Method Article

Tissue Processing and Isolation of primary Fibroblasts from the Human Vagina(인간 질에서 일차 섬유아세포의 조직 처리 및 분리)

DOI:

10.3791/65864

⸱

November 22nd, 2024

 ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Division of Urogynecology, Massachusetts General Hospital, 2Massachusetts General Hospital/Vincent Center for Reproductive Biology/Harvard Medical School, 3Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Massachusetts General Hospital, Vincent Center for Reproductive Biology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 폐경 전 또는 폐경 후 인간 질 조직에서 일차 섬유아세포를 분리하는 신뢰할 수 있고 효과적인 기술을 보여줍니다. 질 섬유아세포 분리를 위한 기존 프로토콜은 노화 조직에서 세포 분리의 문제를 고려하지 않습니다. 질 조직은 골반 장기 탈출증 수술 후 여성으로부터 얻었다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

골반 장기 탈출증은 여성의 삶의 질에 심각한 영향을 미치는 질환입니다. 근육과 인대가 약해지고 골반 장기가 골반 아래쪽으로 떨어지면서 질이 부풀어 오를 때 발생합니다. 골반 장기 탈출증을 교정하기 위한 수술이 주요 치료법입니다. 최근에는 세포 수준에서 탈출증이 있는 환자의 조직 구성을 연구하는 것에 대한 관심이 높아지고 있습니다.

현재 세포 기반 요법에 대한 기증자 또는 환자 연령의 영향에 대해서는 거의 합의된 바가 없습니다. 질 섬유아세포 분리를 위해 현재 발표된 프로토콜은 폐경 전 조직에 집중하거나 기증자 조직의 나이에 대한 언급을 소홀히 합니다. 대부분의 기존 프로토콜은 동물 모델을 사용합니다. 인간 질 조직의 일관성은 대부분의 프로토콜에 사용되는 조직보다 밀도가 높습니다. 이 연구에서 인간의 질 조직은 주로 나이가 많은 기증자로부터 얻어졌는데, 이는 기존 프로토콜의 실패에 기여했을 가능성이 있습니다.

이 연구의 목적은 기증자의 연령과 폐경기 상태에 관계없이 인간 질 섬유아세포를 안정적으로 획득하기 위한 표준 프로토콜을 설명하는 것입니다. 결과는 골반 장기 탈출증 수술을 받은 9명의 개별 기증자의 조직을 사용하여 재현되었습니다. 6명의 환자는 폐경 후였으며 최고령 기증자는 78세였습니다. 조직 기증자의 평균 연령은 59세였다.

여기에서는 단일 기증자로부터 여러 질 생검의 효소 및 기계적 해리와 세포 현탁액 풀링의 조합을 사용하여 섬유아세포가 풍부한 단일 세포 현탁액을 생성하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 인간 질 원발성 섬유아세포의 신뢰할 수 있는 분리는 골반 장기 탈출증 및 마이크로바이옴-숙주 상호 작용 연구에 유용할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

과학 및 연구 분야에서의 성별 불균형은 지속적인 문제입니다. 주로 여성에게 영향을 미치는 장애에 대한 연구는 자금이 부족하다1. 골반 장기 탈출증은 여성의 성별과 밀접한 관련이 있는 질환입니다. 근육과 인대가 약해지고 골반 장기가 골반 아래쪽으로 떨어지면서 질이 부풀어 오를 때 발생한다2. 이 병태생리학의 맥락에서 세포 상호 작용에 대해서는 알려진 바가 거의 없으며, 조직 수준 요인이 외과적 중재의 성공에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없다3.

세포주보다는 일차 세포가 생리학적 관련성을 더 많이 제공하는 중개 임상 연구에 필수적인 것으로 널리 인식되고 있다4. 일차 세포는 관심 있는 신체 조직에서 직접 채취하며 보다 정확하게 생체 내 생리학을 모방할 수 있습니다. 인간 질에서 원발성 섬유아세포를 분리하는 것은 연령 및 폐경기 상태와 같은 주요 기증자 특성을 고려하여 골반 장기 탈출증의 생물학적 메커니즘 및 질병 모델링을 연구하는 데 유용할 수 있습니다.

