방법 논문

인간 신생아 기도 상피 세포에 대한 고산소증 효과를 평가하기 위한 번역 3D 세포 배양 모델

1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65913

⸱

2024년 7월 12일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

이 논문에서

요약

신생아 기관 기도 상피 세포(nTAEC)를 활용하여 공기-액체 계면(ALI) 배양 모델을 확립하고 생리학적으로 관련된 고산소 노출을 수행하여 발달 중인 신생아 기도 표면 상피에서 파생된 세포에 대한 대기 유도 산화 스트레스의 영향을 연구하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

조산 신생아 기도 상피는 환경 스트레스 요인에 지속적으로 노출됩니다. 폐 질환이 있는 신생아의 이러한 스트레스 요인 중 하나는 고산소증(>21% O2)이라고 하는 주변 대기보다 높은 산소(O2) 장력을 포함합니다. 기도에 대한 과산소증의 영향은 기도의 발달 단계, 과산소증의 정도, 노출 기간을 포함한 다양한 요인에 따라 달라지며, 다양한 노출은 잠재적으로 고유한 표현형으로 이어질 수 있습니다. 고산소증이 신생아 폐폐포 제거 및 기도 과민성에 미치는 영향에 대한 광범위한 연구가 있었지만, 인간 신생아 기도 상피 세포에 대한 고산소증의 장단기 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 그 주된 이유는 인간 신생아 기도 상피 발달 및 기능을 연구하기 위한 효과적인 체외 모델이 부족하기 때문입니다. 여기에서는 인간 신생아 기관 흡인을 활용하여 인간 신생아 기관 기도 상피 세포(nTAEC)를 분리 및 확장하고 이러한 세포를 공기-액체 계면(ALI) 배양에서 배양하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 nTAEC가 ALI 배양에서 성숙한 편광 세포-단층을 형성하고 점액섬모 분화를 겪는다는 것을 보여줍니다. 또한 특수 인큐베이터를 사용하여 ALI 배양에서 세포 단층의 중등도 고산소 노출 방법을 제시합니다. 또한, 형광 정량화를 사용하여 ALI 배양에서 고산소 노출 후 세포 산화 스트레스를 측정하기 위한 분석을 설명하며, 이를 통해 중등도의 고산소 노출이 세포 산화 스트레스를 유발하지만 심각한 세포막 손상이나 세포사멸을 일으키지 않음을 확인합니다. 이 모델은 잠재적으로 신생아 집중 치료실(NICU)의 신생아 기도에서 발생하는 임상적으로 관련된 고산소증 노출을 시뮬레이션하는 데 사용할 수 있으며 신생아 기도 상피 프로그래밍에 대한 O2의 단기 및 장기 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델을 사용하는 연구는 이전 미숙아의 장기 기도 질환 발병과 관련된 기도 발달에 대한 조기 산화 손상을 완화하는 방법을 모색하는 데 활용될 수 있습니다.

서론

치료용 산소(O2)는 신생아 집중 치료실(NICU)에서 가장 많이 사용되는 치료법 중 하나입니다1. 결과적으로, 고산소증 노출(>21% O2)은 심각한 폐 질환이 있거나 없는 신생아가 직면하는 일반적인 대기 스트레스 요인입니다. 고산소증에 대한 폐 반응은 노출 강도 및/또는 지속 기간, 해부학적 위치, 세포 유형 및 폐 발달 단계에 따라 달라질 수 있다 2,3,4,5,6. 신생아 고산소증 폐 손상에 대한 대부분의 연구는 조산아에게 영향을 미치는 가장 흔한 만성 폐 질환인 기관지폐이형성증(BPD)을 모델링하기 위한 출생 후 폐포 정화술의 맥락에서 고산소 노출의 영향에 초점을 맞추고 있습니다 6,7,8,9,10,11. BPD 중증도는 호흡 지원의 양에 따라 분류되며, 월경 후 36주에 필요한 O2 9. BPD를 가진 대부분의 아기는 폐가 계속 성장함에 따라 시간이 지남에 따라 임상적으로 개선되며, 대다수는 첫 번째 생일 전에 호흡 지원을 중단합니다12,13. 출생 후 BPD의 중증도에 관계없이, 이전 조산아에게 영향을 미치는 중요한 질병에는 취학 전 쌕쌕거림, 천식, 소아기 내내 재발하는 호흡기 감염, 조기 발병 만성 폐쇄성 폐질환의 위험이 5배 증가 등이 있습니다 12,14,15,16,17,18,19. 조산아의 장기 기도 질환 및 폐 감염에 대한 고산소증의 영향은 시험관 내 및 생체 내 동물 모델 20,21,22,23,24를 사용하여 조사되었습니다. 그러나 이러한 모델의 대부분은 중간엽 조직, 폐포 상피 및 기도 평활근의 역할에 초점을 맞췄습니다 25,26,27,28.

기도 표면 상피는 기관에서 말단 세기관지까지 뻗어 호흡기의 전체 경로를 따라 늘어서 있으며, 폐포29 수준 직전에 끝납니다. 기도 기저 세포는 기도 상피의 주요 줄기 세포로, 섬모 세포와 분비 세포(곤봉 세포: 비점액 생산, 배상 세포: 점액 생산)를 포함하는 성숙한 기도 상피 계통의 전체 레퍼토리로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있습니다29,30,31,32. 신생아 고산소성 폐 손상과 관련된 세포 배양 연구는 대부분 성인 인간 또는 마우스 암 세포주를 사용했습니다33,34. 또한, 대부분의 시험관 내 실험은 수중 배양 시스템을 사용했는데, 이는 세포가 인간의 생체 내 기도 상피와 유사한 점액섬모 기도 상피로 분화되는 것을 허용하지 않습니다35. 결과적으로, 인간 신생아의 기도 상피 세포 발달에 대한 고산소증으로 인한 폐 손상의 영향에 대한 지식의 격차가 있습니다. 한 가지 이유는 대기 노출이 인간 신생아 기도 상피에 미치는 영향을 연구하기 위한 번역 모델이 부족하기 때문입니다. 어릴 때 고산소증으로 인한 폐 손상은 장기적인 기도 질환을 유발하고 감염 위험을 증가시켜 이전의 조산아의 삶을 변화시키는 결과를 초래할 수 있다 14,36,37. 중증 BPD를 앓고 있는 비생존 영아의 경우, 기도 표면 상피는 배상세포 증식증 및 섬모 발달 장애를 포함한 뚜렷한 이상을 보이며, 이는 비정상적인 점액 섬모 청소율 및 기도 구경을 손상시키는 상피 높이 증가를 나타냅니다38. 지난 10년 동안 출생 후 기도 상피 발달을 연구하기 위해 공기-액체 계면(ALI)에서 1차 기도 상피 세포를 배양하는 것에 대한 관심이 높아졌습니다 39,40,41,42. 그러나 신생아 기도 상피 세포의 ALI 모델은 고산소증 노출과 같은 대기 산화 환원 섭동 모델의 맥락에서 사용되지 않았습니다.

