우리는 성인 마우스의 6개 근육에서 다양한 길이와 유형의 효소로 해리된 섬유를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다: 그 중 3개는 이미 설명되었고(flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) 그 중 3개는 처음으로 성공적으로 해리되었습니다(extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).
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방법 논문
생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
쥐 근육의 효소 해리에 의해 얻어진 골격근 섬유는 생리학적 실험에 유용한 모델이다. 그러나 대부분의 논문은 굴곡근 골곡근(FDB)의 단섬유를 다루고 있는데, 이는 섬유종을 다루는 결과의 범위를 제한하고, 이용 가능한 생물학적 물질의 양을 제한하며, 세포 생리학적 현상과 다른 근육에서 얻은 이전의 생화학적 및 역학적 지식 사이의 명확한 연결을 방해합니다.
이 논문은 서로 다른 섬유 유형 프로파일과 길이를 가진 6개의 근육에서 온전한 섬유를 얻는 방법을 설명합니다. C57BL/6 성체 마우스를 사용하여 근육 해부 및 섬유 분리 프로토콜을 보여주고 Ca2+ 과도 연구 및 형태학적 특성 분석에 대한 섬유의 적합성을 입증합니다. 근육의 섬유 유형 구성도 제시됩니다. 해리되면 모든 근육이 온전하게 되어 24시간 이상 활발하게 수축하는 살아있는 섬유가 됩니다. FDB는 짧은(<1mm), 비골 사중사(PDQA) 및 장비골(PL)은 중간(1-3mm)을 제공하는 반면, 장신근(EDL), 장신근(EHL) 및 가자미근은 긴(3-6mm) 섬유를 방출합니다.
고속 염료 Mag-Fluo-4로 기록했을 때 PDQA, PL 및 EHL 섬유의 Ca2+ 과도 현상은 IIX 및 IIB 섬유에 해당하는 것으로 알려진 형태 유형 II(MT-II)를 연상시키는 빠르고 좁은 동역학을 보여주었습니다. 이것은 이 근육이 FDB(~80%) 및 가자미(~65%)에 비해 90% 이상의 유형 II 섬유를 가지고 있다는 사실과 일치합니다. FDB를 넘어 우리는 처음으로 1mm에서 6mm 사이의 길이 범위에 걸쳐 있는 섬유를 렌더링하는 여러 근육의 해리를 시연합니다. 이러한 섬유는 생존 가능하며 빠른 Ca2+ 과도 현상을 제공하므로 MT-II는 근육 공급원에 관계없이 IIX 및 IIB 고속 섬유로 일반화될 수 있습니다. 이러한 결과는 성숙한 골격근 연구를 위한 모델의 가용성을 높입니다.
서론
포유류의 성숙한 골격근은 다기능 조직입니다. 그것은 신진 대사를 심하게 조절하고 열 생산의 주요 원천이며 동적 특성은 호흡, 신체 부분의 움직임 또는 한 지점에서 다른 지점으로의 변위에 중요한 역할을 부여합니다 1,2,3. 골격근은 또한 근육병증, 이영양증 또는 근감소증과 같은 유전 및 만성 질환뿐만 아니라 심장 대사 질환과 같은 많은 비근육 만성 질환을 포함한 많은 질병의 병태생리학과 관련이 있습니다 3,4,5,6,7,8.
건강과 질병의 맥락에서 성숙한 골격근의 구조적 및 기능적 특성에 대한 생체 외 연구는 주로 전체 근육과 분리 섬유의 두 가지 실험 모델을 통해 가능했습니다. 20세기에 연....
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프로토콜
모든 절차는 콜롬비아 정부가 발행 한 1989 년 법률 84 및 1993 년 결의안 8430에 따라 안티오키아 대학교 (UdeA) (2016 년 6 월 21일 회의록 104 및 2021 년 4 월 15 일 005 분)의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았으며 동물 연구에 따라 수행 및보고되었습니다. 생체 내 실험 보고(ARRIVE) 지침41. 여기에 제시된 모든 결과는 건강한 생후 7-13주, 20-26g, C57BL/6 수컷 마우스에서 얻은 것입니다. 그림 1은 이 연구의 일반적인 설계와 절차의 순서를 보여줍니다. 모든 시약, 재료 및 장비 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 동물
- 온도 조절(21 ± 2°C) 및 빛:어둠(12:12 시간) 주기 조건에서 목재 유래 침구를 사용하여 아크릴, 투명, 직사각형 케이지당 최대 6마리의 마우스를 수용합니다.
