전임상 연구를 위한 결찰 유발 치주염 마우스 모델의 최적화

요약

결찰 유발 치주염 마우스 모델은 치주 질환 연구에 효과적이고 점점 더 인기 있는 도구입니다. 실험실 설계, 3D 프린팅 도구 제작, μCT 분석을 이용한 뼈 정량 등 근위 간 치포골 파괴에 중점을 둔 단순화된 모델 구현을 위한 상세 지침이 제시됩니다.

초록

쥐에서 결찰로 인한 치주염의 실험 모델은 치주 질환 병인성 이해에 근본적인 역할을 해왔으며; 하지만 이 기술은 번역 및 치료적 응용 분야에서 완전히 활용되지는 못했습니다. 인간 질환과 유사하게, 쥐의 결찰 유발 치주염은 일련의 뚜렷한 미생물, 염증, 골-면역 사건을 통해 발생합니다. 결찰로 인한 치포 골 파괴는 비교적 짧은 시간 내에 진행되며 쉽게 정량화할 수 있어 전임상 연구에 비용 효율적인 질병 모델이 됩니다.

고전적 결찰 모델의 기술적 도전을 극복하기 위해, 단순화된 결찰 유발 치주염 마우스 모델이 구축되었습니다. 인접한 두 치아 전체 둘레에 질병을 유발하는 대신, 단순화된 질병 모델은 두 개의 후방 치아의 근위 부위에서만 염증성 골 파괴에 초점을 맞춥니다. 이 부위는 인간에서 흔한 치주 질환이 시작되는 부위이기도 합니다. 3차원(3D) 프린팅 도구를 사용해 결렬 위치를 맞추기 때문에, 빠르고 효과적이어서 마우스당 5-10분 정도의 절차 시간이 소요됩니다. 결찰 3일 후에 골파세포 생성 신호가 감지되지만, 결찰 9일째에 뼈 파괴가 일관되게 진행됩니다.

여기서는 단순화된 결찰 모델 프로토콜을 연구 설계에 특화된 중요한 요소들(예: 검정력 계산, 절차 표준화, 교정), 3D 프린팅 도구 개발(예: '마우스 치과 침대' 및 '결찰 홀더'), 그리고 μCT 분석을 이용한 치포골 정량화를 강조하여 상세히 설명합니다. Rank, Rankl, Opg의 치은골 유전자 발현은 골세포형성의 주요 조절 삼합체로, 치료 효과의 간접적 증거로 사용됩니다. 본 논문에서 제시된 방법들은 연구자들이 단순화된 결렬 유발 치주염 모델을 도입하여 전임상 환경에서 혁신적인 치주 치료제를 시험하는 데 지침을 제공할 것입니다.

서론

치주 질환은 치은색, 치주 인대, 치마질, 치조골 등 치아 지지 구조를 파괴하는 복잡한 염증 과정입니다. 치주 골 손실이 발생하려면 치은막의 붕괴와 박테리아 침범, 염증 세포의 모집, 선천적 우세 면역 반응에서 획득 우위 면역 반응으로의 전환이 반드시 일어나야 합니다^1. 골세포와 파세포 간의 최종 불균형은 그 파괴를 통해 치포골 손실을 초래합니다^. 치주 질환과 가역적 치은염(치은염) 진단을 구분하는 대표적인 표현형 소견은 치포골의 손실입니다. 따라서 치아를 지지하는 치조골의 양은 전임상 환경에서 중요한 치료 결과입니다.

어떤 단일 동물 모델도 다양한 치료제 개발에 필요한 모든 생물학적 측면을 재현할 수 없습니다 ^3,4,5. 결찰 유발 치주염 마우스 모델은 3-9일 이내에 정량화된 뼈 파괴를 개발^하여, 치주염 예방 및 조절을 위한 새로운 치료 중재를 비용 효율적으로 시험할 수 있는 모델입니다. 2-3상 인간 임상시험 6,7,7,8,9,10의 개발에 성공했음에도 불구하고, 결찰로 인한 쥐 치주염은 전임상 모델로 일반적으로 활용되지 않습니다. 결찰이 치아를 감싸는 고전적 모델의 기술적 어려움을 극복하기 위해, 단순화된 결찰 유발 치주염 마우스 모델^11,12가 확립되었습니다. 고전적인 모델의 단순한 변형은 치아 주변이 아닌 치아 사이를 중심으로 골 파괴 부위를 집중적으로 하는 것입니다. 이 수정의 이점은 1) 인력 훈련에 필요한 시간 단축, 2) 실험 절차의 기술적 용이성, 3) 뼈 정량화의 재현성 등 다중적인 이점입니다. 또한, 이 단순화된 모델에서 발생하고 나타나는 여러 미생물학적 및 면역학적 사건들이 흔한 인간 치^{주 질환에} 대한 현재의 이해와 일치한다는 점이 밝혀^{졌습니다.} 마지막으로, US ^2.14에서 이전에 보고한 효과적인 약물 유발 골손실 예방은 간소화된 결찰 유발 치주염 모델을 새로운 치주 치료의 핵심 측면을 평가하는 생체 내 도구로 활용하는 것을 더욱 뒷받침합니다.