이전에 발표된 방법39을 사용하여 NICU에서 삽관된 신생아에서 얻은 신생아 기관 흡인 샘플을 활용하여 일차 신생아 기관 기도 상피 세포(nTAEC)를 성공적으로 분리 및 확장했습니다. 우리는 Rho, Smad, Glycogen synthase kinase(GSK3) 및 포유류 표적 라파마이신(mTOR) 신호전달의 억제제를 활용하여 앞서 설명한 바와 같이 이러한 세포의 확장 능력을 증가시키고 노화를 지연시켰으며, 이는 앞서39,42 nTAEC의 효율적이고 나중에 전달을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 nTAEC를 사용하여 3D ALI 배양을 설정하고 nTAEC 단층에서 고산소증 노출을 수행하는 방법을 설명합니다. Rho 및 Smad 억제는 ALI 배양의 첫 7일(ALI 0-7일) 동안 사용되며, 그 후 나머지 ALI 배양 기간 동안 이러한 억제제를 분화 배지에서 제거합니다. ALI 배양 기도 상피 세포 단층의 정점 표면은 환경43에 노출된 상태를 유지하며, 이는 대기 섭동 연구를 가능하게 하고 생체 내 고산소증에 노출된 발달 중인 신생아 기도의 병리생물학과 매우 유사합니다. 신생아 고산소성 폐 손상의 이전 세포 배양 연구(불멸 세포 또는 일차 세포에 관계없이)에서 사용된O2의 농도는 노출 기간(15분에서 10일 범위)과 마찬가지로 크게 다르며(40%에서 95% 범위) 36,44,45,46,47. 이 연구를 위해 ALI 세포 단층을 ALI 7일차부터 14일차까지 7일 동안 60% O2에 노출시켰습니다(분화 배지에서 Rho/Smad 억제제를 제거한 후). 고산소증 노출은 완전히 분화된 성숙 상피와 대조적으로 점액섬모 분화의 초기-중기 단계(ALI 7-14일)에 수행되었으며, 따라서 조산아의 생체 내 발달 기도 상피를 시뮬레이션합니다. 이 노출 전략은 생리학적으로 관련된 범위 내에서 산화 스트레스를 가하는 동시에 급성O2 독성(O2 농도가 더 높을 것으로 예상됨)의 위험을 최소화하며, 미숙아 신생아에서 상대적으로 저산소성 자궁 내 환경에서 고산소성 외부 환경으로의 전환의 임계점과 유사합니다.

프로토콜

신생아 기관 흡인 검체는 부모의 사전 동의가 있은 후에만 수집되었으며, 수집, 운송 및 보관에 사용되는 프로토콜은 오클라호마 대학교 보건 과학 센터(IRB 14377)의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다.

1. nTAEC의 분리, 패시징, ALI 배양 준비

  1. 배지 준비
    1. 억제제(BLEAM-I)를 사용한 기관지 상피 기도 배지(BLEAM): HLL 보충제 1.25mL(500μg/mL 인간 혈청 알부민, 0.6μM 리놀레산, 0.6μg/mL 레시틴), L-글루타민(6mM) 15mL, 추출물 P 2mL(0.4%, 소 뇌하수체 추출물) 2mL, TM1(1μM 에피네프린, 5 μg/mL 트랜스페린, 10 nM 트리요오드티로닌, 0.1 μg/mL 하이드로코르티손, 5 ng/mL 표피 성장 인자(EGF), 5 ng/mL 인슐린), 1 mL 항생제 용액(노르모신, 0.1 mg/mL). 일차 세포의 노화를 방지하고 확장 효율성을 개선하려면 앞서 설명한 바와 같이39와 같은 성장 인자 억제제를 추가합니다: 최종 농도가 5μM인 Y-27632(Rho-associated protein kinase 또는 ROCK 억제제), 최종 농도가 1μM인 A83-01(Smad 신호 억제), 최종 농도가 0.4μM인 CHIR 99021(Glycogen synthase kinase-3 또는 GSK3 억제제) 및 최종 농도인 Rapamycin(라파마이신 또는 mTOR의 분자 표적 억제제) 5nM의 농도. 0.22μm 공극 크기 필터를 통해 매체를 필터링합니다. 미디어 구성 요소 목록은 표 1 을 참조하십시오.
    2. 인간 기관지/기관 상피 세포(HBTEC) ALI 배지: 37°C에서 병을 해동하고 항생제 용액 1mL(Normocin, 0.1mg/mL)를 첨가하여 500mL의 HBTEC 배지를 만듭니다. 추가되면 0.22μm 공극 크기 필터를 통해 매체를 필터링합니다.
    3. 억제제가 포함된 HBTEC 매체(HBTEC-I): 위와 같이 HBTEC 매체를 준비합니다. 여과하기 전에 최종 농도가 5μM인 Y-27632와 최종 농도가 0.5μM인 A83-01을 추가합니다. 0.22μm 공극 크기 필터를 통해 매체를 필터링합니다.
      참고: BLEAM-I, HBTEC 및 HBTEC-I 배지를 4°C에서 날짜 및 라벨이 표시된 어두운 곳(호일로 포장)에 보관하고 필요한 만큼만 분취량만 예열합니다(유통 기한은 30일).
    4. HEPES/FBS: HEPES 완충 식염수 500mL와 FBS 88mL를 추가합니다(최종 농도는 15%). 첨가된 후에는 0.22μm 공극 크기 필터를 통해 용액을 여과하고 날짜 및 라벨을 표시하여 4°C에서 보관합니다.
      알림: 사용하기 전에 부분 표본과 BLEAM, HEPES-FBS 및 트립신-EDTA를 37°C(최소 30분)까지 따뜻하게 하십시오.
  2. 배양 플라스크 및 ALI 세포 배양 인서트를 804G 컨디셔닝 배지로 코팅
    1. 앞서 설명한 바와 같이 804G 세포(쥐 방광 상피 세포주) 매트릭스 조절 배지를 준비합니다39.
    2. 37°C 인큐베이터에서 최소 4시간 동안 5% CO2로 세포 배양 플라스크와 세포 배양 삽입물을 코팅합니다. 다양한 배양 플라스크 및 세포 배양 삽입물을 코팅하는 데 필요한 배지의 양은 표 2 를 참조하십시오.