- 동물들이 환경적 풍부함 없이 병원균이 없는 특정 동물 시설에서 먹이와 수돗물을 자유롭게 이용할 수 있도록 합니다.
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결과
경련 중 Sarcoplasmic Ca2+ 농도
해리된 섬유 세트에서 생리학적 실험의 타당성을 입증하고 여기-수축 결합(ECC) 및 섬유 유형에 대한 이전 결과를 확장하기 위해 모든 근육의 섬유에서 Ca2+ 과도 현상을 획득했습니다. 먼저, FDB(n=5) 및 EDL(n=7)은 형태형 II(MT-II)로 알려진Ca2+ 동역학을 나타냈다. 이들은 RT가 ~ 1ms 동안 지속되는 빠르고 뾰족한 신호입니다. 붕괴 단계는 첫 번째 성분 (A1)이 전체 진폭의 30 %보다 큰 이중 지수 함수를 장착 할 수 있으며 피크 [Ca2 +]는 15에서 30 μM사이입니다 33,47 (그림 3B). 이.......
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토론
성숙한 골격근 생물학을 연구하는 데 사용할 수 있는 모델을 보완하기 위해 여기서는 단섬유, 중섬유, 장섬유를 가진 다양한 쥐 근육의 성공적인 효소 해리를 보여줍니다. 이 섬유는 골격근에서 Ca2+ 과도 현상의 MT-II 동역학의 일반화 가능성을 입증할 수 있습니다. 또한, 온전한 전체 근육의 섬유 유형을 분류했습니다. FDB가 생리학적 실험에 가장 많이 사용되는 근육이라는 점을 감안할 때, 해리 후 세포 현탁액에 존재하는 섬유의 유형을 평가했습니다.
근육 생물학 연구를 위한 짧고, 중간적이고, 긴 온전한 섬유의 배터리
해부 기술, 효소 처리 기간, 사용된 효소 유형 및 분쇄 절차는 온전한 효소 해리 섬유를 얻기 위한 프로토콜 내에서 중요한 단계입니다. 불필요한 스트레칭을 피하면서 저산소증 상태를 줄이는 시간을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 절개를 해야 합니다. 후자의 점은 특히 가자미-가자미 복합체를 끌어올려 제거해서는 안 되.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자들은 동물과 사진에 도움을 준 UdeA의 Robinson Ramírez 교수와 기술 지원을 해준 Carolina Palacios에게 감사를 표합니다. Kaika의 Johan Pineda는 컬러 및 형광 카메라를 설치하는 데 도움을 주었습니다. 퀸즐랜드 대학교(University of Queensland)의 슈위안 응오(Shyuan Ngo)가 친절하게 원고를 교정해 주었습니다. 이 연구는 CODI-UdeA(2021년 2월 22일부터 2020-34909, 2022년 3월 31일부터 2021-40170, SIU) 및 콜롬비아 메데인에 있는 Planning Office-UdeA(E01708-K 및 ES03180101)의 자금 지원을 받았습니다. 자금 제공자는 데이터 수집 및 분석, 원고 작성 또는 제출에 참여하지 않았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| Absolute 에탄올 | Sigma Aldrich | 32221 | |
| 아세톤 | Merck | 179124 | |
| 아크릴아미드 | Gibco BRL | 15512-015 | |
| 과황산암모늄 | Panreac | 141138.1610 | |
| 항미오신 I 항체 | Sigma Aldrich | M4276 | 1차 항체 |
| 항미오신 II 항체 | 시그마 알드리치 | M8421 | 1차 항체 |
| 항미오신 IIA 항체 | 미국형 배양 컬렉션 | SC-71 | 1차 항체. HB-277 하이브리도마에서 파생 |
| 안티 미오신 IIB 항체 | 개발 연구 하이브리도마 은행 | BF-F3-c | 1차 항체 |
| 비스-아크릴아미드 | AMRESCO | 0172 | |
| 소 혈청 알부민 | Thermo Scientific | B14 | |
| Bradford 시약 | Merck | 1.10306.0500 | |
| 브로모페놀 블루 | Carlo Erba | 428658 | |
| 탄산칼슘 | Merck | 102066 | |
| 이염화칼슘(CaCl2) | Merck | 2389 | |
| 클로로포름 | 시그마 알드리치 | 319988 | |
| 콜라겐 분해 효소 유형 2 | Worthington | CLS-2/LS004176 | |
| Consul-Mount | Thermo Scientific | 9990440 | |
| Coomassie 브릴리언트 블루 R 250 | Merck | 112553 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AMRESCO | 0281 | |
| Edetic acid (EDTA | AMRESCO | 0322 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| Glycerol | Panreac | ||
| 글리신 | Panreac | 151340.1067 | |
| 염소 혈청 | 시그마 Aldrich | G9023 | |
| Hematoxylin | Thermo Scientific | 6765015 | |
| HEPES | AMRESCO | 0511 | |