골반 장기 탈출증은 일반적으로 노인이나 폐경 후에 발생합니다. 이 질환을 연구하는 데 있어 일차 섬유아세포 세포의 분리 및 증식은 세포 개체수 감소와 고령기증자의 클론생성 능력으로 인해 까다롭다5. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 질 조직의 해리를 위해 이전에 설명된 프로토콜을 사용해도 표준 1cm2 조직 생검에서 섬유아세포를 추출하지 못했습니다.

문헌 검토를 통해 우리는 유사한 연구가 murine6과 같은 동물 모델과 인간 모델 7,8의 두 그룹으로 세분화된다는 것을 발견했습니다. 마우스 프로토콜을 따를 때, 인간 질 조직의 조직 처리를 위해 가위를 사용하면 기계적 소화가 부적절했습니다. 쥐 조직 및 다른 조직 부위9를 이용한 프로토콜의 외삽은 성공하지 못했다.

인간의 질 샘플을 사용한 대부분의 논문은 골반 장기 탈출증이 있는 폐경 전 개인의 조직을 활용했다 7,10. 몇몇 논문에서 폐경 전과 폐경 후 모두의 샘플을 사용했다고 보고했지만11 나이가 많거나 폐경 후 기증자로부터 섬유아세포를 성공적으로 분리하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 충분히 자세히 설명하지 않았습니다. 폐경 후 조직에서 섬유아세포를 이용한 분리 및 질병 모델링은 골반 장기 탈출증의 세포 병태생리를 이해하는 데 필수적일 수 있는데, 이는 골반 장기 탈출증이 폐경 후 10년 동안 개인에서 가장 많이 발생하기 때문이다12.

우리는 기계적 및 효소적 해리의 조합을 사용하여 인간 질 조직에서 섬유아세포 농축 단세포 현탁액을 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 기사는 폐경 후 또는 노화하는 인간 질 섬유아세포를 획득하는 방법에 대한 신뢰할 수 있는 프로토콜에 대해 설명합니다. 비멘틴(vimentin), F-액틴(F-actin) 및 α-평활근 액틴(α-SMA)의 발현을 평가하기 위해 위상차 현미경 및 면역형광(IF)을 사용한 형태학적 검사를 통해 분리된 세포가 섬유아세포임을 확인했습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

질 조직은 골반 장기 탈출증 수술을 받은 여성으로부터 얻었다. 수술 후 채취한 질 조직은 폐기물로 간주되어 폐기되었습니다. 이 연구는 기관 지침에 따라 수행되었으며 매사추세츠 일반 브리검의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 환자로부터 질 조직 채취

  1. 병력을 청취하고 골반 검사 결과를 사용하여 골반 장기 탈출증 진단: 클리닉에서 골반 장기 탈출증 정량화(POP-Q) 측정값을 얻어 골반 장기 탈출증의 증거를 보여주었습니다.
  2. 다음 포함 기준을 사용하십시오: 18세 이상; 증상이 있는 골반 장기 탈출증의 병력; 골반 장기 탈출증의 외과적 교정을 위한 선택.
  3. 제외 사항: 임산부 및 조직 기증을 거부하는 환자.
  4. 골반 장기 탈출증 수술의 필수 단계로 과도한 질 조직을 다듬습니다. 이 질 상피는 전방 콜포라피(anterior colporrhaphy), 후부 콜포라피(posterior colporrhaphy) 및 콜포클레이시스(colpocleisisis) 수술 후 전체 두께로 절제됩니다.
  5. 조직을 생리식염수 또는 무혈청 DMEM/F12(Gibco) 배지와 함께 멸균 검체 채취 컵에 담아 실험실로 운반합니다. 얼음 위에 두십시오.