2. nTAEC의 분리 및 확장과 후속 ALI 배양을 위한 준비

  1. 삽관된 신생아의 기관내관을 정기적으로 흡입하는 동안 새로운 기관 흡인(약 1mL)을 획득하고 점액 트랩에서 흡인을 수집합니다. 흡인량이 점액 트랩에 도달하기에 충분하지 않은 경우 흡입 카테터를 1-3mL의 멸균 식염수로 헹굽니다.
  2. 샘플에 라벨을 붙이고 얼음 위의 생물학적 위험 백에 보관하십시오.
    참고: 샘플은 4°C의 얼음에서 최대 24시간 동안 보관할 수 있습니다. 그러나 수율은 신선한 샘플에서 더 높습니다.
  3. NICU에서 실험실로 검체를 운반합니다. T25 플라스크를 804G 컨디셔닝 배지로 코팅하고 기관 흡인을 실험실로 운송할 때 시료 접종을 준비합니다.
  4. 생물학적 위험 백에서 점액 트랩을 제거하고 오염을 방지하기 위해 70% 에탄올로 외부 표면을 철저히 청소하십시오. 멸균 세포 배양 후드 아래에 있는 점액 트랩의 캡을 조심스럽게 엽니다.
  5. 멸균 PBS가 포함된 기관 흡입 검체를 5mL(점액 희석을 위해)로 희석하고 전체 내용물을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
  6. 튜브를 250 x g, 20 °C-23 °C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액(점액 포함)을 버립니다.
    참고: 여기에서 모든 원심분리는 달리 명시되지 않는 한 250 x g, 20 °C-23 °C에서 5분 동안 수행됩니다.
  7. 펠릿을 5mL의 BLEAM-I에 재현탁합니다.
  8. 인큐베이터에서 T25 플라스크를 제거하고 샘플을 도금하기 전에 804G 컨디셔닝 배지를 폐기합니다.
  9. 샘플을 플레이트링합니다.ampT25 플라스크에 넣고 37°C, 5% CO2 (이를 Passage 0 또는 P0라고 함)의 인큐베이터에 넣습니다.
  10. 도금 후 24시간 후에 BLEAM-I로 배지를 교체하여 부착되지 않은 세포를 세척하고 그 후에는 48시간마다 세척합니다.
    참고: 기관 흡인 샘플을 처리하고 BLEAM-I 배지에서 배양한 후 직육면체 모양의 세포는 도금 후 7-10일 후에 나타납니다. 도금 후 약 3주가 지나면 세포가 조밀하게 채워지고 후속 계양, 확장 및 보관을 위해 트립신화가 필요합니다. 조기 통과(P1 - P2) 세포는 극저온 튜브(cryotube당 500μL의 동결 매체 당2.5 x 10, 6개의 세포)에 배치되고 장기 보관을 위해 액체 질소에 보관됩니다.
  11. 37°C 수조에서 액체 질소의 동결된 세포를 빠르게 해동하고 세포 현탁액을 BLEAM-I가 들어 있는 적절한 크기의 멸균 튜브로 옮깁니다.
  12. 세포를 계수하여 트리판 블루 염색(trypan blue stain)과 자동 또는 수동 세포 계수기를 사용하여 전체 세포 수와 살아있는 세포 수를 측정한다48. 적절한 부피의 BLEAM-I로 세포 현탁액을 희석하여 최종 농도가 15mL의 세포 현탁액(T75 플라스크의 경우)에서 2.1 x 106 세포가 되도록 합니다.
    참고: T25 플라스크의 경우 일반적으로 5mL의 세포 현탁액에 있는 0.7 x 106 세포가 파종에 사용됩니다.
  13. 15mL 세포 현탁액을 T75 플라스크로 옮기고 37°C, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  14. 다음 날 아침에 미디어를 새 BLEAM-I로 교환합니다. 그런 다음 2일마다 새 BLEAM-I로 미디어를 교환합니다. 세포가 약 80%-90%가 되면 ALI 배양을 위해 트립신화할 준비가 된 것입니다.
  15. 세포 단층에 트립신-EDTA(T75) 5mL를 도포합니다.
    참고: 신선한 트립신을 사용하는 것을 잊지 마십시오. 여러 번 가열한 트립신의 사용은 피하십시오.
  16. 인큐베이터에서 37 ° C에서 5 분 동안 플라스크를 배양합니다. 그런 다음 플라스크 8x-10x의 측면을 두드려 셀을 제거합니다. 현미경 아래를 확인하여 트립신화 후 세포가 이탈되었는지 확인합니다. 플라스크에 세포의 >50%가 남아 있으면 PBS 2x로 세척하고 배양 시간을 2-3분 단축하면서 트립신화 단계를 반복합니다.
  17. 15mL의 HEPES-FBS와 피펫을 4x-5x 상하로 사용하여 반응을 중지합니다. 세포를 적절한 크기의 멸균 튜브로 옮기고 250 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
  18. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 5x-10x를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 1mL의 BLEAM-I에 세포 펠릿을 용해시킵니다.
  19. 세포를 세어 전체 셀 수와 살아있는 셀 수를 결정합니다. 세포 현탁액을 적절한 부피의 BLEAM-I로 희석하여 최종 농도가 세포 현탁액 100μl당 1 x 105 살아있는 세포가 되도록 합니다.

3. nTAEC의 ALI 문화

참고: 세포 배양 삽입물은 804G 컨디셔닝 배지로 코팅하고 다음 단계 전에 37°C, 5% CO2 에서 최소 4시간 동안 배양해야 합니다(단계 1.2 참조).

