이 프로토콜은 폐경 전 또는 폐경 후 인간 질 조직에서 일차 섬유아세포를 분리하는 신뢰할 수 있고 효과적인 기술을 보여줍니다. 질 섬유아세포 분리를 위한 기존 프로토콜은 노화 조직에서 세포 분리의 문제를 고려하지 않습니다. 질 조직은 골반 장기 탈출증 수술 후 여성으로부터 얻었다.
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방법 논문
Tissue Processing and Isolation of primary Fibroblasts from the Human Vagina(인간 질에서 일차 섬유아세포의 조직 처리 및 분리)
이 논문에서
요약
초록
골반 장기 탈출증은 여성의 삶의 질에 심각한 영향을 미치는 질환입니다. 근육과 인대가 약해지고 골반 장기가 골반 아래쪽으로 떨어지면서 질이 부풀어 오를 때 발생합니다. 골반 장기 탈출증을 교정하기 위한 수술이 주요 치료법입니다. 최근에는 세포 수준에서 탈출증이 있는 환자의 조직 구성을 연구하는 것에 대한 관심이 높아지고 있습니다.
현재 세포 기반 요법에 대한 기증자 또는 환자 연령의 영향에 대해서는 거의 합의된 바가 없습니다. 질 섬유아세포 분리를 위해 현재 발표된 프로토콜은 폐경 전 조직에 집중하거나 기증자 조직의 나이에 대한 언급을 소홀히 합니다. 대부분의 기존 프로토콜은 동물 모델을 사용합니다. 인간 질 조직의 일관성은 대부분의 프로토콜에 사용되는 조직보다 밀도가 높습니다. 이 연구에서 인간의 질 조직은 주로 나이가 많은 기증자로부터 얻어졌는데, 이는 기존 프로토콜의 실패에 기여했을 가능성이 있습니다.
이 연구의 목적은 기증자의 연령과 폐경기 상태에 관계없이 인간 질 섬유아세포를 안정적으로 획득하기 위한 표준 프로토콜을 설명하는 것입니다. 결과는 골반 장기 탈출증 수술을 받은 9명의 개별 기증자의 조직을 사용하여 재현되었습니다. 6명의 환자는 폐경 후였으며 최고령 기증자는 78세였습니다. 조직 기증자의 평균 연령은 59세였다.
여기에서는 단일 기증자로부터 여러 질 생검의 효소 및 기계적 해리와 세포 현탁액 풀링의 조합을 사용하여 섬유아세포가 풍부한 단일 세포 현탁액을 생성하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 인간 질 원발성 섬유아세포의 신뢰할 수 있는 분리는 골반 장기 탈출증 및 마이크로바이옴-숙주 상호 작용 연구에 유용할 수 있습니다.
서론
과학 및 연구 분야에서의 성별 불균형은 지속적인 문제입니다. 주로 여성에게 영향을 미치는 장애에 대한 연구는 자금이 부족하다1. 골반 장기 탈출증은 여성의 성별과 밀접한 관련이 있는 질환입니다. 근육과 인대가 약해지고 골반 장기가 골반 아래쪽으로 떨어지면서 질이 부풀어 오를 때 발생한다2. 이 병태생리학의 맥락에서 세포 상호 작용에 대해서는 알려진 바가 거의 없으며, 조직 수준 요인이 외과적 중재의 성공에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없다3.
세포주보다는 일차 세포가 생리학적 관련성을 더 많이 제공하는 중개 임상 연구에 필수적인 것으로 널리 인식되고 있다4. 일차 세포는 관심 있는 신체 조직에서 직접 채취하며 보다 정확하게 생체 내 생리학을 모방할 수 있습니다. 인간 질에서 원발성 섬유아세포를 분리하는 것은 연령 및 폐경기 상태와 같은 주요 기증자 특성을 고려하여 골반 장기 탈출증의 생물학적 메커니즘 및 질병 모델링을 연구하는 데 유용할 수 있습니다.
