Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

Summary

이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.

Abstract

성상교세포와 미세아교세포는 중추신경계 발달, 부상 반응 및 신경퇴행성 질환에 중추적인 역할을 합니다. 이러한 매우 역동적인 세포는 환경 변화에 빠르게 반응하며 형태학, 전사 프로파일 및 기능 측면에서 상당한 이질성을 나타냅니다. 건강과 질병에서 신경교세포의 기능에 대한 우리의 이해가 크게 발전했지만, 뚜렷한 세포 집단을 포괄적으로 특성화하기 위해 모욕 또는 부상의 맥락에서 수행된 체외 세포 특이적 분석의 필요성은 여전히 남아 있습니다. 성체 마우스에서 세포를 분리하면 병리학적 조건 및 특정 시점에서의 세포 분석이 가능하기 때문에 세포주 또는 신생아 동물에 비해 여러 가지 이점이 있습니다. 또한 뇌 침범을 제외한 척수 특이적 분리에 초점을 맞추면 실험적 자가면역 뇌척수염, 척수 손상 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한 척수 병리학에 대한 연구가 가능합니다. 이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 성상교세포와 미세아교세포를 분리하기 위한 효율적인 방법을 제시하여 기능적, 분자적 또는 단백질체 다운스트림 연구에서 잠재적인 응용 분야를 통해 즉각적인 또는 향후 분석을 용이하게 합니다.

Introduction

성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)는 중추신경계(CNS)에서 중요한 역할을 하는 다재다능한 신경교세포로, 신경 기능 조절, 중추신경계 발달에 기여, 혈액뇌장벽 유지, 기타 중요한 과정 참여 등의 역할을 포함합니다 1,2,3,4 . 항상성을 유지하는 역할 외에도 이 신경교세포는 부상 및 복구 메커니즘에서 중추적인 역할을 합니다. 미세아교세포(Microglia)는 모욕이나 부상 후 식세포, 염증 및 이동 능력으로 잘 알려져 있다 ^5,6,7. 질병에서 성상교세포의 반응은 염증, 신경교세포의 형성, 혈액뇌장벽의 손상에 대한 기여를 포함하여 똑같이 다양합니다 ^8,9. 중추신경계에서 미세아교세포와 성상교세포의 해로운 역할과 회복 역할에 대한 이해가 높아졌지만, 구조와 기능 모두에 내재된 이질성으로 인해 다양한 맥락에서 이를 연구하기 위한 강력한 도구가 필요합니다.

건강과 질병에서 미세아교세포와 성상교세포의 역할에 대한 더 깊은 통찰력을 얻으려면 in vivo 및 in vitro 조사의 결합된 접근 방식이 필요합니다. In vivo 기술은 중추신경계 내의 신경교세포와 뉴런 사이의 복잡한 누화를 활용하는 반면, in vitro 방법론은 특정 자극에 대한 단일 세포 기능 또는 반응을 평가할 때 가치가 있는 것으로 입증되었습니다. 각 방법은 고유한 이점을 제공합니다. In vitro 연구는 인접 세포의 직간접적인 입력 없이 이러한 세포 유형의 특정 역할을 이해하는 데 필수적입니다. 또한 불멸 세포주를 활용한 in vitro 분석은 무한정 증식할 수 있는 능력, 비용 효율성 및 유지 관리 용이성을 포함한 특정 이점을 제공합니다. 그러나 일차 세포는 세포주에 비해 정상적인 생리적 반응을 더 가깝게 모방한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 생리학적 관련성은 기능적 분석 및 전사체 분석에서 매우 중요합니다.

특히 성체 쥐 척수에서 일차 세포를 얻는 데 있어 어려운 점 중 하나는 샘플의 양과 생존력에 있습니다. 성인 척수는 뇌보다 작고 상당한 양의 미엘린을 함유하고 있기 때문에 독특한 어려움을 겪고 있습니다. 신생아 동물 또는 성체 마우스 뇌^10,11,12,13에서 순수하고 생존 가능한 신경교세포를 분리하는 것을 상세히 설명하는 몇 가지 발표된 프로토콜이 있지만, 이러한 방법론은 척수에 특이적인 질병 및 부상을 연구하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 성체 마우스 척수에서 순수하고 생존 가능한 미세아교세포와 성상교세포를 효율적으로 분리하여 세포 배양 및 전사체 분석의 다운스트림 응용을 용이하게 하는 포괄적인 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 10주에서 5개월 사이의 성체 마우스에서 이러한 세포를 분리하는 데 성공적으로 사용되었으며, 조건부 녹아웃 마우스, 약물 반응, 발달 연구 및 연령 관련 모델과 관련된 연구를 포함하여 다양한 맥락에서 유용성을 입증했습니다.