| Hoechst 33258 | 시그마 Aldrich | 861405 | |
| Imidazole | AMRESCO | M136 | |
| 이소펜탄 | 시그마 Aldrich | M32631 | |
| 라미닌 | 시그마 Aldrich | L2020 | |
| Mag-Fluo-4, AM | Invitrogen | M14206 | DMSO에서만 준비됩니다. 플루론산은 필요하지 않으며 섬유 변질을 방지하기 위해 사용해서는 안 됩니다. |
| Mercaptoethanol | Applichem | A11080100 | |
| Methanol | Protokimica MP10043 | ||
| Mice | Multiple | 이 원고에는 C57BL/6 마우스만 사용했습니다. 그러나 일부 예비 결과는 프로토콜이 동일한 연령과 체중의 스위스 웹스터 마우스에 잘 작동하는 것으로 나타났습니다. | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | |
| N,N,N',N'-테트라메틸에탄-1,2-디아민(TEMED) | Promega | V3161 | |
| N-벤질-p-톨루엔 설폰아미드(BTS) | Tocris | 1870 | |
| 최적 절단 화합물(OCT) | Thermo Scientific | 6769006 | |
| 2차 항체 | Thermo Scientific | A-11001 | 염소 항-마우스 IgG (H+L) 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488 |
| 소듐 도데실 설페이트 | Panreac | ||
| 트리스 0.5 M, pH 6.8 | AMRESCO | J832 | |
| Tris(Hydroxymethyl)aminomethane | AMRESCO | M151 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | M143 | |
| Materials | |||
| Dissection chamber | 맞춤형 | ||
| 충전 슬라이드 | Erie Scientific | 5951PLUS | |
| 실험용 목욕 챔버 | Warner Instruments | RC-27NE2 | 필드 자극 기능이 있는 좁은 목욕 챔버, 가열된 플랫폼에 앙상블 PH-6 |
| 미세 집게 | 세계 정밀 기기 | 500338, 500230 | |
| 미세 가위 | 세계 정밀 기기 | Vannas 가위 501778 | |
| 유리 파스퇴르 피펫 | 여러 | 불 광택 팁 | |
| 뚜껑이 있는 유리병 | 여러 개 | 2-3mL volumen, | |
| 작동 가위 | World Precision Instruments | 501223-G | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Thermo Scientific | SL 8R | |
| 컨포칼 현미경 | Olympus | FV1000 | |
| 저온 유지 장치, | Leica | CM1850 | |
| 디지털 카메라 | Zeiss | Erc 5s 및 Axio | 305 Axio 305는 해부 중 사진을 촬영하는 데 사용되었으며, Axio Observer A1 현미경에 결합된 Erc 5s 또는 Axio 208은 분리된 섬유 및 면역형광 분석의 이미지를 촬영하는 데 사용되었습니다 |
| Digitizer | Molecular Devices | 1550A Digidata | |
| 전기영동 챔버 | Bio Rad | 형광에 결합된 Mini-Protean IV | |
| 도립 현미경 | Zeiss | Axio Observer A1 | 형광을 위한 적절한 광원, 필터 및 대물렌즈에 결합된 |
| 광전자 증배관 | Horiba | R928 튜브, Hamamatsu, D104 광도계, Horiba | 형광 현미경의 측면 포트에 결합 |
| Stereoscope Zeiss | Stemi 508 | ||
| 자극기 | 잔디 악기 | S6 | |
| 수조 | Memmert | WNE-22 | |
| Xilol | Sigma Aldrich | 808691 | |
| Software | |||
| 전기 영동 분석을위한 무료 소프트웨어 | 켄터키 대학교 | GelBandFitter v1.7 | |
| http://www.gelbandfitter.org 이미지 분석 및 형태 측정을위한 무료 소프트웨어 | 국립 보건원 | ImageJ v1.54 | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
| Ca2+ 신호 수집 및 분석을 위한 라이선스 소프트웨어 | Molecular Devices | pCLAMP v10.05 | https://www.moleculardevices.com |
| 통계 분석 및 그래프 작성을 위한 라이선스 소프트웨어 | OriginLab OriginPro 2019 | https://www.originlab.com/ |
참고문헌
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
- Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
- G....
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재인쇄 및 허가