  1. 인큐베이터에서 세포 배양 삽입물이 들어 있는 24웰 세포 배양 플레이트를 제거하고 804G 컨디셔닝 배지를 폐기합니다.
  2. 각 ALI 웰의 기저외측(하부) 챔버에 BLEAM-I 1mL를 추가합니다. ALI 세포 배양 인서트의 정점 챔버에 100μL의 세포 현탁액(1 x 105 개 세포)을 추가하고 37°C, 5%CO2에서 세포를 배양합니다. 이 단계는 ALI -2일로 정의됩니다.
  3. 다음 날, 기저측(1mL) 및 정점(100μL) 챔버의 배지를 새 BLEAM-I로 교체합니다. 정점 챔버에서 매체를 변경할 때 세포 단층을 방해하지 않도록 주의하십시오. 이 단계는 ALI day -1로 정의됩니다.
  4. 다음 날, 기저외측과 치근실 모두에서 배지를 제거합니다.
    참고: 세포 배양막의 세포가 침수 상태에서 합류하는 데 2일이 걸립니다. 이 단계에서 ALI가 성립될 수 있습니다.
  5. 기저측 챔버에 HBTEC-I 배지 1mL를 추가하되 정점 챔버 배지는 공기에 노출되지 않도록 둡니다. 이 단계는 ALI day 0으로 정의됩니다.
  6. ALI 0일차부터 6일차까지 48시간마다 기저측 챔버에서 HBTEC-I 배지(1mL)를 계속 교환합니다. ALI 7일째에 원하는 수확 시점까지 일반 HBTEC 배지(억제제 없음)로 전환합니다.
    참고: ALI 배양 첫 7일 동안에는 기저외측 챔버의 배지가 정점 챔버로 누출될 수 있습니다. 이 배지는 세포층의 건강을 유지하고 세포층이 분화할 수 있도록 매일 조심스럽게 흡인해야 합니다.
  7. 분자 기술, 분석 및 분석을 위해 서로 다른 시점에서 세포, 세포 배양 삽입물 및 기저 배지를 수확합니다.
    1. 이 프로토콜의 경우, ALI 0일, 7일 및 28일에 상피 분화 마커의 qPCR 유전자 발현 분석(표준 제조업체 프로토콜)을 위해 세포를 수확합니다. ALI 0일, 7일, 14일 및 28일에 장벽 기능을 테스트하기 위해 세포 배양 삽입물을 수확합니다(아래 설명 방법).
    2. ALI 0일차 및 28일에는 상피 분화 마커를 사용한 면역형광 염색을 위해 포르말린 고정 세포 배양 삽입물을 사용합니다(이전에 발표된 프로토콜 활용)49. ALI 14일차에 젖산 탈수소효소(LDH) 방출을 위한 기저측 배지(표준 제조업체 프로토콜), 산화 스트레스 마커의 qPCR을 위한 세포 용해물, 카스파제-3 및 절단된 카스파제-3 항체(표준 제조업체 프로토콜)를 사용한 면역블롯, 산화 스트레스 분석을 위한 세포 배양 삽입물(아래 설명 방법)을 수집합니다.

4. ALI 차별화 중 장벽 기능 테스트

  1. 트랜스 상피 전기 저항(TEER) 측정
    참고: ALI 분화 중 EVOM(Epithelial Volt/Ohm Meter)을 사용하여 TEER을 측정하여 세포층 무결성을 평가합니다50.
    1. 테스트 필터 저항 값을 측정하기 전에 804G 컨디셔닝 매체 코팅 세포 배양(세포 없음)을 사용하여 배경 저항 값을 옴(Ω) 단위로 측정합니다.
    2. 테스트 필터 저항 값에서 배경 저항 값을 빼고 그 차이에 셀 성장 표면적을 곱하여 각 테스트 필터에 대한 TEER 값을 구합니다.
      TEER = (Ω티 - ΩB) x 씨
      TEER = 트랜스 상피 전기 저항(Ω.cm2)
      ΩT = 테스트 필터 저항 값(Ω)
      ΩB = 배경 저항 값(Ω)
      C = 세포 성장 표면적(cm2)
      참고: TEER 측정에 사용되는 세포 배양 삽입물은 10% 완충 포르말린으로 고정되고 면역형광 염색 및 형광 현미경 검사(아래 설명 방법)에 즉시 사용되거나 나중에 염색을 위해 4°C에서 보관됩니다.
  2. 플루오레세인 이세티오네이트 덱스트란(FITC-덱스트란) 상피 투과성 분석
    참고: ALI 분화 중 FITC-dextran(10kD 및 20kD)의 두 가지 다른 분자량을 사용하여 상피 투과성 분석을 수행했습니다.
    1. FITC-dextran 작업 용액(1mg/mL) 준비: FITC를 5mg을 측정하고 DMSO 1mL(5mg/mL)를 혼합합니다. 37°C로 예열된 HBTEC 매체에 5mg/mL 스톡을 1mg/mL 농도로 재현탁합니다. 빛으로부터 솔루션을 보호하십시오.
    2. 테스트 필터(세포 포함)를 새 12웰 플레이트로 옮기고 기저측 구획에 1mL의 HBTEC 배지를 추가합니다.
    3. 정점 격실 배지(있는 경우)를 흡입하고 250μL의 FITC-dextran 작업 용액으로 교체합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 60분 동안 배양합니다.
    4. 12웰 플레이트에서 테스트 필터(FITC-dextran 작업 용액 포함)를 제거하여 FITC-dextran 분석을 종료합니다.
    5. 12웰 플레이트에서 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브와 와류에 담긴 기저측 배지를 수집합니다.
    6. 각 튜브에서 100μL 분취액을 96웰 투명 바닥 검은색 폴리스티렌 마이크로플레이트로 3회씩 이동합니다. 배경 형광을 측정하기 위해 음성 대조군으로 100μL의 HBTEC 매체를 96웰 플레이트의 추가 웰로 옮깁니다.
    7. 490nm 여기(excitation) 및 520nm 방출 최대값을 사용하는 분광 광도계를 사용하여 형광 강도를 측정합니다.
    8. 테스트 필터 형광 값에서 평균 배경 형광 값을 빼서 보정된 형광을 구하고 값을 FITC 10 kD 및 20 kD에 대한 ALI 0일차의 보정된 형광 값에 대한 백분율로 표시합니다.

