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rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

DOI:

10.3791/65848

⸱

October 6th, 2023

 ,  ,  , 
1Singapore National Eye Centre, Singapore Eye Research Institute, 2Centre for Vision Research, Duke-NUS Medical School, 3Ophthalmology and Visual Sciences Academic Clinical Program, DUKE-NUS Medical School, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

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인간 만능 줄기세포를 이용한 광수용체 세포의 재생은 진행된 단계의 유전성 및 노화 망막 질환 치료에 유망한 치료법입니다. 우리는 인간 재조합 망막 특이적 라미닌 동형 매트릭스가 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 광수용체 전구세포로의 분화를 지원할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 이들 세포의 망막하 주사는 rd10 설치류 및 토끼 모델에서도 부분적인 회복을 보여주었다. 망막하 주사는 표적 공간과의 근접성으로 인해 눈의 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE)층에 제약 화합물을 전달하는 데 사용되는 확립된 방법으로 알려져 있습니다. 또한 망막 질환을 치료하기 위해 아데노 관련 바이러스 벡터를 망막 하 공간으로 전달하는 데 사용되었습니다. 쥐 모델에서 제약 화합물 및 세포의 망막하 전달은 쥐 안구 크기의 제약으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜은 유전성 망막염 색소성 돌연변이, rd10 마우스에서 주입을 위한 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조와 이들 세포의 망막하 전달 기술에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이 접근법은 표적 부위, 특히 광수용체 변성으로 이어지는 질병이 발생하는 망막의 외부 핵층에 대한 세포 치료를 가능하게 합니다.

Introduction

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유전성 망막 질환과 노화 관련 황반 변성은 광수용체 세포 손실과 결국 실명으로 이어집니다. 망막 광수용체(retinal photoreceptor)는 광전달(즉, 빛을 신경 신호로 변환)을 담당하는 특수 세포로 구성된 망막의 바깥쪽 분절 층입니다. 간상체와 원추세포 광수용체 세포는 망막 색소층(RPE)에 인접해 있습니다1. 세포 손실을 보상하기 위한 광수용체 세포 대체 요법은 새롭게 발전하고 있는 치료 접근법입니다. 손상된 광수용체 세포를 복원하기 위해 배아 줄기 세포(ESC)2,3,4, 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 RPE 세포 및 망막 전구 세포(RPC)4,5,6,7,8을 사용했습니다. 망막과 RPE 사이의 제한된 공간인 망막하 공간은 손상된 광수용체 세포, RPE 및 Mueller 세포....

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Protocol

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생체 내 실험은 SingHealth의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 지침과 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 새끼들은 사이클로스포린(260g/L)이 함유된 식수를 먹여 P17(이식 전)에서 P30(이식 후)까지 면역 억제되었습니다.

1. 동결 보존 후 Day 32 hESC 유래 광수용체 전구체의 제조

  1. 37°C 수조에서 미리 데워진 광수용체 분화 배지(PRDM).
  2. 액체 질소에서 32일 hESC 유래 광수용체 전구 세포를 포함하는 냉동 수소를 회수합니다. 드라이 아이스에 보관하십시오.
  3. 37°C의 수조에서 3-5분 동안 냉동을 해동합니다. 1mL의 PRDM에 32개의 세포를 재현탁시키고 130 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다.
  4. 상층액을 제거하고 PRDM 1mL에 세포를 재현탁시킵니다.
  5. 세포 계수를 위해 혼합물 10μL를 제거합니다. 제조업체의 지침에 따라 0.2% 트리판 블루를 사용하여....

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Results

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10μL 유리 주사기는 제조업체의 지침(그림 1)에 따라 조립되었으며, 셀 현탁액/배지를 전달하는 데 사용된 뭉툭한 바늘은 그림 1B에 나와 있습니다. 망막하 주사에 대한 다양한 접근법이 그림 2에 나와 있습니다. 이 프로토콜에서 pars plana 접근 방식을 설명합니다(그림 2C). 유리 주사기에 장착된 뭉툭한 바늘은 경화술 상처를 통해 삽입되어 전 세계의 망막 하 공간에 접근했습니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 주사 바늘의 궤적, 망막을 통한 침투 및 세포의 전달은 주입을 수행할 때 현미경 아래에서 직접 모니터링되었습니다. 세포/배지의 성공적인 전달은 주입 부위의 블레브를 관찰하여 확인되었습니다(그림 3B.......