단순화된 결사로 인한 치주염 모델의 혁신적인 측면은 질병 유도 과정을 보다 쉽게 지원하기 위한 3D 프린팅 도구 개발입니다^11,12. 일부에게는 직관적이지만, 연구자들은 3D 프린^{팅 도구를 조립}하지 못하는 문제를 보고했으며, 이는 동물 연구 시작을 더욱 지연시키거나 지연시킬 수 있습니다. 본 연구는 이전 프로토콜 연구¹¹에서 제공된 정보를 확장하여, 실험실 환경에서 간소화된 결렬 유발 치주염 모델을 성공적으로 구현할 수 있도록 상세한 정보를 제공합니다. 현재 프로토콜에 포함된 세부 사항들은 과학적 발견의 결과 재현성 부족에 기여할 수 있는 복잡한 요인들의 일부입니다^{15, 16, 17}. 지난 10년간 2,11,12,14,18 및 협력 연구 그룹 13,19,20,21에서 확인된 일관된 모델 사용과 신뢰할 수 있는 골 흡수는 과학계 재현성을 촉진하기 위해 상세한 정보 보급의 중요성을 뒷받침합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 동물 연구: 생체 내 실험 보고(ARRIVE) 지침^22,23을 준수했습니다. 이 프로토콜에 기술된 모든 실험 절차는 노스캐롤라이나 대학교 채플힐 캠퍼스의 IACUC에서 승인받았습니다.

1. 실험 설계

1. 표본 크기 계산
   참고: 연구 프로그램의 중개 특성상, 여기서 제시된 검정력 계산은 8-12주 된 야생형 C57Bl6 마우스의 치포골 측정을 기반으로 합니다.
   1. 시멘텀-법랑질 접합부와 치포골 능선(CEJ-ABC) 사이의 선형 측정을 기반으로 뼈를 분석합니다.
      1. 건강한 쥐는 평균 부착 수준(CEJ-ABC 측정값)이 0.2 mm인 반면, 결찰 후 9일 시점에 치주염이 있는 쥐는 그 두 배(CEJ-ABC 거리 0.4 mm)를 가집니다¹¹. 결박 후 9일에서¹⁸일까지 치포골 손실은 유의미하게 증가하지 않습니다.
      2. 이 효과 크기를 기반으로 검정력 계산 분석을 수행하여 건강과 질병 간 차이를 밝히기 위해 필요한 쥐 수를 파악합니다(여기서는 총 8-10마리 쥐 [그림 1A]).
         참고: 몫값은 2표본 평균 몼곱을 사용하여 0.8에서 0.95 사이의 몱제곱, α = 0.05를 달성하도록 계산되었습니다. 그룹 평균과 표준편차는 그림 1B에 제시되어 있습니다.
   2. 골 손실에 대한 치료 효과를 판단하려면 다른 도력 계산을 수행하세요. 이 프로토콜에서 실험군과 대조군 모두 치주염이 발생하므로, 건강한 쥐와 병든 쥐를 비교하는 대신, 단순화된 결사로 유도된 치주염 마우스 모델을 사용해 골 손실 조절을 테스트할 때 결과 재현성을 보장하기 위해 19마리에서 31마리의 쥐를 그룹당 따로 따로 둡니다(대표 결과 및 그림 1C 참조).
      참고: 검정력은 위에서 설명한 동일한 검정을 사용하여 계산되었습니다. 그룹 평균과 표준편차는 그림 1D에 제시되어 있습니다.
2. 절차 표준화 및 인원 교정
   1. 연구 시작 전에 질병 유도 및 정량화에 관여하는 모든 인력을 교육하고 교정합니다(상호 교정 및 교정 중 보정; r² ≥ 0.90).
      참고: 결찰 위치 및 골 손실 정량화 훈련에는 2-3개월의 기간이 소요되는 것으로 추정됩니다(표 1에 제시된 일정). 기타 필수 단계는 표 1에 연대표로 제시되어 있습니다.
   2. 결찰 삽입 절차의 경우, 두 명의 훈련된 조사관이 절차실에서 함께 작업하도록 하세요. 주요 연구원(내부 및 상호 보정)은 결속을 부착하는 운영자로 남아 있습니다.
   3. 두 번째 조사관은 절차 조수로 일하며 아래에 나열된 절차를 수행하세요:
      1. 마우스 무게 기록.
      2. 쥐를 마취 상자에 넣어.
      3. 마우스를 '마우스 덴탈 베드'에 넣기 위해 조작자에게 건네기 전에 눈 연고를 바르세요.
      4. ≥3개의 '합찰 홀더'가 합계로 적절히 채워져 사용 준비가 되었는지 확인하세요.
         참고: 효율성을 높이기 위해서는 ≥개의 '리가처 홀더'를 적절히 장착하는 것이 이상적입니다. 편의성(즉, 마우스당 5-10분 정도)을 권장하며, 하루에 진행되는 실험 수를 늘리고 배치 효과를 줄일 수 있습니다.
      5. 시술 전후로 마우스 모니터링을 하세요.
         참고: 결찰로 인한 치주염은 비침습적이고 비수술적인 시술로, 인간 치실 사용과 유사합니다. 결찰 삽입은 쥐에게 매우 가벼운 불편함을 줄 것으로 예상되며(주로 두 치아 사이에 세균이 쌓여 있기 때문), 진통제 사용은 필요하지 않습니다. 훈련된 전문가가 실시한 결찰 시술 후에는 합병증이 예상되지 않습니다. 모든 동물은 결찰 후 2-3일마다 모니터링됩니다. 인도적 종단점(예: 미용이나 먹이 미사용 실패, 일어나거나 보행 불가, 호흡 곤란, 괴사 또는 감염 상처)은 승인된 동물 프로토콜에 명시되어야 하지만, 합병증이 발생할 경우 적절한 조치에 대해 수의사와 상담해야 합니다.