5. TriGas 인큐베이터를 사용한 고산소증 노출

  1. ALI 7일차에 실험 및 수확 요구 사항에 따라 고산소증에 넣을 세포 배양 삽입물의 수를 결정합니다.
  2. TriGas 인큐베이터의 O2 수준을 60% O2로 설정합니다. 일반적으로 O2 수준이 60%에 도달하는 데 ~30-45분이 걸립니다.
  3. O2 수준이 60%에서 안정화되면 고산소증 그룹에 할당된 세포 배양 삽입물이 있는 24웰 세포 배양 플레이트를 인큐베이터 내부에 놓고 인큐베이터 도어를 닫습니다.
    알림: 이 단계는 인큐베이터 내부의 O2 레벨이 크게 떨어지는 것을 방지하기 위해 가능한 한 효율적으로 수행해야 합니다.
  4. 고산소증에 노출된 세포 배양 삽입물의 배지를 대조군(21% O2 노출) 웰과 동일한 일정에 따라 변경합니다. 세포 배양 인서트에 배지 누출이 있는지 매일 확인하고 세포 배양 챔버로의 누출을 부드럽게 흡인합니다.
  5. 7일(ALI 7-14일) 동안 고산소증에 계속 노출됩니다. 고산소증 노출이 완료되면 ALI 14일째에 세포를 채취하거나 세포 배양 삽입물을 사용하여 분석을 수행합니다.

6. 고산소증의 영향을 평가하기 위한 산화 스트레스 분석

참고: CM-H2DCFDA 분석 키트를 사용하여 O2 노출 후 세포 배양 삽입체의 산화 스트레스 마커로 ALI 14일째에 형광 강도를 측정했습니다. H2DCFDA는 화학적으로 환원되고 아세틸화된 형태의 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF)으로, 반응성 산소종(ROS)의 살아있는 세포 투과성 지표입니다. CM-H2DCFDA는 H2DCFDA의 티올 반응성 클로로메틸 유도체로, 세포 내 구성 요소에 대한 추가 공유 결합을 촉진하여 세포 내에서 염료를 더 오래 유지할 수 있습니다. 이러한 분자는 세포 내 에스테라제의 작용에 의해 아세테이트 그룹이 제거되고 세포 내에서 산화가 발생할 때까지 비형광입니다(51). 세포 내 산화 후, 그에 따른 형광의 증가는 세포 산화 스트레스의 대리 측정으로 형광 현미경으로 측정할 수 있습니다52. 시약은 가볍고 공기에 민감하므로 빛으로부터 보호하고 가능한 한 밀폐된 상태로 유지해야 합니다.

  1. CM-H2DCFDA 분석 용액의 준비: 각 바이알에는 분말 형태의 시약 염료 50μg이 들어 있습니다. 1mM 원액을 만들려면 80μL의 멸균 DMSO를 바이알에 넣고 피펫과 잘 혼합한 다음 부드럽게 와류시킵니다. 세포 배양 삽입물에서 염료의 최종 농도가 1μM이려면 100μL PBS당 1mM 스톡 0.1μL를 추가합니다(예: 6개의 세포 배양 삽입물에 대해 600μL PBS에 0.6μL 스톡 용액 추가).
    참고 : 염료의 최종 농도는 1-5 μM 사이에서 다양 할 수 있습니다. 용량은 각 배양 조건에 맞게 최적화해야 합니다.
  2. 고산소증에 노출된 그룹 또는 정상 산소증에 노출된 그룹 모두에 대해 각 세포 배양에 1μM 염료 용액 100μL를 추가합니다. 각 치료군에서 최소 1개의 세포 배양을 음성 대조군으로 사용합니다(염료가 없는 PBS 100μL). 37 ° C에서 30 분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. PBS로 1회 세탁합니다.
  3. 슬라이드 준비: 여분의 PBS를 배출합니다. 세포 배양 삽입물을 조심스럽게 잡고 블레이드를 사용하여 세포 배양막을 천천히 잘라냅니다. 슬라이드에 장착액 1-2방울을 붓습니다. 끝이 평평한 집게로 멤브레인의 모서리를 조심스럽게 잡고 세포 쪽이 아래로 향하게 하여 마운트런트에 놓고 커버 슬립으로 덮습니다. 과도한 실장액을 제거하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 15분 동안 자연 건조시킵니다. 이제 슬라이드를 이미지화할 준비가 되었습니다.
    알림: 슬라이드 및 형광 현미경 검사의 준비는 2-3시간에 걸쳐 형광 강도가 크게 감소하므로 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.
  4. 형광 현미경 검사: Cy2(시아닌-2) 채널을 활용하는 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 세포 배양당 겹치지 않는 세 개의 개별 영역에서 이미지를 캡처합니다.
  5. 산화 스트레스의 형광 검출
    참고: 형광 현미경 검사의 이미지를 사용하여 ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/) 및 아래에 설명된 워크플로우를 사용하여 보정된 총 세포 형광(CTCF)을 측정합니다. CTCF는 고산소 증후 노출 후 세포 배양 삽입물에서 산화 스트레스에 대한 마커 역할을 하며 ImageJ 소프트웨어의 도움으로 배경 형광을 제거하여 측정합니다.
    1. ImageJ에서 현미경 이미지를 열고 사각형 도구를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 선택 영역(α)을 저장하고 ROI(관심 영역) 관리자에 추가를 선택합니다. 이 선택 영역을 이미지 전체에 사용합니다.
    2. Analyze > Set Measurements에서 측정할 매개변수를 선택하고 설정 탭에서 Area, Integrated Density 및 Mean Gray Value를 선택합니다.
    3. 각 이미지에 대해 ROI 관리자에서 동일한 선택 영역을 사용하고 분석 > 측정을 선택합니다. 적분 밀도 값은 선택한 영역의 총 형광(FT)을 나타냅니다. 팝업 창에서 측정값을 기록해 둡니다.
    4. 각 이미지에서 배경 형광(Fb)을 보정하려면 사각형 도구를 사용하여 형광등이 아닌 영역의 작은 영역을 선택합니다. 이 지역에 대한 분석 > 측정을 선택합니다. 평균 강도 값은 Fb를 나타냅니다. 팝업 창에서 측정값을 기록해 둡니다.
    5. 배경 판독값의 평균 형광 강도에 ROI의 총 면적을 곱하고 ROI의 통합 밀도 값에서 이 숫자를 빼서 CTCF를 계산합니다. 두 치료 그룹(대조군 및 고산소증)에 대한 모든 이미지에 대해 이 워크플로우를 반복합니다.
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = 보정된 총 세포 형광(A.U.)
      Ft = 총 형광
      Fb = 배경 형광
      α = 선택 영역

