이 프로토콜은 중뇌동맥의 내강 내 폐색을 통한 마우스의 일시적인 국소 대뇌 허혈 모델을 설명합니다. 또한 자기 공명 영상 및 행동 테스트를 사용하여 결과 평가의 예를 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
뇌졸중은 전 세계적으로 사망 또는 만성 장애의 주요 원인입니다. 그럼에도 불구하고 기존의 최적 치료법은 허혈성 뇌졸중의 급성기 동안 재관류 요법으로 제한되어 있습니다. 뇌졸중 생리병리학에 대한 통찰력을 얻고 혁신적인 치료법을 개발하기 위해서는 뇌졸중의 생체 내 설치류 모델이 근본적인 역할을 합니다. 유전자 변형 동물의 가용성은 특히 실험용 뇌졸중 모델로 마우스의 사용을 촉진했습니다.
뇌졸중 환자에서 중뇌동맥(MCA)의 폐색은 흔한 현상입니다. 결과적으로, 가장 널리 사용되는 실험 모델은 두개골 절제술이 필요하지 않은 최소 침습 기술인 MCA의 내강 내 폐색과 관련이 있습니다. 이 절차에는 외부 경동맥(ECA)을 통해 모노필라멘트를 삽입하고 MCA의 분기점에 도달할 때까지 내부 경동맥(ICA)을 통해 전진시키는 작업이 포함됩니다. 45분 동맥 폐색 후 모노필라멘트를 제거하여 재관류를 허용합니다. 이 과정에서 뇌 혈류를 모니터링하여 폐색 중 감소와 재관류 시 후속 회복을 확인합니다. 신경 및 조직 결과는 행동 검사와 자기 공명 영상(MRI) 연구를 사용하여 평가됩니다.
서론
WHO에 따르면 뇌졸중은 매년 전 세계적으로 약 1,500만 명에게 영향을 미치는 치명적인 질병입니다. 환자의 약 3분의 1은 이 질환에 걸리고, 또 다른 3분의 1은 영구적인 장애를 경험합니다. 뇌졸중은 신경 및 말초 면역 세포, 혈관 조직 및 전신 반응과 같은 다양한 세포 유형을 포함하는 복잡한 병리학입니다1. 시스템 수준에서 뇌졸중에 의해 유발되는 복잡한 반응 네트워크는 현재 체외 모델을 사용하여 복제할 수 없습니다. 따라서 실험 동물 모델은 질병의 메커니즘을 탐구하고 새로운 치료법을 개발 및 테스트하는 데 필수적입니다. 현재 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA)를 이용한 혈전용해술 또는 혈관내 혈전절제술을 통한 조기 조직 재관류가 유일하게 승인된 중재이다1.
중뇌동맥(MCA)의 폐색은 뇌졸중 환자에서 빈번하게 발생합니다. 결과적으로, 일시적인 MCA 폐색(tMCAo)의 설치류 모델은 처음에 쥐 2,3,4에서 개발되었습니다. 오늘날 유전자 변형 마우스는 실험용 뇌졸중 모델에서 가장 일반적으로 사용되는 동물입니다. 이 연구에서는 생쥐에서 내강 내 tMCAo의 최소 침습 모델을 설명합니다. 이 접근법은 두개골 절제술 없이 목 수준의 경동맥을 통해 수행됩니다.
교합 기간의 지속 시간은 허혈성 병변의 정도를 결정하는 중요한 요소입니다. 10분의 짧은 교합도 명백한 경색 없이 선택적 신경세포 사멸을 유발할 수 있는 반면, 일반적으로 30분에서 60분 동안 지속되는 긴 교합은 어느 정도의 뇌경색을 유발합니다. 대뇌피질에 혈액을 공급하고 측부를 가지고 있는 MCA의 근위부 및 원위부 분지와는 달리, 선조체에 혈액을 공급하는 렌즈-선조체 동맥에는 측부가 없다5. 그 결과, tMCAo 후 피질보다 선조체의 혈류량이 더 크게 감소합니다. 따라서 30분 이하의 교합은 일반적으로 선조체에 영향을 미치지만 피질에는 영향을 미치지 않는 반면, 45분 이후의 더 긴 교합은 종종 선조체와 배외측 피질을 포함한 전체 MCA 영역에 허혈성 병변을 생성합니다.
