이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.
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방법 논문
Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)
이 논문에서
요약
초록
성상교세포와 미세아교세포는 중추신경계 발달, 부상 반응 및 신경퇴행성 질환에 중추적인 역할을 합니다. 이러한 매우 역동적인 세포는 환경 변화에 빠르게 반응하며 형태학, 전사 프로파일 및 기능 측면에서 상당한 이질성을 나타냅니다. 건강과 질병에서 신경교세포의 기능에 대한 우리의 이해가 크게 발전했지만, 뚜렷한 세포 집단을 포괄적으로 특성화하기 위해 모욕 또는 부상의 맥락에서 수행된 체외 세포 특이적 분석의 필요성은 여전히 남아 있습니다. 성체 마우스에서 세포를 분리하면 병리학적 조건 및 특정 시점에서의 세포 분석이 가능하기 때문에 세포주 또는 신생아 동물에 비해 여러 가지 이점이 있습니다. 또한 뇌 침범을 제외한 척수 특이적 분리에 초점을 맞추면 실험적 자가면역 뇌척수염, 척수 손상 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한 척수 병리학에 대한 연구가 가능합니다. 이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 성상교세포와 미세아교세포를 분리하기 위한 효율적인 방법을 제시하여 기능적, 분자적 또는 단백질체 다운스트림 연구에서 잠재적인 응용 분야를 통해 즉각적인 또는 향후 분석을 용이하게 합니다.
서론
성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)는 중추신경계(CNS)에서 중요한 역할을 하는 다재다능한 신경교세포로, 신경 기능 조절, 중추신경계 발달에 기여, 혈액뇌장벽 유지, 기타 중요한 과정 참여 등의 역할을 포함합니다 1,2,3,4 . 항상성을 유지하는 역할 외에도 이 신경교세포는 부상 및 복구 메커니즘에서 중추적인 역할을 합니다. 미세아교세포(Microglia)는 모욕이나 부상 후 식세포, 염증 및 이동 능력으로 잘 알려져 있다 5,6,7. 질병에서 성상교세포의 반응은 염증, 신경교세포의 형성, 혈액뇌장벽의 손상에 대한 기여를 포함하여 똑같이 다양합니다 8,9. 중추신경계에서 미세아교세포와 성상교세포의 해로운 역할과 회복 역할에 대한 이해가 높아졌지만, 구조와 기능 모두에....
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프로토콜
모든 동물 관리 및 실험 절차는 조지 워싱턴 대학교 의과 대학 및 보건 과학 대학 (워싱턴 DC, 미국; IACUC#2021-004)를 참조하십시오. 이 연구는 생후 10주에서 5개월 사이의 수컷과 암컷 C57BL/6J 야생형(WT) 마우스를 사용했으며, 이 마우스는 상업 공급업체( 재료 표 참조)에서 공급받아 조지 워싱턴 대학교에 보관되었습니다. 프로토콜 워크플로의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 척수의 준비
- 아베르틴(멸균수에 2,2,2-트리브로모에탄올 12.5mg/mL 및 2-메틸-2-부탄올 12.5mg/mL)을 사용하여 동물을 마취시킵니다( 재료 표 참조). 마우스에서 발가락과 꼬리 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인합니다.
- 말초 혈액 단핵 세포를 제거하기 위해 차가운 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 심장 관류를 수행합니다.
- 동물을 얕은 쟁반에 놓고 흉막을 노출시키기 위해 측면을 절개합니다. 연동 펌프에 연결된 23G 관류 바늘( 재료 표 참조)을 좌심실에 삽입하고 펌프를 활성화합니다. 차....
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결과
이 프로토콜에 설명된 방법은 성체 마우스 척수에서 순수하고 생존 가능한 미세아교세포와 성상교세포를 분리할 수 있도록 하여 체외 기능 또는 조직학적 분석 및 RNA 분석을 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야를 용이하게 합니다.
in vitro 연구를 위한 성공적인 분리는 며칠 동안 지속적인 세포 증식을 초래합니다. 성체 세포는 신생아 동물에서 분리한 세포에 비해 증식 속도가 느리며 처음 며칠 동안 일부 파편이 존재할 수 있습니다. 4일 시험관내(DIV)가 되면 세포에 이물질이 거의 없어지고 대부분의 세포가 플라스크 바닥에 달라붙습니다. 성상교세포(astrocyte)는 더 긴 돌기를 형성하기 시작하는 반면, 미세아교세포(microglia)는 더 짧은 방추체를 가진 타원형을 취합니다(그림 2). 7 DIV에 의해 성상교세포는 연결된 합류층을 형성해야 하고, 미세아교세포는 점점 더 짧은.......
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토론
순수하고 생존 가능한 일차 세포의 분리는 특정 세포 유형의 구조와 기능을 조사하는 데 가장 중요합니다. 성체 마우스에서, 특히 척수에서, 이 작업은 현존하는 프로토콜이 종종 성체 척수에 맞추어지지 않기 때문에 상당한 도전을 제기한다(10,17). 이 프로토콜은 세포 배양, 유세포 분석, 조직학 및 전사체 연구를 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야에 적용할 수 있는 효율적이고 비용 효율적인 방법을 제시합니다.
척수 준비 속도는 최적의 세포 생존율과 수율을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다. 심장 관류 중에 적혈구를 효과적으로 제거하는 것이 필수적이지만, 분리된 세포의 수는 심장 관류와 효소 해리 사이의 경과 시간에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 우리는 심장 관류 후 10분 이상 후에 조직 해리를 시작하면 세포 생존력이 감소하는 것을 관찰했습니다. 또한 30분 미만의 효소 해리.......
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감사의 글
RNA 분석을 위한 George Washington University Genomics Core와 RNA 염기서열 분석을 위한 Q2 Lab Solutions의 Castle Raley에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)[보조금 번호 F31NS117085]와 로버트 H. 밀러 박사(Dr. Robert H. Miller)의 비비안 길 연구 기금(Vivian Gill Research Endowment)의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 웰 조직 배양 플레이트 | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% 포도당 용액 | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL 캡 튜브 | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent C57BL | ||
| Jackson Laboratories | |||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µ m filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| 계수 챔버 (혈구계) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine | pancreas Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| 증류수 | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| RNA 정제용 DNase | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP 항체 (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP 항체 (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| 염소 안티 마우스 594 | IgM Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| 염소 안티 토끼 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 항체 (토끼) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS 분리기 | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L 펌프 시스템 | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| 메탄올 | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| 장착 매체 | 벡터 실험실 | H-1000-10 | |
| MS 열 | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 항체 | R& D | MAB1326 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15070063 | |
| 플러그 9" 유리 파스퇴르 피펫 | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus 마이크로 키트 | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek 수술용 메스 블레이드 번호 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| 소정맥 주입 세트, 23G x 19mm | 카와스미 | D3K2-23지 |
참고문헌
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia
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재인쇄 및 허가