골반 장기 탈출증은 일반적으로 노인이나 폐경 후에 발생합니다. 이 질환을 연구하는 데 있어 일차 섬유아세포 세포의 분리 및 증식은 세포 개체수 감소와 고령기증자의 클론생성 능력으로 인해 까다롭다5. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 질 조직의 해리를 위해 이전에 설명된 프로토콜을 사용해도 표준 1cm2 조직 생검에서 섬유아세포를 추출하지 못했습니다.
문헌 검토를 통해 우리는 유사한 연구가 murine6과 같은 동물 모델과 인간 모델 7,8의 두 그룹으로 세분화된다는 것을 발견했습니다. 마우스 프로토콜을 따를 때, 인간 질 조직의 조직 처리를 위해 가위를 사용하면 기계적 소화가 부적절했습니다. 쥐 조직 및 다른 조직 부위9를 이용한 프로토콜의 외삽은 성공하지 못했다.
인간의 질 샘플을 사용한 대부분의 논문은 골반 장기 탈출증이 있는 폐경 전 개인의 조직을 활용했다 7,10. 몇몇 논문에서 폐경 전과 폐경 후 모두의 샘플을 사용했다고 보고했지만11 나이가 많거나 폐경 후 기증자로부터 섬유아세포를 성공적으로 분리하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 충분히 자세히 설명하지 않았습니다. 폐경 후 조직에서 섬유아세포를 이용한 분리 및 질병 모델링은 골반 장기 탈출증의 세포 병태생리를 이해하는 데 필수적일 수 있는데, 이는 골반 장기 탈출증이 폐경 후 10년 동안 개인에서 가장 많이 발생하기 때문이다12.
우리는 기계적 및 효소적 해리의 조합을 사용하여 인간 질 조직에서 섬유아세포 농축 단세포 현탁액을 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 기사는 폐경 후 또는 노화하는 인간 질 섬유아세포를 획득하는 방법에 대한 신뢰할 수 있는 프로토콜에 대해 설명합니다. 비멘틴(vimentin), F-액틴(F-actin) 및 α-평활근 액틴(α-SMA)의 발현을 평가하기 위해 위상차 현미경 및 면역형광(IF)을 사용한 형태학적 검사를 통해 분리된 세포가 섬유아세포임을 확인했습니다.
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프로토콜
질 조직은 골반 장기 탈출증 수술을 받은 여성으로부터 얻었다. 수술 후 채취한 질 조직은 폐기물로 간주되어 폐기되었습니다. 이 연구는 기관 지침에 따라 수행되었으며 매사추세츠 일반 브리검의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 환자로부터 질 조직 채취
- 병력을 청취하고 골반 검사 결과를 사용하여 골반 장기 탈출증 진단: 클리닉에서 골반 장기 탈출증 정량화(POP-Q) 측정값을 얻어 골반 장기 탈출증의 증거를 보여주었습니다.
- 다음 포함 기준을 사용하십시오: 18세 이상; 증상이 있는 골반 장기 탈출증의 병력; 골반 장기 탈출증의 외과적 교정을 위한 선택.
- 제외 사항: 임산부 및 조직 기증을 거부하는 환자.
- 골반 장기 탈출증 수술의 필수 단계로 과도한 질 조직을 다듬습니다. 이 질 상피는 전방 콜포라피(anterior colporrhaphy), 후부 콜포라피(posterior colporrhaphy) 및 콜포클레이시스(colpocleisisis) 수술 후 전체 두께로 절제됩니다.
- 조직을 생리식염수 또는 무혈청 DMEM/F12(Gibco) 배지와 함께 멸균 검체 채취 컵에 담아 실험실로 운반합니다. 얼음 위에 두십시오.
2. 조직 가공 및 소화
- 조직 준비
- 질 상피의 전체 두께를 둘러싸도록 조직을 측정하고 절단하여 약1cm2의 세그먼트를 만듭니다.
- 생검 크기 1cm2의 정확한 측정을 보장합니다.
참고: 조직 생검 크기를 과대평가하면 조직 소화가 손상될 수 있습니다. - 한 명의 기증자로부터 각각1cm2 크기의 2-3개의 추가 질 생검을 준비하고 생검을 따로 보관합니다.