생쥐의 건강을 보장하기 위해 시술 전에 진통제를 투여하고 수술 중에는 마취제를 사용합니다. 그럼에도 불구하고, 마취는 잠재적으로 마우스의 생리학에 인위적인 변화를 일으킬 수 있으며, 일부 결과 측정에 영향을 미칠 수 있다6. 숙련된 직원이 수행할 때 외과적 개입은 MCAo를 유도하는 데 일반적으로 약 15분 동안 지속됩니다. 그 후, 마취 중인 총 시간은 교합 기간에 따라 다릅니다. 마취를 최소화하는 것이 중요한 실험의 경우, 절차의 대체 단계는 교합 기간 동안 마취를 중단하고 MCA를 폐색하는 필라멘트를 삽입하고 빼는 수술 단계로만 제한하는 것입니다. 이 접근법은 마취 기간을 줄이고 실험 모델 7,8에 대한 잠재적인 인공물 효과를 최소화합니다. 따라서, 일시적인 국소 허혈을 유도하는 방법은 두 가지 변형을 갖는 MCA의 내강 내 폐색에 의해 제시된다: 전체 교합 기간 동안 마우스를 마취하거나 이 기간 동안 마우스가 깨어 있는 상태에서. 두 경우 모두, 가짜 수술은 허혈성 마우스에 수행된 중재와 병행하여 수행되어야 합니다. 또한 결과 평가에 대한 데이터는 재관류 후 다양한 시점에서 행동 테스트 및 MRI로 측정된 대로 제공됩니다. 마지막으로, 실험 절차를 구현할 때 고려해야 할 주요 요소에 대해 설명합니다.
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프로토콜
동물 작업은 카탈로니아 및 스페인 법률(Real Decreto 53/2013)과 유럽 지침에 따라 바르셀로나 대학의 윤리 위원회(Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA)와 카탈루냐 총독부의 현지 규제 기관의 승인을 받아 수행되었습니다. 연구는 ARRIVE 지침에 따라 보고됩니다. 이 절차는 연령 제한 없이 생후 8주부터 성인 마우스에서 수행되도록 설계되었습니다. 생후 10-12주의 C57BL/6 마우스에서 개발된 수술 절차의 예가 여기에 제공된다. 마우스 변형에 따른 해부학적 차이를 고려해야 합니다.
1. 동물 준비
- 수술을 시작하기 전에 필요한 모든 재료와 도구를 모으고 소독하십시오. 필요한 모든 수술 재료( 재료 표에 나열됨)로 수술대를 설정합니다.
- 산소와 아산화질소(30%/70%)의 혼합물에서 이소플루란 흡입을 사용하여 동물을 마취합니다.
- 진통을 제공하고 통증과 불편함을 완화하기 위해 0.05mg/kg BW의 용량으로 부프레노르핀( 재료 표 참조)을 피하 투여합니다.
알림: 진통제는 필수이지만 다른 프로토콜이 허용됩니다. 통증 및 불편 징후는 MCAo 후 첫 며칠 동안에도 조절해야 합니다(4단계 참조). 필요한 경우 수정 솔루션을 적용하십시오. - 깊은 마취 상태(발 천자 및 안구 반사의 반사 상실)에 도달할 때까지 5% 이소플루란이 있는 마취 유도 상자( 재료 표 참조)에 동물을 넣습니다.
- 마우스를 수술대에 놓고 안면 마스크로 전달되는 이소플루란 수치를 1.5%로 낮춥니다. 시술 중 눈 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 바르십시오.
- 체온을 37 ± 0.5°C로 유지하고 가열 패드에 연결된 직장 프로브로 제어합니다( 재료 표 참조).
- 전기 면도기로 목과 머리의 복부 부분(종아리)을 면도합니다. 털 부스러기를 조심스럽게 제거하고 요오드 기반 소독제와 70% 알코올로 피부 부위를 원을 그리며 세 번 소독합니다.
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2. 레이저 도플러 유량계(LDF)를 이용한 뇌혈류(CBF) 평가
- 가위로 머리 피부, 시상 봉합사 방향, 귀에서 눈 사이 부위까지 절개합니다.
- 피부를 수축시키고 두개골 오른쪽의 골막을 제거합니다.
- 좌표(브레그마에서 측면 2.5mm)를 찾아 시아노아크릴레이트를 사용하여 도플러 홀더( 재료 표 참조)를 부착합니다. 접착제가 마르면 도플러 프로브를 연결하고 신호 판독값이 올바른지 확인합니다.