Protocol

모든 동물 관리 및 실험 절차는 조지 워싱턴 대학교 의과 대학 및 보건 과학 대학 (워싱턴 DC, 미국; IACUC#2021-004)를 참조하십시오. 이 연구는 생후 10주에서 5개월 사이의 수컷과 암컷 C57BL/6J 야생형(WT) 마우스를 사용했으며, 이 마우스는 상업 공급업체( 재료 표 참조)에서 공급받아 조지 워싱턴 대학교에 보관되었습니다. 프로토콜 워크플로의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 척수의 준비

1. 아베르틴(멸균수에 2,2,2-트리브로모에탄올 12.5mg/mL 및 2-메틸-2-부탄올 12.5mg/mL)을 사용하여 동물을 마취시킵니다( 재료 표 참조). 마우스에서 발가락과 꼬리 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인합니다.
2. 말초 혈액 단핵 세포를 제거하기 위해 차가운 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 심장 관류를 수행합니다.
   1. 동물을 얕은 쟁반에 놓고 흉막을 노출시키기 위해 측면을 절개합니다. 연동 펌프에 연결된 23G 관류 바늘( 재료 표 참조)을 좌심실에 삽입하고 펌프를 활성화합니다. 차가운 DPBS가 심장을 통과하면 우심방에 작은 절개를 만듭니다.
      알림: 이 단계에서는 세포 생존력을 향상시키기 위해 더 빠른 관류 속도가 선호됩니다. 혈액은 1분 이내에 씻어내야 합니다. 간이 맑아지면 관류가 성공했음을 나타냅니다.
3. 큰 가위를 사용하여 동물의 목을 베고 척추¹⁴를 제거합니다. 조직 헹굼을 위해 얼음 위의 페트리 접시에 Ca²⁺/Mg²⁺/0.2% 포도당이 포함된 차가운 1x DPBS에 담그십시오.
4. 지금부터 모든 단계가 멸균 환경에서 수행되는지 확인하십시오. 유압 압출¹⁴ 를 사용하여 전체 척수를 분리합니다. 18G 바늘과 10mL 주사기에 Ca²⁺/Mg²⁺/0.2% 포도당이 포함된 차가운 1x DPBS를 채웁니다. 척수를 전체 조직을 잠글 수 있도록 Ca²⁺/Mg²⁺/0.2% 포도당이 포함된 충분한 차가운 1x DPBS가 들어 있는 얼음 팩 위에 놓인 페트리 접시에 옮깁니다.
5. 층류 후드 내의 현미경으로 수막을 조심스럽게 제거합니다. 척수를 얼음 팩에 담긴 빈 페트리 접시에 옮기고 10번 날 수술용 메스를 사용하여 전체 척수를 2-3mm 절편으로 자릅니다.

2. 효소 세포 해리

1. 제조업체의 프로토콜에 따라 시중에서 판매되는 Adult Brain Dissociation Kit에서 Enzyme mix 1 및 Enzyme mix 2를 추가합니다( 재료 표 참조). 척수가 균일하게 코팅되도록 접시에 효소를 여러 번 휘젓고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 5분마다 접시를 부드럽게 휘저어 조직 뭉침을 방지하고 시약이 고르게 분배되도록 합니다.
2. 인큐베이터에서 접시를 꺼내고 최소 필수 배지(MEM)에 350μL의 0.46mg/mL DNAse I을 추가합니다( 재료 표 참조). 부드럽게 휘젓고 섞는다.
3. 차가운 DMEM/0.5% 소 태아 혈청(FBS) 1mL를 넣고 부드럽게 휘젓으며 섞습니다. 전체 내용물을 즉시 5mL 튜브에 옮깁니다.

3. 기계적 세포 해리

1. P1000 피펫을 사용하여 조직을 부드럽게 세 번 삼중 처리하여 매번 조직 조각이 위로 올라와 조직을 더 해리하도록 합니다. 그런 다음 플러그가 꽂힌 9인치 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 공정 중에 기포가 생성되지 않도록 부드럽게 5회 더 삼각 처리합니다.
2. 5mL 튜브를 똑바로 세우고 조직이 바닥에 30초 동안 가라앉도록 합니다. 조직이 안정되면 P1000 피펫을 사용하여 상층액을 끌어올리고 30μm 필터를 통해 15mL 코니컬 튜브에 통과시킵니다.
3. 나머지 조직이 있는 동일한 5mL 튜브에 1mL의 콜드 DMEM/0.5% FBS를 추가합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 세 번 삼각 처리합니다.
4. 조직이 바닥에 30초 동안 가라앉도록 한 다음 상층액을 30μm 필터에 통과시키고 이전과 동일한 15mL 튜브에 수집합니다. 3.3단계와 3.4단계를 한 번 더 반복합니다.
5. 여과된 셀 현탁액을 실온(RT)에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 진공 흡입기를 사용하여 생성된 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.