결과

nTAEC를 분리하기 위해 NICU에서 삽관된 신생아로부터 기관 흡인을 수집하고 추가 처리를 위해 얼음에 담긴 흡인을 실험실로 운반했습니다 (그림 1A). 기도 상피 성장 배지(Rho/Smad, GSK3 및 mTOR 억제제를 포함하는 BLEAM-I)에 기관 흡인 샘플을 파종한 후 7-10일 이내에 직육면체 세포가 나타났습니다. 14일까지 세포는 50%-60% 융합되었고, 도금 후 약 21일이 지나면 세포가 조밀하게 채워져 후속 계대 형성 및 확장을 위해 트립신화가 필요했습니다. 이러한 세포의 연속 계대(최대 P3)는 장기 보관을 위해 액체 질소에서 동결 보존되었습니다. 그런 다음 세포(≤계 3)를 ALI 배양을 위해 해동했습니다.

nTAEC는 수중 조건에서 T75 플레이트에서 약 80%-90% 포화도에 도달하면 ALI에서 배양되었습니다. ALI 0일차에 기저 세포 특이적 마커인 cytokeratin-5 (KRT5)53 및 종양 단백질 p63 (TP63)54를 사용하여 nTAEC 단층의 면역형광 염색을 수행했습니다(그림 1B). ALI 0일차에는 거의 모든 세포가 KRT5 및 TP63 양성이며, 이는 최소한의 분화를 가진 기도 기저 세포 표현형을 시사합니다. ALI가 확립된 후, TEER은 EVOM을 사용하여 측정되었으며(그림 1C) nTAEC가 성숙한 편광 세포 단층을 형성하기 시작하면서 ALI 배양의 초기 단계(ALI 0-7일)에서 급격히 증가했으며, 이후 ALI 7일과 28일 사이에 TEER이 정체되었습니다(그림 1D). 또한, 두 분자량(10 kD 및 20 kD)의 FITC-dextran을 사용하여 ALI 분화 중 세포 주위 투과성을 평가했으며 시간이 지남에 따라 형광이 전반적으로 점진적으로 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 1E). 이는 ALI 분화 과정에서 성숙한 세포-단층(cell-monolayer)이 형성되어 용질에 대한 투과성이 감소하는 것과 관련이 있습니다. 

ALI 배양 과정에서 기저 세포는 섬모 세포, 비점액 분비 클럽 세포, 점액 분비 배상 세포를 포함하는 성숙한 상피 계통으로 분화합니다39. ALI 0일차에 성숙한 상피 세포 특이적 마커의 유전자 발현 분석은 포크헤드 박스 단백질 J155 (FOXJ1, 섬모 세포 마커), 유테로글로빈56 (SCGB1A1, 클럽 세포 마커) 및 뮤신-5AC57 (MUC5AC, 배상 세포 마커; 그림 2A), 후속 증가(ALI 7일 및 28일)는 ALI 배양 동안 이러한 성숙한 기도 상피 아형으로의 분화를 시사합니다. 또한, ALI 28일차에 성숙한 상피 세포 특이적 마커를 활용하여 면역형광 염색을 수행하고, 아세틸화 튜불린58 (TUBA4A) 양성 섬모 세포(~22%), SCGB1A1 양성 클럽 세포(~13%) 및 MUC5AC 양성 배상 세포(~3%)로 구성된 정량화된 상피 분화를 수행했으며, 나머지는 KRT5 양성 기저 세포(~51%) 및 기타 희귀 세포 유형 (그림 2B)으로 구성되었습니다.

Rho 및 Smad 억제제는 ALI 배양의 첫 7일(ALI 0-7일) 동안 사용되었고, 그 후 나머지 ALI 배양 기간 동안 분화 배지에서 제거되었습니다(그림 3A). ALI 배양 중 세포 단층의 정점 표면은 공기에 노출되어 대기 섭동 연구를 가능하게 합니다. 세포 단층의 고산소증 노출은 TriGas Incubator를 이용하여 ALI 7일부터 14일까지 7일 동안 60%O2로 연속적으로 수행되었습니다. 대조군은 실내 공기(21% O2)에 노출된 별도의 인큐베이터에서 유지되었습니다. O2 노출이 기도 상피 발달 및 재생에 미치는 장기적인 결과(O2 노출 완료 후 1-2주)를 연구하려는 향후 의도를 감안할 때, O2 노출이 ALI 세포 단층을 현저히 파괴할 정도로 심각한 세포 독성 또는 막 손상을 급성으로 초래하지 않는 것이 필수적이었습니다. 세포막 손상을 평가하기 위해 ALI 14일째에 기저측 배지에서 LDH 방출을 측정했는데, 이는 고산소증과 실내 공기 처리 배양 간에 유의한 차이가 없음을 보여주었습니다(그림 3B). O2의 세포독성 효과가 nTAEC에서 세포사멸을 유도할 만큼 충분히 유의한지 추가로 평가하기 위해 ALI 14일차에 고산소증 및 실내 공기에 노출된 그룹에서 수확한 세포 용해물에 대해 총 카스파제-3 및 절단된 카스파제-359에 대한 면역블롯을 수행했습니다(그림 3C). 총 카스파제-3 발현은 두 그룹 간에 유사했으며, 절단된 카스파제-3 발현은 검출되지 않았는데, 이는 7일간의 60% O2 노출이 ALI 14일째에 nTAEC에서 세포사멸을 유도하지 않았음을 시사합니다. 또한, 양성 대조군은 세포독성제인 스타우로스포린(0.5μM, 1μM 및 2μM) 농도가 증가하는 수중 조건에서 nTAEC를 하룻밤 동안 배양하도록 설계되었습니다. total caspase-3 및 cleaved caspase-3 발현에 대한 면역 블로팅은 세포사멸의 성공적인 유도를 확인했습니다. 60%O2 노출에 의해 유도된 산화 스트레스를 측정하기 위해 ALI 14의 nTAEC 세포 단층에서 형광 강도 측정을 통한 세포 산화 스트레스 분석을 수행했습니다(그림 3D). 고산소증 노출은 실내 공기에 노출된 세포에 비해 형광 강도(보정된 총 세포 형광 또는 CTCF로 계산)를 크게 증가시켜 세포 산화 스트레스가 증가했음을 시사합니다. 항산화 유전자의 유전자 발현 분석은 ALI 14일째에 60% O2가 이러한 항산화 유전자의 상향 조절을 일으켰으며, 카탈라아제, SOD1, SOD2 및 GPX3가 유의하게 상향 조절되는 것으로 나타났습니다(그림 3E).