3. 일과성 중뇌동맥 폐색(tMCAo)
- 마우스를 앙와위 위치로 돌리고 의료용 테이프로 수술대에 고정합니다.
- 목의 정중선을 절개합니다. 견인기( 재료 표 참조)를 사용하여 피부와 타액선을 옆으로 당겨 경동맥 영역을 노출시킵니다.
- 총경동맥(CCA), ICA 및 ECA의 혈관 해부학적 구조와 이들에서 파생된 다양한 동맥(상악 및 설측, 상갑상선, 후두부 및 익상편)을 식별합니다(그림 1A).
- 인접 결합 조직에서 주요 동맥을 분리하여 처리할 수 있도록 합니다.
알림: 신경, 특히 CCA와 평행하게 달리는 미주 신경이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오. - 상악/설측 분기점에서 ECA 주위에 6-0 실크 봉합사( 재료 표 참조)를 감습니다. 순환을 영구적으로 차단하기 위해 매듭을 단단히 고정하십시오.
- 첫 번째 매듭과 CCA 분기 사이의 동일한 동맥 주위에 두 번째 봉합사를 통과시키고 이 매듭을 느슨하게 유지합니다.
- CCA 주위에 세 번째 실을 놓고 쉽게 풀 수 있는 슬립 매듭을 묶습니다.
알림: 이것은 혈관 클립으로도 수행할 수 있지만 스레드는 더 많은 움직임과 유연성을 허용합니다. 이 단계에서 LDF 신호에서 CBF의 첫 번째 감소를 관찰할 수 있습니다. - ICA의 혈액 순환을 방해하는 혈관 클립( 재료 표 참조)을 놓습니다.
- 단단한 매듭이 있는 부위에 가까운 ECA를 작게 절개합니다.
- 두꺼운 코팅이 동맥 내강에 완전히 들어갈 때까지 모노필라멘트를 삽입합니다.
- 두 번째 매듭을 조여 모노필라멘트를 동맥 내부에 고정하고 혈액에 의해 가해지는 압력이 모노필라멘트를 밖으로 밀어내는 것을 방지합니다(그림 1B).
- ICA에서 혈관 클립을 제거합니다.
- 첫 번째 매듭점 아래에서 ECA를 자르고 그루터기를 회전하여 ICA 방향으로 향하게 합니다(그림 1C).
- MCA가 분기되는 지점까지 ICA를 통해 모노필라멘트를 전진시킵니다.
알림: 폐색은 LDF 판독값의 갑작스러운 혈류 강하에 반영됩니다. CBF의 감소가 기저 값에서 70% 이상일 때 성공적인 교합으로 간주합니다. CBF 측정 시스템을 사용할 수 없는 경우 교합 지점은 전진 저항으로 확인할 수 있으며, 이는 성인 마우스에서 일반적으로 CCA의 분기점에서 약 11mm입니다.- 교합 기간 동안 마취가 계속되면 마우스를 모니터링하고 45분 동안 지속적으로 관찰하십시오.
- 교합 기간 동안 쥐가 깨어난 경우 목 피부를 여러 바늘로 봉합합니다. LDF 프로브를 분리하지 않고 마우스를 온도 조절 상자에 넣어 마취에서 회복할 수 있도록 합니다.
참고: 이 기간 동안 마우스가 자발적인 선회 행동을 보이는 것이 일반적이며, 이는 성공적인 교합을 나타냅니다. - 40분 후 1.4, 1.5 및 1.7에 표시된 것과 동일한 마취 및 소독 절차에 따라 마우스를 다시 마취합니다. 수술대 위에 다시 놓고 목에서 실밥을 제거합니다.
- 45분 동안 폐색한 후 모노필라멘트를 제자리에 고정하는 매듭을 풉니다. 필라멘트를 천천히 부드럽게 당기고 조직 재개통이 일어나는지 확인합니다.
- 필라멘트를 빼내고 매듭을 조여 출혈을 방지합니다.
- CCA 매듭을 풉니다. 동맥벽 손상이 없는지 확인하십시오.
- 견인기를 제거하고 근육, 땀샘 및 피부의 위치를 변경합니다. 피부를 봉합하고(6-0) 소독제를 바릅니다.
- 도플러 프로브를 분리하고 홀더를 분리합니다. 머리의 피부를 봉합하고 소독합니다.
- 마취에서 회복하는 기간 동안 온도를 유지하기 위해 히터가 제공된 케이지에 마우스를 두십시오. 마취에서 완전히 회복될 때까지 지속적으로 관찰하십시오. 회복 후 마우스는 케이지로 되돌릴 수 있습니다.
