유전적으로 인코딩된 센서를 사용하여 생체 외 초파리 유충 뇌에서 모노카르복실레이트 및 기타 관련 대사 산물 시각화

요약

여기에서는 생체 외 초파리 유충 뇌 제제에서 유전적으로 인코딩된 Förster 공명 에너지 전달 기반 센서를 사용하여 신경교세포와 뉴런에서 모노카르복실레이트, 포도당 및 ATP의 수송을 시각화하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

전기 활동으로 인한 뇌의 높은 에너지 요구량은 가장 두드러진 특징 중 하나입니다. 이러한 요구 사항은 포도당과 모노카르복실레이트 젖산염 및 피루브산과 같은 대사 산물에서 ATP를 생성함으로써 충족됩니다. 이 과정이 어떻게 규제되는지, 특히 초파리의 핵심 주체가 누구인지는 아직 불분명합니다.

유전적으로 인코딩된 Förster 공명 에너지 전달 기반 센서를 사용하여 생체 외 초파리 유충 뇌 제제에서 신경교세포와 뉴런에서 모노카르복실레이트와 포도당의 수송을 측정하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 센서 중 하나를 발현하는 유충 뇌를 해부하고 유리 커버슬립에 부착하는 방법을 설명합니다.

우리는 신경교세포에서 이전에 확인된 모노카르복실레이트 수송체를 쓰러뜨려 유충 뇌에서 젖산 수송을 측정한 전체 실험의 결과를 제시합니다. 또한 신경 활동을 빠르게 증가시키고 활성 뇌의 대사 산물 변화를 추적하는 방법을 보여줍니다. 필요한 모든 정보를 제공하는 설명된 방법은 다른 초파리 생체 조직을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

뇌는 시냅스 전달뿐만 아니라 뉴런의 전기 신호 생성 및 전달로 인한 뉴런의 이온 구배를 복원하는 데 많은 비용이 들기 때문에 높은 에너지 요구량을 가지고 있습니다 ^1,2. 이 높은 에너지 수요는 ATP³를 생성하기 위해 포도당의 지속적인 산화에 의해 충족되는 것으로 오랫동안 생각되어 왔습니다. 혈액-뇌 장벽의 특정 수송체는 혈액 속의 포도당을 뇌로 전달합니다. 혈당 수치가 일정하면 뇌가 포도당을 꾸준히 공급받을 수 있습니다⁴. 흥미롭게도, 젖산염 및 피루브산과 같은 포도당 대사에서 파생된 분자가 뇌 세포의 에너지 생산에 중요한 역할을 한다는 실험적 증거가 증가하고 있습니다 ^5,6. 그러나 이러한 분자가 에너지 생산에 얼마나 중요한지, 뇌의 어떤 세포가 생성하거나 사용하는지에 대한 논쟁이 여전히 있습니다 ^7,8. 이 작업에 필요한 높은 시간적, 공간적 해상도를 가진 적절한 분자 도구의 부족은 이 논....

프로토콜

1. 파리 균주 유지 및 유충 동기화

1. 이러한 실험을 수행하기 위해 10% 효모, 8% 포도당, 5% 밀가루, 1.1% 한천, 0.6% 프로피온산 및 1.5% 메틸파라벤으로 구성된 표준 초파리 식품에 대해 25°C에서 올린 파리 배양액을 사용합니다.
2. 이 프로토콜을 따르려면 w¹¹¹⁸ (실험 대조군 배경), OK6-GAL4 (운동 뉴런용 드라이버), repo-GAL4 (모든 신경교세포용 드라이버), CG-GAL4 (지방체용 드라이버), UAS-Pyronic (피루브산 센서), UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (포도당 센서), UAS-Laconic (젖산 센서), UAS-GCaMP6f (칼슘 센서), UAS-AT1.03NL (ATP 센서) 및 UAS-Chk RNAi GD1829. 센서 또는 RNAi를 발현하는 모든 계통은 w¹¹¹⁸ 유전적 배경에 있습니다.
3. 동기화된 세 번째 인스타 방랑 유충을 얻으려면 원하는 유전적 교배의 파리 300마리(생후 3-5일, 수컷 100마리, 처녀 암컷 200마리)를 인산염 완충 식염수(PBS)에 1% 아가로스로 덮인 60mm 페트리 접시가 들어 있는 알을 낳는 챔버에 넣습....