2. 마우스에서 결찰 치주염을 유도하기 위한 인쇄 도구 제작

참고: 결찰 위치를 최적화하기 위해, 여러 개의 개별 3D 프린팅 조각으로 구성된 3D 프린팅 도구인 마우스 덴탈 베드 와 결찰 홀더 가 개발되었습니다. 이 장치들의 설계도 사양은 이전에¹¹ 번 공개되었으며, 경험 많은 조사관들이 개별 STL 파일을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 본 연구의 새로운 장치들은 노스캐롤라이나 대학교 채플힐 캠퍼스 BeAM 디자인 센터와 협력하여 개발되었습니다. 자재는 해당 핵심 시설을 통해 획득하거나 보충 파일 1의 STL 파일을 사용해 3D 프린팅할 수 있습니다.

1. 쥐 치아 침대
   1. 3.0mm 폴리락틱산(PLA) 필라멘트를 사용해 3D 프린터에서 표준 인쇄 품질로 마우스 치아용 침대(그림 2A)와 결사 홀더(그림 2B)를 출력합니다. 치과 베드는 설계된 방향으로 출력하고, 나머지 부품은 평평한 면이 프린트 베드에 맞춰 아래쪽으로 향하도록 출력하세요. 지원 재료 옵션을 활성화하려면 지원 배치 설정을 활성화하세요. 지지재가 먼저 빌드 플레이트에 닿는지 확인하려면 ' 빌드 플레이트 접촉' 옵션을 선택하세요.
      참고: 보충 파일 1 의 다섯 STL 파일을 사용하여 분리된 튜브, 결찰(노치 포함), 마우스 덴탈 베드(노치 포함), 뚜껑, 결찰 홀더 잠금장치 등 필요한 모든 요소를 출력하세요. 각 항목의 크기는 재료 표를 참고하세요(앞서 제시된 설계도 사양서¹⁰).
   2. 인쇄가 완료된 후에는 와이어 커터, 니들 노즈 플라이어 또는 다른 도구를 사용해 모델의 인쇄 지지 부품을 다듬습니다.
      참고: 이 시술 중에는 안전 고글을 착용하세요.
2. 마우스 치아 침대 조립체
   1. 쥐 치아 침대를 준비하려면 모든 부품을 표시한 대로 배치하고(그림 3A), 접착제를 준비하세요(그림 3B).
   2. 접착제 몇 방울을 떨어뜨리고(그림 3C), 나사를 첨부하세요(그림 3D). 다시 한 번, 접착제(그림 3E)를 적용할 부위로 옮길 준비를 하세요. 인쇄된 튜브의 슬롯(그림 3F)을 바늘 끝이 마우스 치과 침대에서 반대 방향으로 향하게 하여 끼우세요(이로써 아이소플루란을 공급하는 호스가 연결됩니다).
   3. 머리를 안정시키는 부품을 접착제로 고정하세요(그림 3F).
   4. 남은 접착제를 닦아내고 삽입된 모든 부품에 약간의 압력을 가해 단단히 고정하세요(그림 3F).
3. 합자 홀더 조정
   1. 잠금 및 잠금 해제 시 불편함을 줄이기 위해, 15C 메스 칼날 손잡이 3번에 15C 칼날을 사용해 외부 부분(그림 4A)의 모든 직각/날카로운 모서리를 45° 각도로 약간 경사지로 처리해야 합니다.
   2. 잠금 메커니즘이 리거처 홀더에 단단히 맞도록 하기 위해, 15C 메스를 사용해 리거처 홀더 락(그림 4B-F)의 내부 둥근 모서리를 각각으로 맞춥니다.
      참고: 이렇게 하면 잠금장치가 리거처 홀더에 완전히 밀착되어 약간의 조정만 필요합니다.
      1. 3D 프린팅 트리밍 도구나 15C 스칼펠 칼날을 사용해 대부분의 지지대를 제거한 후에도 상하단 가장자리에 남은 '플래시'를 제거하고, 가장자리를 45° 각도로 약간 경사면(1단계에서 리거처 홀더 락에 베벨링한 것과 유사)하여 단단히 맞는 잠금장치를 확보하세요.
         참고: 너무 많은 재료를 제거하지 말고, 잠금장치가 저항 없이 미끄러지듯 끼울 만큼만 제거하세요.
   3. 너무 얇으면 각 팁의 길이를 다듬어 더 두꺼운 단면(최소 0.5mm 두께)에 도달하게 하여, 결찰 시 입천장에 닿지 않도록 팁 사이에 충분한 여유가 남도록 하세요. 절단 후 팁이 최소 3mm 길이인지 확인하세요(그림 5A, "CUT"으로 표시됨).
   4. 리가처 홀더의 끝부분에서는 도구가 인쇄된 '지지대'의 플래시를 제거하여 팁 측면이 평평한지 확인합니다(그림 5B, 화살표).