참고: 사회적 풍요로움이 있는 주택을 적극 권장합니다. 그러나 공격성을 방지하기 위해 물리적 분리 없이 동일한 케이지에서 수술된 마우스와 수술되지 않은 마우스를 혼합하지 마십시오.
4. 수술 후 관리
- 현지 규정에 따라 제정된 절차와 규정에 따라 동물을 주기적으로 감독하십시오. 수술 후 통증을 최소화하기 위해 적절한 일정에 따라 진통 치료를 제공합니다.
참고: 본 연구에서는 수술 후 6시간 및 24시간에 중재 초기와 동일한 진통제(부프레노르핀 0.05mg/kg BW)를 적용했습니다. - 감독 매개변수가 그렇게 나타낼 때 제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 안락사를 수행합니다.
- 매일 동물의 체중을 모니터링하십시오. 수술 후 처음 며칠 동안 동물에게 부드러운 음식을 제공하십시오. 또한 생쥐가 스스로 수분을 공급하지 않는 것이 관찰되면 수술 직후 식염수(200μL)를 피하 주사하여 수분을 공급하고 그 후 주기적으로 수분을 공급하십시오. 동물이 쉽게 접근할 수 있는 방식으로 음식과 물을 준비하십시오.
- 생체 내 연구가 완료되면 마우스를 마취하고 안락사시킨 다음 추가 조직 병리학적 분석을 위해 뇌 조직을 제거합니다(필요한 경우).
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결과
tMCAo 절차의 결과를 평가하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 생체 내 신경 영상 방법(MRI)과 행동 검사가 여기에 활용됩니다.
마우스는 뇌에 허혈성 병변을 발생시키며, 주로 선조체 및 배외측 피질과 같은 MCA 동측이 교합에 공급하는 영역에 영향을 미칩니다. 병변의 정도를 결정하기 위해 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 조직 염색, 조직학적 염색(헤마톡실린/에오신, 티오닌 아세테이트) 및 MRI와 같은 생체 내 신경 영상 방식을 포함한 여러 가지 방법이 있습니다. MRI는 비침습적 특성과 다른 연구에 동일한 조직을 사용할 수 있는 능력으로 인해 여기에서 선택되었으며, 각 마우스의 병변에 대한 포괄적인 평가를 제공합니다. 또한 MRI를 사용하면 동일한 동물에서 반복적인 측정이 가능하여 결과의 재현성을 높이고 연구에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.
이소플루란(유도 5%, 유...
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토론
내강 내 tMCAo 절차는 기초 연구에서 재관류와 함께 가장 일반적으로 사용되는 국소 뇌 허혈 모델입니다. 현재, 마우스는 유전자 변형 균주의 가용성으로 인해 선호되는 동물 모델입니다. 그러나 유전자 변형 쥐와 그 유전적 배경이 뇌 혈관화에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인정하는 것이 중요합니다. 서로 다른 동맥 영역 사이의 부수적 순환 및 문합체의 존재는 실험 절차의 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있다11.
이 절차를 수행할 때 몇 가지 중요한 사항을 고려해야 합니다. 부상은 MCA 영역 밖에서 발생할 수 있으며, 일반적으로 후방 통신 동맥의 폐색으로 인해 해마, 시상 또는 시상 하부와 같은 영역에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 소수의 쥐는 겉보기에 성공적인 수술 절차에도 불구하고 명백한 경색을 나타내지 않을 수 있습니다.
절차 중에 여러 변수를 모니터링해야 합니다. 뇌 병변의 발달은...
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 및 "European Regional Development Fund (ERDF)"가 자금을 지원하는 보조금 PID2020-113202RB-I00의 지원을 받았습니다. 유럽을 만드는 방법". NCC와 MAR은 MCIN/AEI/099481 501100011033/085737 및 "European Social Fund(ESF) Investing in your future"에서 자금을 지원하는 박사 전 펠로우십(각각 PRE2021-099481 및 PRE2018-13039)을 받았습니다. 기술 지원을 해주신 Francisca Ruiz-Jaén과 Leonardo Márquez-Kisinousky에게 감사드립니다. 우리는 Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS)의 MRI 영상 시설의 지원에 감사드립니다. 카탈루냐 총독의 카탈루냐 레세르카 센터(CERCA) 프로그램은 IDIBAPS를 지원합니다.
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