- 기계적 소화
- 질 생검을 10cm 세포 배양 페트리 접시에 넣습니다. 피펫: 500-1,000μL의 무혈청 배지, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2.5μg/mL 암포테리신을 질 조직에 주입하여 조직이 건조해지는 것을 방지합니다.
- 양손에 두 개의 멸균 메스(11번 또는 15번)를 사용하여 질 조직을 작은 조각으로 다집니다.
- 칼날의 끝이 조직 표면과 수직이 되도록 합니다. 두 개의 메스를 사용하여 조직 표면에 균일하고 일정한 압력을 가합니다. 조직을 아주 작은 조각으로 자르기 위해 번갈아 당기는 동작을 수행합니다.
- 샘플이 1-2mm 조각으로 균일한 일관성이 될 때까지 두 개의 메스 기술을 사용하여 이 다진 기술을 반복합니다.
참고: 1cm2 생검의 이 두 메스 기술을 사용한 기계적 소화는 완료하는 데 약 15-20분이 소요됩니다. - 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2.5μg/mL 암포테리신 B가 보충된 무혈청 DMEM/F12 배지 2-3mL를 플레이트에 추가하여 다진 조직을 부유시킵니다. 조직 조각이 들어있는 용액을 피펫팅하여 덩어리를 분해합니다.
- 효소 분해
- 조직 조각이 포함된 용액을 15mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 질 조직이 다진 조직 배양 접시에 무혈청 DMEM/F12 배지를 추가하여 남아 있는 조직 조각을 수집합니다. 조직 조각이 포함된 용액을 원추형 튜브로 옮깁니다. 총 부피가 10mL가 될 때까지 무혈청 DMEM/F12 배지를 추가합니다.
- 리버라아제 5mg을 멸균수 1mL(5mg/mL)에 녹입니다. -20°C에서 최대 한 달 동안 또는 -80°C에서 6개월 동안 230μL 부분 표본에 보관하십시오.
- 230 μL의 Liborougha (스톡 13 U / mL)를 최종 농도 0.3 U / mL로 튜브에 추가합니다.
참고: Liberase 활동은 배치마다 다를 수 있습니다. 사용하기 직전에 각 부분 표본을 수조를 사용하여 해동하십시오. 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오. - 동일한 기증자의 추가 질 생검 2-3회에 대해 2.1-2.3단계를 반복합니다.
참고: 단일 생검의 조직 조각이 포함된 각 용액을 별도의 원뿔형 튜브에 보관하십시오. 예를 들어, 4개의 튜브에서 4번의 질 생검을 실시합니다. 이는 원심분리 후 최적의 세포 펠릿화에 중요합니다. - 샘플 믹서를 사용하여 37°C에서 3시간 동안 지속적이고 격렬한 교반으로 튜브를 배양합니다.
- 샘플 믹서를 CO2 인큐베이터에 넣습니다. 끊임없는 교반을 유지하십시오. (샘플 믹서 설정: 25초 동안 회전 동작 5rpm, 30초 동안 5° 역(틸트 회전), 2초 동안 진동(소용돌이) 동작 3°).
- 배양하는 동안 30분 간격으로 튜브를 소용돌이칩니다.
- 샘플을 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 버리십시오.
- 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2.5μg/mL 암포테리신 B를 사용하여 1-2mL의 DMEM/F12 매체에 펠릿을 재현탁시켜 리베라아제 효소를 희석합니다. 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 세게 피펫팅합니다.
3. 세포 배양
- 소화되지 않은 조직 조각의 제거
- 멸균된 50mL 원뿔형 용기 위에 100μm 세포 여과기를 놓습니다.
- 동일한 기증자의 여러 조직 생검에서 얻은 세포 현탁액을 함께 합산합니다.
- 조직/효소 현탁액을 걸러내고 5mL 주사기 플런저로 밀어 넣습니다. 나머지 조직 조각이 완전히 눌린 것처럼 보일 때까지 이 단계를 반복합니다.
알림: 질 조직 조각에서 여과기를 통해 완전히 작용하지 않는 일부 점액이 있을 수 있습니다. 세포 여과기로 점액을 버립니다.
- 세포 배양 풀링(Cell culture pooling)
- 페트리 접시(60mm x 15mm)에 대한 여러 질 생검(동일한 기증자로부터)의 플레이트 풀링 세포 현탁액.