2. 조직 가공 및 소화

  1. 조직 준비
    1. 질 상피의 전체 두께를 둘러싸도록 조직을 측정하고 절단하여 약1cm2의 세그먼트를 만듭니다.
    2. 생검 크기 1cm2의 정확한 측정을 보장합니다.
      참고: 조직 생검 크기를 과대평가하면 조직 소화가 손상될 수 있습니다.
    3. 한 명의 기증자로부터 각각1cm2 크기의 2-3개의 추가 질 생검을 준비하고 생검을 따로 보관합니다.
  2. 기계적 소화
    1. 질 생검을 10cm 세포 배양 페트리 접시에 넣습니다. 피펫: 500-1,000μL의 무혈청 배지, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2.5μg/mL 암포테리신을 질 조직에 주입하여 조직이 건조해지는 것을 방지합니다.
    2. 양손에 두 개의 멸균 메스(11번 또는 15번)를 사용하여 질 조직을 작은 조각으로 다집니다.
    3. 칼날의 끝이 조직 표면과 수직이 되도록 합니다. 두 개의 메스를 사용하여 조직 표면에 균일하고 일정한 압력을 가합니다. 조직을 아주 작은 조각으로 자르기 위해 번갈아 당기는 동작을 수행합니다.
    4. 샘플이 1-2mm 조각으로 균일한 일관성이 될 때까지 두 개의 메스 기술을 사용하여 이 다진 기술을 반복합니다.
      참고: 1cm2 생검의 이 두 메스 기술을 사용한 기계적 소화는 완료하는 데 약 15-20분이 소요됩니다.
    5. 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2.5μg/mL 암포테리신 B가 보충된 무혈청 DMEM/F12 배지 2-3mL를 플레이트에 추가하여 다진 조직을 부유시킵니다. 조직 조각이 들어있는 용액을 피펫팅하여 덩어리를 분해합니다.
  3. 효소 분해
    1. 조직 조각이 포함된 용액을 15mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 질 조직이 다진 조직 배양 접시에 무혈청 DMEM/F12 배지를 추가하여 남아 있는 조직 조각을 수집합니다. 조직 조각이 포함된 용액을 원추형 튜브로 옮깁니다. 총 부피가 10mL가 될 때까지 무혈청 DMEM/F12 배지를 추가합니다.
    2. 리버라아제 5mg을 멸균수 1mL(5mg/mL)에 녹입니다. -20°C에서 최대 한 달 동안 또는 -80°C에서 6개월 동안 230μL 부분 표본에 보관하십시오.
    3. 230 μL의 Liborougha (스톡 13 U / mL)를 최종 농도 0.3 U / mL로 튜브에 추가합니다.
      참고: Liberase 활동은 배치마다 다를 수 있습니다. 사용하기 직전에 각 부분 표본을 수조를 사용하여 해동하십시오. 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오.
    4. 동일한 기증자의 추가 질 생검 2-3회에 대해 2.1-2.3단계를 반복합니다.
      참고: 단일 생검의 조직 조각이 포함된 각 용액을 별도의 원뿔형 튜브에 보관하십시오. 예를 들어, 4개의 튜브에서 4번의 질 생검을 실시합니다. 이는 원심분리 후 최적의 세포 펠릿화에 중요합니다.
    5. 샘플 믹서를 사용하여 37°C에서 3시간 동안 지속적이고 격렬한 교반으로 튜브를 배양합니다.
    6. 샘플 믹서를 CO2 인큐베이터에 넣습니다. 끊임없는 교반을 유지하십시오. (샘플 믹서 설정: 25초 동안 회전 동작 5rpm, 30초 동안 5° 역(틸트 회전), 2초 동안 진동(소용돌이) 동작 3°).
    7. 배양하는 동안 30분 간격으로 튜브를 소용돌이칩니다.
    8. 샘플을 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 버리십시오.
    9. 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2.5μg/mL 암포테리신 B를 사용하여 1-2mL의 DMEM/F12 매체에 펠릿을 재현탁시켜 리베라아제 효소를 희석합니다. 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 세게 피펫팅합니다.