   5. 각 끝 옆면을 45° 각도로 '슬라이스'로 잘라내어 결찰을 더 쉽게 하고, 연부 조직에 외상을 방지하기 위해 가장자리를 부드럽게 만듭니다(그림 5C, 화살표로 표시).
   6. 리거처 홀더의 각 팁에는 실크 리거처가 놓일 수 있는 'V'자 모양의 홈이 포함되도록 하세요. 만약 2.3.6단계에서 초기 인쇄된 팁이 너무 얇아 이 부분이 제거되었다면, 인쇄물에서 이를 다듬거나 재현하세요.
      1. 이 'V'자 모양의 홈이 보이면, 리거처 홀더를 평평한 표면에 양쪽 끝이 테이블 상판과 평행하게 놓고, 15C 스메펠 칼날을 홈 밑부분에 부드럽게 넣은 뒤, 칼날을 좌우로 살짝 흔들어 칼날 가장자리가 'V'자 밑부분에 머물게 하고, 칼날 측면이 'V'자 상단 벽에 닿도록 합니다. 칼날을 홈의 밑부분에 두고 매우 조심스럽게 칼날을 끝 바깥 표면 쪽으로 각도를 맞추고 이 동작을 반복하여 바깥 가장자리의 'V'자 모양 홈 밑부분을 다듬어 봉합실이 더 쉽게 제자리에 맞출 수 있도록 하세요.
         참고: 이 흔들림 동작은 필라멘트를 방해하지 않고 노치를 다듬을 수 있을 만큼의 움직임을 만들어내며, 과도한 재료를 제거하지 않습니다.
      2. 이 'V'자 모양의 노치가 보이 지 않는다 면, 리가처 홀더를 평평한 표면에 양쪽 끝이 테이블 상판에 수직으로 놓으세요. 리가처 홀더의 양쪽 끝을 따라 곧게 아래를 바라보며, 15C 메스 칼날을 끝 중앙에 놓고 한 번에 얕은 자르기를 하여 'V'자 모양의 홈이 생길 시작점을 만듭니다.
         참고: 칼날을 두 끝에 동시에 올바른 위치에 맞추려 하기보다는 각 팁을 따로따로 하는 것이 더 쉬운 경우가 많습니다.
      3. 필요하다면 2.3.7.2 단계를 반복하며, 칼날 날이 항상 끝 중앙의 같은 지점으로 다시 돌아오도록 하세요.
         참고: 날과 같은 위치로 가장자리가 다시 추적되지 않으면 여러 번 절단이 이루어지며, 이로 인해 해당 부위에서 필라멘트 층이 분리되기 시작하여 공구의 성능을 저하시킬 수 있습니다.
         참고: 'V'자 모양 노치의 깊이는 묶인 실크 리거처를 사용해 주기적으로 테스트하여 결점이 잘 유지되는지 아니면 계속 미끄러져 나가는지 확인해야 합니다(추가 미세 작업이 필요할 수 있음). 홀더는 노치가 빌드플레이트 위에서 아래를 향하도록 인쇄되어야 하며, 리가처 홀더 락은 넓은 개구부가 빌드 플레이트에 닿도록 방향을 잡아야 합니다. 역시 서포트 자재는 Supporting Placement를 빌드플레이트 접촉 모드로 설정한 상태에서 사용할 수 있습니다.
4. 합자 홀더 조립 완료
   참고: 수정이 완료된 후에는 합자 홀더를 조립하고 다음 사항을 확인하세요:
   1. 결렬이 고정되었을 때는, 잠금장치가 고정 고정 장치의 실을 고정 홀더(화살표가 가리킨 그림 6A 에서는 보이지 않지만 그림 6B에서 볼 수 있음)를 고정하도록 하여 고정 장치를 고정하도록 합니다(가능하면 둘 다 가능하지만 달성하기 어려울 수 있습니다).
      참고: 이 마찰은 결사가 제자리에서 미끄러지지 않도록 보장합니다.
   2. 리거처 홀더의 홈에 리거처를 꿰을 때, 끝에서 계속 미끄러지면 홈을 깊게 하거나 팁 바깥쪽으로 더 연장해 실이 자리 잡을 '트랙'을 만듭니다.
   3. 합사 홀더 앞에서 두 매듭이 중심에 맞춰져 있는지(그림 6C), 그리고 수평한지( 그림 6D의 직선) 있는지 확인하세요; 그렇지 않다면, 한 홈이 다른 것보다 더 깊습니다.
   4. 결렬이 홈 안에 딱 맞게 자리 잡고 너무 깊게 자리 잡지 않는지 확인하세요; 그렇지 않으면 결찰 홀더 끝이 연조직에 닿아 결찰 중 외상을 일으킬 위험이 높아집니다.
   5. 치과 탐사기(그림 6E)를 사용해 매듭 사이에 부드러운 힘을 가할 때 결찰이 미끄러지지 않고 튕겨 나오는지 확인하세요(이는 결찰 착용 시 받는 힘을 시뮬레이션한 것입니다).