figure-results-1
그림 1: 신생아 기관 기도 상피 세포(nTAEC)는 신생아 기관 흡인에서 성공적으로 분리되어 공기-액체 계면(ALI)에서 배양됩니다. (A) 삽관된 신생아로부터 기관 흡인을 이용하여 분리된 nTAEC는 후속 ALI 배양과 함께 침수 상태에서 계대화되었습니다. (B) 기도 기저 세포 마커 - KRT5 (빨간색) 및 TP63 (빨간색)을 사용한 면역 형광 염색을 위해 ALI 0일에 세포를 수확했습니다. 핵은 DAPI로 파란색으로 염색됩니다. 스케일 바 = 50μm. (C) 상피 전압/옴 미터(EVOM)를 사용한 세포 배양 인서트의 트랜스 상피 전기 저항(TEER) 측정. (D) TEER은 ALI 분화 중에 측정되었습니다. 평균으로 제시된 데이터(n=2 donors, 시점당 donor당 5-10 wells). 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. (E) Fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran) trans-epithelial permeability assay는 FITC-dextran의 두 가지 다른 분자량(10 kD 및 20 kD)을 사용하여 ALI 분화 중에 수행되었습니다. FITC-덱스트란 용액(10kD 또는 20kD)을 정점 챔버에 첨가하고, 세포 배양 삽입물을 실온에서 60분 동안 배양했습니다. 기저측 챔버 매체의 형광은 96-웰 플레이트에서 분광 광도학적으로 측정되었습니다. 보정된 형광 값(day 0 값과 비교하여 백분율로 표시)을 얻기 위해 테스트 측정에서 배경 형광(HBTEC 매체)을 뺍니다. 평균으로 제시된 데이터(n=2 donors, FITC-dextran의 각 분자량에 대한 시점당 donor당 3개의 well). 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 신생아 기관 기도 상피 세포(nTAEC)는 공기-액체 계면(ALI) 배양 중에 점액섬모 분화를 겪습니다. (A) 상피 세포 특이적 마커의 qPCR 분석을 위해 ALI 0일, 7일 및 28일에 세포를 수확했습니다: 기저세포의 경우 사이토케라틴-5(KRT5), 섬모의 경우 forkhead box protein J1(FOXJ1), 곤봉의 경우 자테로글로빈(SCGB1A1), 배상세포의 경우 mucin-5AC(MUC5AC). 각 유전자의 상대적 발현은 GAPDH를 내인성 대조군으로 하는 δCt 방법을 사용하여 측정되었습니다. 평균으로 제시된 데이터(n = 3명의 공여자, 시점당 공여자당 3개의 우물). 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 통계 분석은 Tukey 사후 분석과 함께 양방향 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다(*p=0.0114, ***p=0.0005, ***p<0.0001). (B) 상피 분화를 정량화하기 위해 ALI 28일에 기저(KRT5, 빨간색), 섬모(아세틸화-튜불린 또는 TUBA4A, 녹색), 곤봉(SCGB1A1, 빨간색) 및 배상(MUC5AC, 녹색) 세포의 면역형광 염색을 수행했습니다. 핵은 DAPI로 파란색으로 염색됩니다. 평균으로 제시된 양성 세포의 비율(%)에 대한 데이터(n=2 공여자, 공여자당 2개의 세포 배양 삽입물, 슬라이드당 6-8개의 비중첩 이미지, 슬라이드당 최소 3000개의 세포 계수). 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 스케일 바 = 50μm.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 고산소증은 신생아 기관 기도 상피 세포(nTAEC)에서 세포 산화 스트레스를 유발하지만 심각한 세포막 손상이나 세포사멸을 일으키지는 않습니다. (A) Trigas incubator를 사용한 nTAEC의 고산소 노출에 대한 실험 타임라인. 산소 노출은 ALI 7일째에 분화 배지에서 억제제를 제거한 후 시작하여 7일간(ALI 7일째부터 14일) 계속되었습니다. (B) ALI 14일차에 실내 공기(대조군)와 60% O2 (과산소) 노출 그룹 사이의 세포막 손상을 평가하기 위해 LDH 방출 분석을 위해 기저측 배지를 수확했습니다. 각 그룹의 총평균을 나타내는 선이 있는 개별 데이터 포인트(보정된 흡광도)로 표시되는 데이터, 각각 공여자당 4개의 웰이 있는 검은색 원, 사각형 및 삼각형으로 표시된 n=3 기증자. 통계적 분석은 쌍체를 이루지 않은 t-검정(p=0.6184)을 사용하여 수행되었습니다. (C) ALI 14일째에 세포를 수확하고, 세포사멸(apoptosis) 마커(카스파제-3 및 절단된 카스파제-3)에 대한 면역 블로팅을 수행하여 실내 공기와 O2 노출된 nTAEC 간의 반응을 비교했습니다. 분석에 대한 양성 대조군은 수중 배양 조건에서 스타우로스포린(Stau 0.5 μM, 1 μM 및 2 μM) 또는 비히클 제어(Veh Ctrl)로 하룻밤 동안 nTAEC를 배양하여 설계되었습니다. 세포를 총 카스파제-3 및 절단된 카스파제-3 항체와 함께 면역블롯으로 수확했습니다. 치밀 측정은 α-튜불린을 하우스키핑 유전자로 사용하여 수행되었습니다. 평균으로 제시된 데이터(n=2-3명의 기증자, 기증자당 1-2개의 웰). 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 실내 공기와 60%O2 그룹 간의 총 카스파제-3 발현을 비교했습니다(p=0.4). Veh Ctrl과 Stau 노출 그룹 간의 총 카스파제-3 및 절단된 카스파제-3 발현을 비교하기 위해 일원 분산분석(One-way ANOVA)을 사용했습니다(*p<0.05, ***p<0.0005). (D) 세포 산화 스트레스에 대한 CM-H2DCFDA 분석은 ALI 14일째에 실내 공기와 O2 노출된 nTAEC에서 수확한 세포 배양 삽입물을 사용하여 수행되었습니다. 실내 공기(대조군) 및 60%O2 (고산소) 노출된 세포 배양 삽입물의 대표적인 형광 현미경 이미지가 표시됩니다. 실내 공기와 60% O2 노출 nTAEC 간의 세포 산화 스트레스를 비교하기 위해 CTCF(Corrected Total Cell Fluorescence)를 계산했습니다. CTCF 데이터는 각 그룹의 총 평균을 나타내는 선, 2명의 개별 기증자(검은색 원 및 사각형)의 6-7개의 이미지/그룹, 기증자당 2개의 웰이 있는 개별 데이터 포인트로 표시됩니다. 통계적 분석은 쌍을 이루지 않은 t-검정 *p<0.05를 사용하여 수행되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. (E) ALI 14일째에 실내 공기로부터 세포를 수확하고, 카탈라아제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 & 2 (SOD1 & SOD2), 글루타티온 퍼옥시다제 1, 2 및 3 (GPX1, GPX2 및 GPX3)을 포함한 산화 스트레스 유전자의 qPCR 분석을 위해 고산소증에 노출된 웰을 수행하였다. 각 유전자의 fold change data는 18s rRNA를 내인성 control로 하는 δCt 방법을 사용하여 측정하였다. 평균으로 제시된 데이터(n=3명의 기증자, 기증자당 2개의 우물). 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 통계적 분석은 짝을 이루지 않은 t-검정 *p<0.05, **p=0.006을 사용하여 수행되었습니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