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Discussion

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망막하 주사는 RPE 및 망막 질환 23,25,26,27,28,31,40을 치료하기 위한 세포 현탁 이식에 사용되어 왔다. 이 접근법은 세포 이식 및 유전자 치료 접근법뿐만 아니라 망막 질환에 대한 새로운 치료 화합물을 평가하는 설치류 연구에서도 매우 중요합니다. 현재 망막하 공간으로 세포 또는 AAV를 전달하기 위해 세 가지 주요 경로, 즉 각막 횡단 경로, 경막 경로 및 pars plana 경로가 사용되고 있습니다.

경각막 접근법에서 주사 바늘은 각막, 동공, 마지.......

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Disclosures

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Hwee Goon Tay는 Alder Therapeutics AB의 공동 설립자입니다. 다른 저자는 상충되는 이해관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

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동결 보존 후 32 hESC 유래 광수용체 전구체를 준비할 수 있도록 기술적 지원을 제공해 주신 Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee 및 Yingying Chung에게 감사드립니다. 이 연구는 H.G.T.에 대한 National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award(NMRC/OFYIRG/0042/2017) 및 National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant(CRP24-2020-0083)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.3% 토브라마이신노바티스NDC   0078-0813-01토브렉스(3.5g)
0.3% 토브라마이신 및 0.1% 덱사메타손노바티스NDC 0078-0876-01토브라덱스(3.5g)
0.5% 프로파라카인 염산염알콘NDC 0998-0016-150.5% 알카인(15mL)
1mL 투베르쿨린 주사기투레모SS01T2713
1% 트로피카미드알콘NDC 0998-0355-151% 마이드리아실(15mL)
2.5% 페닐에프린 염산염AlconNDC 0998-0342-052.5% 마이드프린(5mL)
24웰 조직 배양 플레이트Costar3526
30G 일회용 바늘Becton Dickinson(BD)305128
33G, 20mm 길이의 무딘 바늘Hamilton7803-05
자동 세포 계수기NanoEnTek모델: 이브
비타민 A 없는 B27Life Technologies125870012%36
BuprenorphineCevaVetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7SigmaC07425 µ M36
CyclosporineNovartis260g/L 음용수 32
일 hESC 유래 광수용체 전구 세포DUKE-NUS 의과 대학인간 배아 줄기 세포를 32일 동안 분화합니다. 참조 36의 프로토콜을 참조하십시오.
거즈 위너 산업 Co., Ltd.1SNW475-4
글래스고 최소 필수 매체Gibco11710– 035
hESC 세포주 H1WiCell Research InstituteWA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02-5010 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)Prospec-Tany TechnogeneCYT-27210 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)Ceva Santé AnimaleKETALAB03
LN-521BiolaminaLN521-021 &마이크로; g36
mFreSRSTEMCELL Technologies5854
마이크로리터 유리 주사기(10mL)Hamilton7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)SelleckchemS221510 µ M36
N-2 보충제Life TechnologiesA13707-011%36
Non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140– 0501x36
NutriStem XF 미디어Satorius05-100-1A
iOCT 기능 내장
PRDM(광수용체 분화 매체, 50ml)DUKE-NUS 의과대학미디어 구성 참조36. 기초 매체, 10 &마이크로; M DAPT, 10ng/mL BDNF, 10ng/mL CNTF, 0.5 &마이크로; M 레티노산, 2% B27 및 1% N2. 기초 배지 : 1x GMEM, 1 mM 나트륨 피루브산, 0.1 mM B- 메르 캅토 에탄올, 1x 비 필수 아미노산 (NEAA).
PyruvateGibco11360– 0701 mM36
Rd10 생쥐잭슨 연구소B6. CXB1-Pde6brd10/J 마우스성별: 남성/여성, 연령: P20 (주사), 무게: 3-6 g 
레티노산Tocris Bioscience0695/500.5 µ M36
라운드 커버 슬립 (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
SB431542SigmaS43170.5 µ M36
Vidisic Gel (10 g)Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)Troy LaboratoriesLI0605
β-mercaptoethanolLife Technologies21985– 0230.1 mM36

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  2. Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15

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