해동할 수 있습니다.

2. EVtrap 접근 방식을 사용한 EV 절연

  1. 제조업체의 지침에 따라 0.5mL의 로딩 버퍼(1:10 v/v 비율)와 100 μL의 EVtrap 비드 슬러리(1:50 v/v 비율)를 샘플에 추가합니다.
  2. 실온에서 30분 동안 종단 회전으로 샘플을 배양합니다.
  3. 15mL 원뿔형 튜브를 자석 분리기 랙에 놓아 샘플을 펠릿화합니다. 상층액을 제거합니다.
  4. 비드를....

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결과

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이 프로토콜은 EV 분리부터 다운스트림 단백질체학 및 인산염체 분석에 이르는 포괄적인 워크플로우를 보여줍니다(그림 1). 세 개의 소변 샘플은 EV 분리를 거쳤습니다. 분리된 EV는 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 특성화되었으며 이후 단백질 추출, 효소 분해 및 펩타이드 클린업을 포함한 질량 분석 기반 단백질체학 시료 전처리를 위해 처리되었습니다. 인산화체학 분석을 위해, 인산펩타이드는 금속 이온 작용성 가용성 나노폴리머를 기반으로 더욱 농축되었습니다. 펩타이드 및 포스호펩타이드 샘플은 모두 데이터 독립적 모드에서 고분해능 이온 이동도 질량분석법으로 분석되었습니다. 그 결과 호모 사피엔스 데이터베이스와 비교하여 원시 파일을 검색하고, 식별 및 MS2 수준 정량화를 위해 라이브러리가 필요 없는 데이터 독립적 수집 워크플로우를 수행했습니다.

분리된 EV의 특성을 분석하고 회수율 추정을 위해 먼저 .......

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토론

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효과적인 EV 분리는 EV에서 저농도 단백질과 인단백질을 검출하기 위한 필수 전제 조건입니다. 이러한 요구를 충족시키기 위한 수많은 방법이 개발되었음에도 불구하고 대다수는 여전히 회복 불량 또는 낮은 재현성과 같은 한계로 고통받고 있으며, 이는 대규모 연구 및 일상적인 임상 환경에서 활용을 방해합니다. DUC는 일반적으로 EV 분리를 위한 가장 일반적인 방법으로 간주되며, 추가 세척 단계는 일반적으로 대상 EV의 순도를 증가시키는 데 도움이 되도록 적용됩니다(27,28). 이 절차는 더 지루하고 시간이 많이 걸리는 DUC 프로세스로 이어집니다(> 6시간). 또한, DUC 후 낮은 EV 회수 수율은 여러 연구에서 보고되었으며,29,30 그림 2의 결과에서 볼 수 있습니다.......

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공개 사항

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저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언합니다. Anton Iliuk와 W. Andy Tao는 EVtrap 비드를 개발하고 PolyMAC 인산펩타이드 농축 키트를 상용화한 Tymora Analytical Operations의 공동 설립자입니다.

감사의 글

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이 연구는 NIH 보조금 3RF1AG064250 및 R44CA239845의 일부 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브생명과학 제품M-1700C-LB
1.5 mL 튜브 자기 분리기 랙Sergi Lab Supplies1005
15 mL 원추형 원심분리기 튜브Corning 
15 mL 튜브 자기 분리기 랙Sergi Lab Supplies1002
Anti-rabbit IgG, HRP 결합 항체세포 신호 기술7074P2
벤치탑 배양 쉐이커BioerDIS-87999-3367802Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAbCell Signaling Technology13403S
클로로 아세트 아미드시그마 -AldrichC0267-100G환원 된 황화물 그룹의 알킬화에 사용됩니다. 원액으로 물에 400mM를 신선하게 준비합니다.
에틸 아세테이트 피셔 사이언티픽 E145-4침전 세제
Evosep One Evosep액체 크로마토그래피 시스템
EvotipsEvosepEV2013Evosep One 시스템용 샘플 로딩 
EVtrapTymora Analytical기능화된 자석 비드, 로딩 버퍼, 그리고 세척 버퍼 
Immobilon-FL PVDF 멤브레인시그마 -AldrichIPFL00010블로팅 멤브레인 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9Bruker 1893473분리 컬럼 
인산가수분해효소 억제제 칵테일 2시그마 -AldrichP5726-5ML100X, 인산가수분해효소 억제제.
인산가수분해효소 억제제 칵테일 3시그마 -AldrichP0044-1ML100X,  포스포타제 억제제. 
Pierce BCA 단백질 분석 키트ThermoFisher23225
Pierce ECL 웨스턴 블로팅 기판ThermoFisher32106HRP 기판 
PolyMAC 인산펩타이드 농축 키트Tymora Analytical폴리머 기반 금속 이온 친화성 포착 (PolyMAC) 인산펩타이드 농축
나트륨 데옥시콜레이트 Sigma -AldrichD6750-10G용해 완충액용 세제. 120mM의 물을 원액으로 준비합니다.
나트륨 라우로일 사르코시네이트 Sigma -AldrichL9150-50G용해 완충액용 세제. 120mM의 물을 원액으로 준비합니다.
timsTOF HTBrukerTrapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μ L) 팁 GlygenTT2C18.96탈염 방법
TriethylamineSigma -Aldrich471283-100MLEV 용출. 
트리에틸암모늄 비카보네이트 완충액시그마 -AldrichT7408-100ML1m
트리플루오로아세트산시그마 -Aldrich302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride시그마 -AldrichC4706이황화 결합의 감소에 사용됩니다. 200mM의 물을 원액으로 준비합니다. 원액을 소량으로 분취하고 at-20°c에 보관하십시오. C(여러 번의 동결-해동 주기 방지).
트립신/Lys-C MIXThermoFisherPIA41007
352097

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al.

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Extracellular VesiclesEV IsolationBiofluid ProteomicsPhosphoproteomics AnalysisMagnetic Bead IsolationUrinary EVsLiquid BiopsyMass SpectrometryPhosphopeptide EnrichmentPost Translational Modifications

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