3. 합자 위치

참고: 인간 치주 병원체가 첨가되든 없든 결찰이 쥐 치아 사이에 삽입될 수 있습니다¹¹. 인간 박테리아 보충 없이 결박물의 미생물 조성을 시간 의존적으로 분석한 결과, 치주염 발달 중 마이크로바이옴 군집의 변화(분포 불안정)가 나타나는 것으로 나타났습니다¹². 이 때문에 결사 교체는 결과 재현성을 변경할 수 있으므로 권장되지 않습니다. 박테리아 종과 결합 여부는 특정 연구에서 다루는 질문에 따라 달라집니다. 예상되는 10-15% 결사 손실 때^문에, 결찰은 한 마리 쥐에 양쪽으로 배치됩니다. 이 방법은 실험 중 쥐 손실을 최소화합니다.

1. 흡입된 이소플루란으로 마취한 쥐를 마취한 후, 마취된 쥐를 마우스 치과 침대에 등을 기대고 코를 코 콘 근처에 위치시키세요.
   참고: 쥐는 4% (vol/vol) 이소플루란을 사용해 마취해야 합니다. 이소플루란 증기기와 산소는 0.2 μm 공기 필터로 여과됩니다. 쥐가 완전히 마취되어 마우스 치과 침대에 놓인 후에는 코 원뿔을 통해 1.5-2.5%의 유량을 유지해야 합니다. 쥐는 무의식적인 신체 움직임과 호흡 속도(~55-65 호흡/분)로 모니터링됩니다. 결찰 치주염에 걸린 쥐에게는 진통제를 제공할 필요가 없으며, 이는 인간 치아를 치실질로 사용하는 것과 유사한 비침습적이고 비수술적인 절차입니다. 결찰 삽입은 쥐에게 매우 경미한 불편함을 줄 것으로 예상되며(주로 두 치아 사이에 세균이 쌓여 있기 때문), 진통제 사용은 필요하지 않습니다. 훈련된 전문가가 실시한 결찰 시술 후에는 합병증이 예상되지 않습니다.
2. 고무줄을 사용해 쥐의 머리를 안정시키고 입을 벌리세요.
   참고: 하악 앞니 주위의 밴드는 혀를 당기게 하며, 턱을 당기지 않고 벌리는 장력은 수동적입니다. 어금니의 시각화는 그림자가 시야를 가리지 않도록 각도를 조절하면 더 쉽게 볼 수 있습니다. 마우스 치아 침대는 단순화된 결찰 유발 치주염 마우스 모델에 맞게 특별히 설계되었습니다. 실험 과정에서 쥐가 작은 신체 움직임을 할 수 있도록 코와 원추세포 사이의 거리가 필요합니다. 이 마우스 움직임은 결찰 홀더를 사용할 때 조작자의 손 움직임을 적절히 모니터링할 수 있게 하며, 결찰 시 사용되는 힘의 양을 조절할 수 있게 합니다. 결박 배치는 마우스당 5-10분 정도 걸릴 거예요. 동물 실험을 수행할 때는 통풍이 잘 되는 후드에서 시행해야 합니다
3. 합자를 오른쪽에 붙이려면 오른손에 합자 홀더를, 왼손에 익스플로러를 잡으세요.