결과

최대 1시간 동안 이 절차를 통해 모노카르복실레이트 및 포도당 센서의 형광에서 세포 내 변화를 쉽게 측정할 수 있습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 신경교세포와 운동 뉴런 모두의 Laconic 센서는 펄스 시작 시 비슷한 속도로 1mM 젖산에 반응하지만, 운동 뉴런은 앞서 설명한 바와 같이 5분 펄스 동안 기준선보다 더 높은 증가에 도달합니다¹⁷. 이 젖산 농도는 세 번째 유충의 혈림프에서 발견되는 수준과 비슷하기 때문에 선택되었습니다. 유사하게, VNC 발현 포도당 센서가 5mM 포도당(우리^{및 다른 사람들에} 의해 혈림프에서 측정된 값과 유사한 값)에 노출되었을 때, 센서의 신호는 신경교세포와 뉴런에서 유사한 속도로 증가했다. 그러나 포도당 맥박이 뛰는 동안에는 신경교세포보다 뉴런의 신호가 더 많이 증가합니다. 이는 유사한 FRET 센서-발현 제제(¹⁶

토론

뇌 대사 연구를 위한 초파리 모델의 사용은 비교적 새로운 것으로²⁶ 포유류 대사와 예상보다 더 많은 특성을 공유하는 것으로 나타났으며, 이는 주로 1차 뉴런 배양 또는 뇌 절편에서 시험관 내에서 연구되었습니다. 초파리 는 유전 도구와 유전적으로 인코딩된 센서의 배터리 덕분에 생체 내 실험에 탁월하며, 이를 통해 연구자들은 유도된 활동 또는 감각 자극에 대한 반응으로 인한 대사 변화를 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 FRET 현미경을 기반으로 유전적으로 인코딩된 형광 대사 센서를 사용하여 휴식 및 활성 뉴런의 대사 변화에 대한 타임랩스 비디오를 만들 수 있는 생체 외 제제에서 초파리 VNC 신경교세포 및 뉴런에서 모노카르복실레이트 및 포도당 수송을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 방출 분할 시스템이 장착된 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로 스	시그마	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD 카메라 ORCA-R2	하마마츠
셀 R 소프트웨어	올림푸스
	블루밍턴 초파리 재고 센터	7011	팻 바디 드라이버
Dumont # 5 집게	파인 사이언스 도구	11252-30
DV2 방출 분할 시스템	광량	-
유리 커버 슬립 (직경 25mm)	Marienfeld	111650
독일 포도	시그마	G8270
GraphPad 프리즘	GraphPad 소프트웨어	버전 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ 소프트웨어	National Institues of Health	버전 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 침수 목표		Olympus-Methylparaben
	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	블루밍턴 초파리 스톡 센터		모터 뉴런 드라이버
픽로톡신	시그마	P1675S	CAUTION-Fatal if swilly
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
소듐 락테이	시그마	71718
소듐 피루브산	시그마	P2256
회전 디스크 형광 현미경 BX61WI	올림푸스	-
설탕	시그마	S0389
트레할로스	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	교토 초파리 재고 센터	117012	ATP 센서
UAS-Chk RNAi GD1829	비엔나 초파리 리소스 센터	v37139	Chk RNAi 라인
UAS-FLII12Pglu700md6	블루밍턴 드로소필라 재고 센터	93452	포도당 센서
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	칼슘 센서
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	젖산 센서
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat-CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 침수 대물	Olympus	-

CG-GAL4 당 트 렌즈