3. 세포 배양

  1. 소화되지 않은 조직 조각의 제거
    1. 멸균된 50mL 원뿔형 용기 위에 100μm 세포 여과기를 놓습니다.
    2. 동일한 기증자의 여러 조직 생검에서 얻은 세포 현탁액을 함께 합산합니다.
    3. 조직/효소 현탁액을 걸러내고 5mL 주사기 플런저로 밀어 넣습니다. 나머지 조직 조각이 완전히 눌린 것처럼 보일 때까지 이 단계를 반복합니다.
      알림: 질 조직 조각에서 여과기를 통해 완전히 작용하지 않는 일부 점액이 있을 수 있습니다. 세포 여과기로 점액을 버립니다.
  2. 세포 배양 풀링(Cell culture pooling)
    1. 페트리 접시(60mm x 15mm)에 대한 여러 질 생검(동일한 기증자로부터)의 플레이트 풀링 세포 현탁액.
    2. 페트리 접시를 37°C의 CO2 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
    3. 위상차 현미경으로 비부착 세포의 존재를 관찰하고 확인합니다.
    4. 현미경의 초점이 플레이트 바닥에 있는지 확인하십시오.
      참고: 전경에 많은 면역 세포가 있을 수 있습니다. 더 적은 수의 섬유아세포가 플레이트 바닥에 부착됩니다.
    5. 적절한 세포 부착을 보장하기 위해 세포 배양 배지를 교체하기 전에 18-24시간 동안 기다립니다.
    6. 80%의 합류가 발생할 때까지 3일마다 배양 배지를 교체합니다. 세포가 80-90% 합류에 도달하면 더 큰 플라스크로 확장하거나 나중에 사용할 수 있도록 세포의 부분 표본을 동결합니다.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

골반 장기 탈출증 수술을 받은 10명의 독립적인 기증자로부터 질 조직을 수집했습니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 세포를 인간 질 조직으로부터 분리했습니다. 세포 집단은 특징적으로 길쭉하고 평평하며 방추형 모양을 가졌습니다. 다른 연구와 마찬가지로, 우리는 기증자의 나이가 증가함에 따라 섬유아세포의 세포 두배가 용량이 현저히 느려지고 클론생성 능력이 감소하는 것을 관찰했습니다. 이러한 차이는 고령자(75-78세)에서 분리한 섬유아세포와 젊은 개인(35-47세)에서 분리한 섬유아세포를 비교할 때 두드러졌습니다. 중년 기증자의 세포는 중간 프로필(56-61세)을 나타냈습니다. 세포 증식 속도는 초기에 알려진 것과 동일한 파종 밀도를 가진 위상차 현미경을 사용하여 직접 시각화하여 추정했습니다.

figure-results-1
그림 1: 프로토콜의 다이어그램 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1은 dissociation and isolation 프로토콜의 다이어그램 표현을 보여줍니다. 이러한 단계에 따라 이 프로토콜은 세포를 과배양할 수 있는 충분한 세포 수를 가진 기증자 10명 중 9명에서 1차 섬유아세포 분리의 90% 성공률을 보였습니다. 기증자의 평균 연령은 59세였다.

프로토콜(저자, 연도)원래 프로토콜의 기증자 조직기증자 수기증자 연령(년)얻어진 섬유아세포(Fibroblasts)형태학
Ruiz-Zapata 외, 2013인간의 질356-78아니요해당 없음
칸 외, 2016쥐의 귀와 꼬리248-65아니요해당 없음
Waise 외, 2019인체 조직356-75아니요해당 없음
나달루티 외, 2020인간의 포피165아니요해당 없음
전류인간의 질1035-79예스핀들 모양

표 1: 인간 질 섬유아세포의 성공적인 분리를 위한 프로토콜 비교. 기존의 다른 프로토콜을 우리의 프로토콜과 비교하고 형태 학적 결과로 입증되었습니다.

표 1 은 본 연구에서 질 섬유아세포 분리를 시도하기 위해 다른 프로토콜을 사용한 결과를 보여줍니다. 우리는 질 점막 및 고령 기증자로부터 원발성 섬유아세포를 분리하기 위한 표준 프로토콜을 개발했다5.

우리는 표 1에 나열된 프로토콜을 포함하여 몇 가지 확립된 프로토콜을 테스트했으며 연구에서 이러한 프로토콜을 사용하여 세포 분리에 성공하지 못하는 것을 관찰했습니다. 우리는 그들의 한계에 대해 다음과 같은 이유를 제안합니다.

Ruiz et al.3 이 발표한 프로토콜은 근막을 긁어내고 조직을 작은 조각으로 자르는 것을 포함합니다. 우리의 경험상 근막을 구별하기 어렵고 긁어내려고 시도하면 세포 수율이 크게 감소할 수 있습니다. 이 방법은 간단하지만 중요한 세부 정보가 부족하여 일반화 가능성이 제한됩니다. 또한, 이 프로토콜의 기계적 소화는 더 조밀한 경향이 있는 폐경 후 조직에 충분하지 않은 것으로 보입니다.