   참고: 합자의 매듭이 끝 사이에 위치하지 않고 한쪽 끝에 더 가깝다면, 특정 면에 배치하는 것이 더 적합할 수 있습니다. 예를 들어, 매듭이 합자 홀더의 오른쪽 끝에 더 가깝게 놓이면 이 결렬이 오른쪽에 더 쉽게 고정될 수 있습니다.
4. 탐색기 끝을 구개측 1대와 2대 어금니의 근위 접촉 아래에 부드럽게 대세요.
   1. 익스플로러 팁이 먼저 치아에 닿게 한 뒤, 부드러운 조직에 손상을 주지 않도록 치은염에 기대어 미끄러지듯 내려가세요. 익스플로러 손잡이를 수평 각도로 고정하면 됩니다.
   2. 탐색기의 어느 쪽 끝이 오른쪽에 위치하고 어느 쪽이 왼쪽에 위치하는지 기록해 두세요. 익스플로러 끝이 근위 접촉 부위에 위쪽으로 걸리도록 하고, 팽크의 굽음이 반대쪽 면을 가로질러 고정되도록 하여 삽입 시 반작용 힘으로부터 헤드를 안정시키도록 하세요.
5. 결찰 홀더를 수평 각도로 사용하여, 먼저 2대니와 3대니 사이의 접합 지점 위에 결찰 홀더를 위치시키고, 결찰 홀더의 가장자리를 뺨에 밀어 움직임을 유도한 뒤, 1, 2 대니의 접합 지점에 고정 고정을 하여 뺨을 뒤로 젖힙니다.
   참고: 이 단계는 구강 점막이 결찰과 치아 사이에 끼어 위치 설치에 방해가 되지 않도록 돕습니다.
6. 결사가 제1대와 제2대금니 사이의 근위 접촉 위에 위치하면, 결찰 홀더의 손잡이를 최대 45°까지 회전시키고, 부드러운 흔들림과 미끄러짐을 조합하여 결찰을 접촉부에 밀어 넣습니다.
7. 남는 실을 자르기:
   1. 가는 바늘 겸자를 사용해 오른쪽에 묶인 여분의 실을 고정하고, 실을 치아 위로 왼쪽으로 당긴 뒤, 약간 열린 가위로 가위를 매듭에서 ~1.5mm 정도 위치시킬 때까지 실을 따라 미끄러뜨려 놓은 후 자르세요.
      참고: 이는 과잉 점막을 자를 때 의도치 않은 점막 손상 가능성을 줄이는 데 도움이 됩니다.
   2. 위 과정을 반대 방향으로 반복하세요.
8. 위 3.3의 단계를 따라 하세요. 3.7.2로 입 반대편에 결찰을 할 때.
   참고: 희생 시 결찰 채취를 권장하는데, 이는 실험 조건에 따라 불쾌한 이동이 달라질 수 있기 때문입니다¹². 채취를 돕기 위해 쥐를 마우스 치과 침대에 놓고 결찰 매듭 중 하나를 잘라낸 후 겸자로 부드럽게 근위간 제거를 합니다. 결찰 채취 중 마우스 덴탈 베드를 사용하면 쥐의 적절한 안정성과 결찰 부위에 쉽게 접근할 수 있습니다.