4. 미엘린 제거

1. 제조업체의 프로토콜에 따라 성인 뇌 해리 키트에 제공된 잔해물 제거 용액(DRS)을 사용하여 미엘린을 제거합니다. 이물질 제거 후 세포 펠릿에 5mL의 cold DMEM/0.5% FBS를 넣고 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집습니다. 셀 현탁액을 실온(RT)에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다.
   참고: 세포가 시험관 내 연구에 사용되고 배양 상태로 유지되는 경우 예열된 DMEM/0.5% FBS를 대신 사용해야 합니다.
2. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 DPBS/0.5% FBS에 재현탁시킵니다(RNA 연구의 경우 차갑게, 시험관 내 분석의 경우 따뜻하게). 세포를 계수하고 Trypan Blue를 사용하여 생존율을 평가합니다.
   참고: 여러 동물의 세포 현탁액을 결합하여 세포 농도를 높일 수 있습니다.
3. DPBS/0.5% FBS를 총 부피 5mL까지 추가하여 세포를 세척합니다. 현탁액을 실온에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.

5. 미세아교세포와 성상교세포 분리

1. 제조업체의 프로토콜에 따라 anti-CD11b 또는 anti-ACSA-2 마이크로비드로 세포를 라벨링합니다( 재료 표 참조).
2. 제조업체의 지침에 따라 MS 컬럼을 사용하여 양성 선택으로 셀을 정렬합니다( 재료 표 참조). 분류 후 분류된 세포를 300 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.

6. in vitro 분석을 위한 도금 세포

참고: 세포가 도금되지 않고 RNA 분석에 즉시 사용되는 경우 8단계로 진행합니다.

1. 1mL의 따뜻한 DMEM/0.5% FBS에 세포를 재현탁시킵니다. 세포를 계수하고 혈구계를 사용하여 생존력을 평가합니다( 재료 표 참조).
2. 세포 농도를 50μL당 75,000개 세포로 조정합니다. 24웰 플레이트의 각 Poly-L-lysine 코팅 커버슬립¹¹ 에 세포 현탁액 50μL를 추가합니다.
3. 세포가 커버슬립에 부착되도록 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
4. 450μL의 따뜻한 DMEM/5% FBS/페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep, 재료 표 참조)을 각 웰에 조심스럽게 추가합니다.
5. 3일 후 배지의 절반을 250μL의 따뜻한 DMEM/5% FBS/Pen-Strep으로 교체합니다. 유지 관리를 위해 미디어를 500-5일마다 따뜻한 DMEM/5% FBS/Pen-Strep으로 완전히 교체하십시오.

7. 면역조직화학

알림: 배지를 한 번 이상 교체한 후 최소 3일 후에 면역조직화학 분석을 수행하는 것이 가장 좋습니다. 이렇게 하면 이물질이 제거되고 셀이 커버슬립에 완전히 부착됩니다.

1. 배지를 제거하고 항 마우스 mAb O4(1:100)( 재료 표 참조)를 따뜻한 DMEM/5% FBS/10% 정상 염소 혈청(NGS)에 넣고 실온(RT) 또는 37°C에서 15분 동안 세포에 라벨을 붙입니다.
   참고: 셀에 O7.3으로 레이블이 지정되지 않을 경우 이 단계를 건너뛰고 4단계로 진행하십시오.
2. 커버슬립을 따뜻한 DMEM/5% FBS에 세 번 담가 부드럽게 헹굽니다. 염소 항마우스 594 IgM(1:300)( 재료 표 참조)을 따뜻한 DMEM/5% FBS/10% NGS에 넣고 어두운 곳에서 15분 동안 실온에서 배양합니다. 따뜻한 DMEM/5% FBS로 3회 부드럽게 헹굽니다.
3. 4°C에서 15분 동안 차가운 5% 아세트산/메탄올로 셀을 고정합니다. 1x PBS로 3회 세척한 다음 적절한 항체로 라벨을 붙입니다: 1% Triton-X100/1x DPBS의 10% NGS에 항-토끼 GFAP(1:500), 항-마우스 GFAP(1:500) 또는 항-토끼 Iba1(1: 500 ). 상온에서 1시간 동안 배양합니다.
   알림: 커버슬립이 이미 O4로 얼룩진 경우 어두운 곳에 보관하십시오.
4. PBS로 부드럽게 세 번 헹굽니다. 적절한 2차 항체가 포함된 라벨: 항-마우스 594 IgG (1:500), 항-토끼 488 IgG (1:500) ( 재료 표 참조). 어둠 속에서 RT에서 30분 동안 배양합니다.
5. PBS로 부드럽게 세 번 헹굽니다. RT에서 1분 동안 DAPI(1: 1000)로 대조염색합니다. PBS로 세 번 헹구고 장착 매체를 추가하고( 재료 표 참조) 커버슬립을 슬라이드에 장착합니다.