Khan et al.9 및 Waise et al.13 에 의해 발표 된 프로토콜은 메스 기술에 비해 상당한 다방향 전단력을 도입하지 않는 조직 분쇄를 위해 가위를 사용합니다. 우리의 경험에 따르면 가위 방법도 효과적으로 작동하지 않았습니다.

마지막으로, 이식 방법을 사용한 Nadalutti et al.14 프로토콜은 우리 손에 섬유아세포를 성공적으로 생성하지 못했습니다. 이 방법은 폐경 후 조직의 특성으로 인해 효과가 떨어질 수 있으며, 섬유아세포를 성공적으로 해리하기 위해 보다 적극적인 기계적 및 효소적 처리가 필요할 수 있습니다.

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그림 2: 0일째 부유 세포의 위상차 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2는 프로토콜을 사용하여 0일째에 중단된 세포를 보여줍니다.

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그림 3: 3회의 1cm2 조직 생검의 통합 세포 현탁액에서 100x 배율로 배양 14일째 질 원발 섬유아세포의 위상차 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 은 1cm² 크기의 조직 생검 3회의 풀링 셀 현탁액에서 100배 배율로 1차 섬유아세포를 보여줍니다.

섬유아세포 식별은 앞서 설명한 바와 같이 면역형광 기법에 의해 약간의 수정을 가하여 조사하였다. 원발성 질 세포의 세포 기원을 확인하기 위해 면역형광 염색을 통해 섬유아세포 기원의 특정 바이오마커를 사용했습니다. 세포는 폐경 전 및 폐경 후 조직 샘플에서 채취한 vimentin(그림 4), F-actin 및 α-SMA의 양성 염색을 기반으로 섬유아세포로 확인되었습니다(그림 5). 섬유아세포는 실험에 사용하기 위해 높은 생존율(>90%)로 증식하도록 배양되었습니다.

figure-results-4
그림 4: 질 섬유아세포의 비멘틴(vimentin)의 양성 염색. 분리된 폐경 전 및 폐경 후 조직의 일차 섬유아세포를 IF 분석하고 이미지를 200배 확대하여 촬영했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 질 섬유아세포의 F-actin 및 α-SMA의 양성 염색. IgG 대조군과 비교한 단백질 발현 결과. 이미지는 200x 배율로 수집되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이전의 많은 연구에서는 인간의 질에서 일차 섬유아세포를 분리하는 방법을 보고했습니다 3,7. 몇몇 연구에서는 골반 장기 탈출증이 있는 폐경 전 개인의 인간 질 조직을 사용했다. 몇몇 논문에서 폐경 전 및 폐경후 개인의 조직 사용을 보고했지만7,11 나이가 많거나 폐경 후 기증자로부터 섬유아세포를 성공적으로 분리하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 충분히 자세히 설명하지 않았습니다. 생식기 탈출증이 있는 폐경 후 여성의 질벽은 폐경 전 여성보다 더 두꺼우며, 이는 이 인구에서 고립의 어려움이 증가하는 원인일 수 있다13. 골반저 질환은 폐경 후 또는 그 이상의 연령대에서 가장 흔하기 때문에 폐경 후 기증자로부터 성공적으로 격리하는 것은 질병 모델링 및 조사에 필수적입니다.

우리는 35-78세의 기증자로부터 인간 질 섬유아세포를 성공적이고 일관되게 채취하고 배양하기 위한 프로토콜을 수립했습니다. 일차 질 세포의 세포 기원은 면역형광 염색을 통해 섬유아세포 기원의 바이오마커에 의해 확인되었습니다.

여기에 제시된 인간 질 섬유아세포 분리 절차는 일차 섬유아세포 세포의 분리 및 배양을 가능하게 합니다. 우리의 경험에 따르면, 일차 세포의 해리를 위해 동물9및 인간 3,14,16 조직에 대해 이전에 발표된 프로토콜을 사용한 경우, 이 연구에서 인간 질 샘플에서 섬유아세포를 추출하지 못했습니다14.