4. 골 파괴 정량화

1. μCT 분석
   1. 소프트웨어를 열고 파일 | 이미지 가져오기...
   2. 팝업 메뉴에서 ' 탐색 '을 클릭하고, Dicom 파일이 있는 폴더로 가서 한 번 스캔한 뒤 첫 번째 파일을 선택하세요.
   3. ' Examine '을 클릭하면 폴더 내에서 동일한 스캔 샘플에 속하는 다른 파일을 찾고 선택하세요. 확인 버튼을 누르세요.
   4. 이미지가 로드되기 시작하면 시각화 와 등각 표면을 클릭하세요.
   5. 이미지 임계값을 5,000으로, 표면 품질 계수(%)를 55로 변경하세요.
   6. ' 이미지 스무딩 활성화 '와 ' 현재 ROI로 클립 표면 설정'이라는 박스를 체크하고 '업데이트'를 클릭하세요.
   7. 레벨 속성을 조정하려면 하단의 창/레벨 (그림 7A)을 우클릭한 후 창/레벨 속성 편집을 클릭하세요. 모든 샘플에 표준적인 골밀도 값을 선택하세요. 이 프로토콜을 따르려면 2,000 을 사용하되 샘플의 골밀도에 따라 조절하고 모든 측정에서 일정하게 유지하세요.
   8. 비행기를 조작하는 방법:
      1. 세 가지 다른 평면을 I /J/K 단축키로 숨기거나 표시 하세요.
      2. 마우스 오른쪽 클릭 후 커서를 움직여 확대와 축소를 할 수 있습니다.
      3. Shift 키를 누른 후 왼쪽 클릭으로 팬하세요.
      4. 슬 라이 스를 클릭하면 평면을 이동하고 회전시키세요.
      5. 평면의 중심을 클릭하면 평면을 앞뒤로 이동시키거나, 원하는 평면의 중앙에 커서를 놓고 위아래 화살표 키로 한 슬라이스씩 이동할 수 있습니다.
      6. 평면의 가장자리를 클릭해 평면 중심에서 이 간선과 평행한 선을 중심으로 회전하세요.
      7. 평면의 모서리를 클릭하면 평면을 중심으로 회전할 수 있습니다.
   9. z축(화면 상단의 파란색 창-z-슬라이스)을 정렬하여 세 개의 이빨 표면/형태가 동시에 또는 가능한 한 가까이(그림 7B)로 보이도록 합니다.
   10. 이 같은 평면(화면 z-슬라이스 상단의 파란색 창)을 스크롤하여 1^째 와 2^번째 어금니의 뿌리가 보이도록 합니다(그림 7C). 뿌리 아래쪽에 충분히 떨어져 주변 해부학이 모두 보일 수 있으면서도, 관이 명확하고 직선으로 보이는 지점을 선택하세요.
       참고: 운하를 수직으로 맞추기 위해 평면을 회전시켜야 할 수도 있습니다.
   11. x축(z-slice 패널의 수직 녹색선)을 1^구 와 2^구 치의 구근근과 정렬하도록 정렬하세요(가능하다면 각 근관의 중심부를 통과하도록 하세요; 그렇지 않으면 1^구 니의 구근근과 2^구 니의 구근근을 따라 정렬하세요) (그림 7D).
   12. x 슬라이스의 방향을 기준으로 하여 y 슬라이스(x-슬라이스 패널의 수직 파란 선) 정렬을 하세요.
       1. y 슬라이스를 x-슬라이스 패널의 첫 번째 어금니 뿌리를 따라 수직으로 평행하게 정렬합니다(그림 7E). 평면을 회전시켜 근을 수직으로 정렬하세요. 파란 선이 뿌리 중앙을 가로지르는 것을 관찰하세요.
          참고: 이 모델에서 예상되는 골 손실 부위에서는 폐조 능선에 결손이 있을 수 있습니다; 따라서 주변 뼈가 이상적으로 소켓의 중앙을 정의하지 않을 수 있으므로 근의 중앙선을 추정해야 합니다.
   13. y 슬라이스 패널에서는 시멘토법질 접합부(CEJ)에서 치포골 능선(ABC)까지의 거리를 측정하는데, 커서를 홈의 가장 깊은 지점에 놓고 1을 누르고, ABC의 가장 가까운 지점에 커서를 놓고 2 를 누르는 방식입니다(그림 7F). 첫^{번째 점은} 파란색 화살표로, 두 번째 점은 초록색 화살표로 표시됩니다.
       1. 두 지점을 모두 선택해야만 화살표가 나타나면, 원하는 영역 위에 화살표를 올리고 키보드의 숫자 키를 눌러 선택하세요. 마우스 클릭만으로는 작동하지 않습니다.
       2. CEJ를 판단하기 어렵다면, 위아래 화살표 키를 사용해 인접한 슬라이스를 스크롤하여 위치를 확인하세요.
       3. "가장 가까운 점"을 결정하기 어렵다면 ABC의 여러 지점을 측정하여 측정에 거의 변동이 없음을 확인하세요.
          참고: 정확한 측정이 이루어졌는지 확인하려면 원하는 근 위에서 x와 z 단면이 교차하는 것을 보고, 평면을 숨기면 3D 뷰에서 측정값을 시각적으로 확인할 수 있습니다(그림 7F).
2. Rankl/Opg 및 Rankl/Rank의 치은골 발현 정량화
   1. 앞서 설명한 대로 치은염 조직을 채취하세요⁹.
      참고: 최상의 RNA 추출 결과는 신선한 조직 샘플을 사용하여 얻어야 하며, RNA 정제는 가능한 한 빨리 처리되어야 합니다.
   2. 참고된 키트와 세라믹 비즈를 사용해 비드 비트로 치은염 조직 RNA를 추출합니다. 키트의 지침을 따라 qRT-PCR 분석할 때까지 -80 °C에서 샘플을 보관하세요 .