8. RNA 추출

참고: 이상적으로는 분석에 충분한 RNA를 추출하기 위해 최소 100,000개의 세포가 있어야 합니다. 필요한 경우 2-3개의 척수 세포를 결합할 수 있습니다.

1. 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다( 재료 표 참조). 키트에 제공된 RW1 세척 버퍼를 사용한 각 세척 단계에 대해 셀을 세척 버퍼에 추가로 2분 동안 그대로 두십시오.
2. 제조업체의 지침에 따라 DNase I을 사용하여 남아 있는 게놈 DNA를 제거합니다( 재료 표 참조). DNase와 함께 상온에서 15분 동안 배양한 후 RW1 완충액으로 세척합니다.
3. RNA 수율을 높이려면 용출 전에 RNAse가 없는 물에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 바이오분석기¹⁵ 를 사용하여 RNA 무결성 및 양을 평가합니다( 재료 표 참조).

Results

이 프로토콜에 설명된 방법은 성체 마우스 척수에서 순수하고 생존 가능한 미세아교세포와 성상교세포를 분리할 수 있도록 하여 체외 기능 또는 조직학적 분석 및 RNA 분석을 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야를 용이하게 합니다.

in vitro 연구를 위한 성공적인 분리는 며칠 동안 지속적인 세포 증식을 초래합니다. 성체 세포는 신생아 동물에서 분리한 세포에 비해 증식 속도가 느리며 처음 며칠 동안 일부 파편이 존재할 수 있습니다. 4일 시험관내(DIV)가 되면 세포에 이물질이 거의 없어지고 대부분의 세포가 플라스크 바닥에 달라붙습니다. 성상교세포(astrocyte)는 더 긴 돌기를 형성하기 시작하는 반면, 미세아교세포(microglia)는 더 짧은 방추체를 가진 타원형을 취합니다(그림 2). 7 DIV에 의해 성상교세포는 연결된 합류층을 형성해야 하고, 미세아교세포는 점점 더 짧은...

Discussion

순수하고 생존 가능한 일차 세포의 분리는 특정 세포 유형의 구조와 기능을 조사하는 데 가장 중요합니다. 성체 마우스에서, 특히 척수에서, 이 작업은 현존하는 프로토콜이 종종 성체 척수에 맞추어지지 않기 때문에 상당한 도전을 제기한다^(10,17). 이 프로토콜은 세포 배양, 유세포 분석, 조직학 및 전사체 연구를 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야에 적용할 수 있는 효율적이고 비용 효율적인 방법을 제시합니다.

척수 준비 속도는 최적의 세포 생존율과 수율을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다. 심장 관류 중에 적혈구를 효과적으로 제거하는 것이 필수적이지만, 분리된 세포의 수는 심장 관류와 효소 해리 사이의 경과 시간에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 우리는 심장 관류 후 10분 이상 후에 조직 해리를 시작하면 세포 생존력이 감소하는 것을 관찰했습니다. 또한 30분 미만의 효소 해리...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 웰 조직 배양 플레이트	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% 포도당 용액	Corning	25-037-CI
5 mL 캡 튜브	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-IBA1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent C57BL
	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µ m filter	Sysmex Partec	04-004-2326
계수 챔버 (혈구계)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine	pancreas Sigma Aldrich	D4527-40KU
증류수	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
RNA 정제용 DNase	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP 항체 (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP 항체 (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
염소 안티 마우스 594	IgM Invitrogen	a21044	1:300
염소 안티 토끼 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 항체 (토끼)	Wako	019-1974	1:500
MACS 분리기	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L 펌프 시스템	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
메탄올	Sigma-Adlrich	439193
장착 매체	벡터 실험실	H-1000-10
MS 열	Miltenyi	130-042-401
O4 항체	R& D	MAB1326
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15070063
플러그 9" 유리 파스퇴르 피펫	VWR	14672-412
RNeasy Plus 마이크로 키트	Qiagen	74034
Royal-tek 수술용 메스 블레이드 번호 10	Fisher Scientific	22-079-683
소정맥 주입 세트, 23G x 19mm	카와스미	D3K2-23지