- 페트리 접시를 37°C의 CO2 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
- 위상차 현미경으로 비부착 세포의 존재를 관찰하고 확인합니다.
- 현미경의 초점이 플레이트 바닥에 있는지 확인하십시오.
참고: 전경에 많은 면역 세포가 있을 수 있습니다. 더 적은 수의 섬유아세포가 플레이트 바닥에 부착됩니다. - 적절한 세포 부착을 보장하기 위해 세포 배양 배지를 교체하기 전에 18-24시간 동안 기다립니다.
- 80%의 합류가 발생할 때까지 3일마다 배양 배지를 교체합니다. 세포가 80-90% 합류에 도달하면 더 큰 플라스크로 확장하거나 나중에 사용할 수 있도록 세포의 부분 표본을 동결합니다.
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결과
골반 장기 탈출증 수술을 받은 10명의 독립적인 기증자로부터 질 조직을 수집했습니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 세포를 인간 질 조직으로부터 분리했습니다. 세포 집단은 특징적으로 길쭉하고 평평하며 방추형 모양을 가졌습니다. 다른 연구와 마찬가지로, 우리는 기증자의 나이가 증가함에 따라 섬유아세포의 세포 두배가 용량이 현저히 느려지고 클론생성 능력이 감소하는 것을 관찰했습니다. 이러한 차이는 고령자(75-78세)에서 분리한 섬유아세포와 젊은 개인(35-47세)에서 분리한 섬유아세포를 비교할 때 두드러졌습니다. 중년 기증자의 세포는 중간 프로필(56-61세)을 나타냈습니다. 세포 증식 속도는 초기에 알려진 것과 동일한 파종 밀도를 가진 위상차 현미경을 사용하여 직접 시각화하여 추정했습니다.
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토론
이전의 많은 연구에서는 인간의 질에서 일차 섬유아세포를 분리하는 방법을 보고했습니다 3,7. 몇몇 연구에서는 골반 장기 탈출증이 있는 폐경 전 개인의 인간 질 조직을 사용했다. 몇몇 논문에서 폐경 전 및 폐경후 개인의 조직 사용을 보고했지만7,11 나이가 많거나 폐경 후 기증자로부터 섬유아세포를 성공적으로 분리하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 충분히 자세히 설명하지 않았습니다. 생식기 탈출증이 있는 폐경 후 여성의 질벽은 폐경 전 여성보다 더 두꺼우며, 이는 이 인구에서 고립의 어려움이 증가하는 원인일 수 있다13. 골반저 질환은 폐경 후 또는 그 이상의 연령대에서 가장 흔하기 때문에 폐경 후 기증자로부터 성공적으로 격...
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공개 사항
우리는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
매사추세츠 종합병원(Massachusetts General Hospital)의 빈센트 생식생물학 센터(Vincent Center of Reproductive Biology)의 모든 구성원과 빈센트 메모리얼 병원 재단(VIncent Memorial Hospital Foundation)의 아낌없는 지원에 감사드립니다. 귀중한 제안과 실험실 장비를 빌려준 Bo Rueda 박사와 그의 연구실에 특별한 감사를 드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Amphotericin B | Bio Techne | B23192 | |
| 세포 여과기 (100 μ m) | ThermoFisher Scientific | 22363549 | |
| 원뿔형 원심분리기 튜브(15mL) | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Feather 일회용 메스 No. 15 | Socorex | FB.15 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | NC1983075 | |
| High Clarity Conical Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| HulaMixer 샘플 믹서 | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| 인간 피브로넥틴 듀오셋 ELISA | R& D 시스템 | DY1918-05 | |
| 휴먼 프로 콜라겐 I 알파 1 듀오셋 ELISA | R& D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase Research Grade | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| 페니실린/스트렙토마이신(5000U/ml) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| 페트리 접시, 폴리스티렌(100 mm x 20 mm) | Millipore Sigma | P5606 | |
| 혈청 피펫(10 mL) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| 멸균 주사기 (5 mL) | Fischer Scientific | 14-955-458 |
참고문헌
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