결과

aWT 마우스의 기준선(건강) 및 9일 후 결찰 후 선형 치포골 측정값을 대표하는 데이터 분석은 그림 1A에 제시되어 있습니다. 검정력 계산에 따르면, 주요 결과가 μCT로 측정된 선형 골 수준일 경우, 이 그룹 간 차이를 감지하려면 총 10마리(그룹당 4-5마리)의 쥐가 필요합니다(그림 1B). 그러나 전임상 연구의 검정력 계산은 두 그룹 모두 치주염이 발생하되 한 그룹이 치료 중재를 받아야 합니다(그림 1C). 이 유형의 연구에서는 그룹당 19-31마리로 더 많은 마우스가 필요합니다(그림 1D). 전임상 연구에서 필요한 동물 수가 더 많은 이유는 두 가지 주요 이유 때문입니다: 1) 두 그룹 모두에서 질병이 유발되지만, 한 그룹에 실험적 개입이 적용되어 ...

토론

본 연구는^{이전에 제시된} 간소화된 결찰 유발 치주염 마우스 모델 프로토콜에 대한 통찰력 있는 정보와 상세한 단계별 지침을 제공합니다. 본 논문에 포함된 세부 사항은 재현성에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 이 그룹의 특정 결찰 유발 치주염 마우스^모델 11,12,13,18,19,21에 대한 연구의 경험에 의해 뒷받침됩니다. 3D 프린팅 도구의 설계, 개발 및 조립에 대한 구체적인 설명과 뼈 파괴를 정량화하는 단계별 가이드가 제공됩니다. 여기에 제시된 정보는 단순화된 결찰 유발 치주염 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
블레이드	인테그라	4-315C	15C 블레이드
세라믹 비즈	VWR	10158-608	0.5 mL x 1.4 mm 세라믹 비즈
접착제/수지 재료	고릴라 글루 컴퍼니	8401519
합자 홀더 (노치 포함)	채플힐 캠퍼스의 UNC BeAM 디자인 센터 시설 핵심	해당되지 않음	118.01 mm x 13 mm x 13.74 mm
결속 홀더 잠금장치	채플힐 캠퍼스의 UNC BeAM 디자인 센터 시설 핵심	해당되지 않음	17.5 mm x 14.57 mm x 17.8 mm
Lulzbot mini v1.0 3D 프린터	룰즈봇 (파고 첨가 제조 장비 3D, LLC)	해당되지 않음	Aleph Objects, Lulzbot Mini v1.0 모델
마이크로뷰 소프트웨어	패럴랙스 혁신	2.5.0-3139	골 측정에 사용되는 소프트웨어
마우스 치과 침대 (홈 있음)	채플힐 캠퍼스의 UNC BeAM 디자인 센터 시설 핵심	해당되지 않음	103.86 mm x 196.85 mm x 50.99 mm
마우스 덴탈 침대 상판	채플힐 캠퍼스의 UNC BeAM 디자인 센터 시설 핵심	해당되지 않음	99.8 mm x 77 mm x 21.5 mm
폴리락틱산(PLA) 필라멘트	그대로	55259	3.0 mm PLA
Rapidpure RNA 조직 키트	MP 생의학	112721050
메스 칼날 손잡이	바드-파커	371030	15C 메스 칼날 손잡이
봉합 실크	로보즈 외과 기기	SUT-15-1
Taqman qPCR 프라이머	써모피셔	랭크 (Mm00437135_ m1), 랭클 (Mm00441906_ m1), 옵 (Mm00435452_ m1), 가프드 (Mm99999915_g 1)
VX-765	그리고 nbsp; 인비보젠, 미국 샌디에이고	#inh-VX765-1	숙주 조절에 사용되는 카스파제-1 억제제