우리는 인간 질 조직에서 세포 해리가 발생하는 문제에 대한 두 가지 가능한 이유에 대한 가설을 세웠다: (1) 점막의 피부 두께는 고령 기증자에서 더 크고, 고령 기증자의 비점막 조직과 비교할 때 세포 해리를 더 어렵게 만든다13,17 (2) 섬유아세포의 밀도는 고령 개인에서 현저하게 감소할 수 있다17.

이러한 문제를 감안할 때 이 프로토콜에는 수정해서는 안 되는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 매우 엄격한 기계적 소화를 구현하는 것입니다. 여기에서는 두 개의 메스 기술을 사용합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 조직을 다지기 위해 가위로 대체하면 인간 질 조직에서 섬유아세포를 분리할 만큼 충분히 작은 조각이 생성되지 않습니다.

또 다른 중요한 단계는 세포 현탁액을 풀링하고 단일 기증자로부터 3-4개의 전체 두께 생검(1cm2)을 풀링하는 것입니다. 이것은 지속적인 배양을 위한 충분한 세포를 얻기 위해 필요합니다. 모든 경우에서1cm2 보다 훨씬 더 많은 조직을 채취했는데, 이는 과도한 질 상피가 골반 장기 탈출증 수술의 필수적인 부분으로 다듬어지기 때문입니다. 이 연구에서는 다양한 기증자 간의 세포 특성과 증식을 조사하고 구별하기 위해 동일한 기증자로부터 유래한 세포 현탁액만 통합했습니다.

당사의 프로토콜은 뚜렷한 장점이 있습니다: 기계적 및 효소적 분해는 폐경 후 조직의 수율을 향상시키지만, 폐경 전 샘플에 부정적인 영향을 미치지 않습니다.

우리는 프로토콜에 대한 몇 가지 제한 사항을 인정합니다. 질 탈출증 수술이 수행되지 않는 상황에서는 인간 질 조직에 접근하는 것이 어려울 수 있습니다. 여러 조직 생검 샘플의 세포 현탁액을 풀링해야 하는 필요성도 제한 사항이 될 수 있습니다.

결론적으로, 인간 질 섬유아세포를 획득하기 위한 이 프로토콜은 골반저 질환, 특히 폐경 후 개인에 대한 향후 연구에 유용한 도구가 될 뿐만 아니라 여성 건강 연구에 중요한 추가 사항이 될 것입니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

매사추세츠 종합병원(Massachusetts General Hospital)의 빈센트 생식생물학 센터(Vincent Center of Reproductive Biology)의 모든 구성원과 빈센트 메모리얼 병원 재단(VIncent Memorial Hospital Foundation)의 아낌없는 지원에 감사드립니다. 귀중한 제안과 실험실 장비를 빌려준 Bo Rueda 박사와 그의 연구실에 특별한 감사를 드립니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BBio TechneB23192
세포 여과기 (100 μ m)ThermoFisher Scientific22363549
원뿔형 원심분리기 튜브(15mL)Fisher Scientific 14-959-53A
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320033
Feather 일회용 메스 No. 15SocorexFB.15
Fetal Bovine SerumSigma AldrichNC1983075
High Clarity Conical Centrifuge Tubes (50 mL)Fisher Scientific 14-432-22
HulaMixer 샘플 믹서ThermoFisher Scientific15920D
인간 피브로넥틴 듀오셋 ELISAR& D 시스템DY1918-05
휴먼 프로 콜라겐 I 알파 1 듀오셋 ELISAR& D SystemsDY6220-05
Liberase Research GradeSigma Aldrich05 401 119 001
페니실린/스트렙토마이신(5000U/ml)ThermoFisher Scientific15070063
페트리 접시, 폴리스티렌(100 mm x 20 mm)Millipore SigmaP5606
혈청 피펫(10 mL)ThermoFischer Scientific170356N
멸균 주사기 (5 mL)Fischer Scientific14-955-458

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).">Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
  2. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).">MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
  3. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).">Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
  4. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).">Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  5. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).">Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
  6. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).">Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
  7. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).">Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
  8. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).">Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
  9. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).">Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
  10. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).">Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
  11. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).">Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
  12. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).">Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
  13. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).">Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
  14. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).">Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
  15. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).">Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
  16. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).">Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
  17. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).">Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).

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