미디어 구성 요소분량최종 집중
블림-I
BLEAM 미디어500 밀리리터
HLL 보충제1.25 밀리리터500μg/mL 인간 혈청 알부민
0.6 μM 리놀레산; 0.6 μg/mL 레시틴
L-글루타민15 밀리리터6미엠
P 추출2 mL0.4% 소 뇌하수체 추출물
TM15 밀리리터1μM 에피네프린; 5 μg/mL 트랜스페린
10 nM 트리요오드티로닌; 0.1 μg/mL 하이드로코르티손
5ng/mL 표피 성장 인자(EGF)
5ng/mL 인슐린
노르모신1 mL0.1 mg/mL
Y-27632로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다.5 μM
대답83-01로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다.1 μM
CHIR 99021로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다.0.4 μm
라파마이신로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다.5nM
(주)에이브텍
HBTEC 매체500 밀리리터
노르모신1 mL0.1 mg/mL
HBTEC-아이
HBTEC 매체500 밀리리터
노르모신1 mL0.1 mg/mL
Y-27632로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다.5 μM
대답83-01로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다.0.5 μM의

표 1: 억제제가 포함된 기관지 상피 기도 배지(BLEAM-I), 억제제가 포함된 인간 기관지/기관 상피 세포 ALI 배지(HBTEC-I) 및 HBTEC의 배지 성분.

세포 배양 플라스크/세포 배양 삽입물804G 셀 컨디셔닝 배지(mL)
T25 플라스크3 밀리리터
T75 플라스크5 밀리리터
24웰 세포 배양 인서트(0.4μm 공극 크기, 0.33cm2 표면적)400 μL

표 2: 배양 플라스크 및 세포 배양 삽입물에 필요한 804G 세포 유래 매트릭스 컨디셔닝 배지의 부피.

토론

여기에 설명된 프로토콜은 NICU에서 삽관된 신생아로부터 신생아 기관 흡인 샘플을 수집 및 처리하는 방법을 자세히 설명하고, 이전에 확립된 방법을 사용하여 이러한 샘플에서 살아있는 nTAEC를 후속 분리 및 확장하는 방법을 설명합니다39. 또한, ALI에서 nTAEC를 배양하고 TEER, FITC-dextran 분석, 면역형광 염색 및 세포 유형(즉, 기저, 섬모, 곤봉 및 잔) 특이적 마커의 qPCR 분석을 통해 시간 함수로 분화를 편광 점액섬모 기도 상피로 분화하는 방법을 설명했습니다. 이 프로토콜의 새로운 측면은 개발 중인 nTAEC 단층에 대한 중등도의 과산소(60% O2) 노출을 통해 수행되는 대기 산화 환원 섭동입니다. 우리는 7일 동안 60% O2 노출이 nTAEC에서 세포 산화 스트레스를 유발하는 것을 보여주었습니다. 또한O2 노출 전략이 심각한 세포 사멸 또는 세포막 손상을 급성으로 유발하지 않으며, 이는O2 노출이 완료된 시점 이후에도 ALI 배양에서 이러한 nTAEC를 유지할 수 있음을 보여줍니다. 따라서 이 모델은 잠재적으로 신생아 기도 상피 프로그래밍에 대한 O2 노출의 단기 및 장기 효과를 모두 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

ALI에서 nTAEC를 배양하면 밀착연접 형성 및 점액 섬모 분화를 가진 편광 기도 상피 단층의 형성을 촉진하기 때문에 기존의 수중 배양에 비해 특정 이점을 제공합니다60,61. nTAEC에 대한 이전 연구는 ALI 배양의 초기 단계(ALI 0-7일)에서 세포가 유사 성층화(pseudo-stratification, 단일 세포층이 아닌 다층으로 나타남)를 거쳐 최종적으로 두 번째 주가 끝날 때까지 성숙한 유사 성층 상피를 형성하는 것으로 나타났습니다42,62. 밀접한 접합 형성은 ALI 배양의 초기 단계에서 유사한 궤적을 따르며, TEER의 급격한 증가와 함께 나중에 안정63을 동반하며, 이는 nTAEC를 사용한 모델에서 입증되었습니다. 또한, ALI에서 배양된 기도 상피 세포는 claudin-1(밀접 접합 복합체의 구성 요소)의 발현 및 apico-lateral localization을 향상시켜 ALI 배양 중 밀접 접합의 밀봉 특성을 증가시켜 성숙한 세포 단층(mature cell monolayer)의 형성을 촉진합니다63. 이는 FITC-dextran 분석법을 사용한 모델에서 테스트한 결과 단층 투과성이 일반적으로 감소하는 추세를 보여주었던 세포 주위 투과성 감소와 상관관계가 있습니다. ALI 28일차에 섬모(TUBA4A), 클럽(SCGB1A1) 및 배상(MUC5AC) 세포 특이적 마커에 대한 면역염색을 통해 nTAEC의 점액섬모 분화 패턴을 설명했습니다. 또한, ALI 시간 경과 동안 섬모(FOXJ1), 곤봉(SCGB1A1) 및 배상(MUC5AC) 세포 특이적 마커의 유전자 발현을 수행했습니다. 다른 그룹은 전사 인자 FOXJ1이 운동성 섬모 형성에 필수적인 반면, TUBA4A는 원발성 섬모와 운동성 섬모 모두에 존재한다는 것을 보여주었습니다64,65. 이 모델에서, nTAEC의 ALI 분화 중 FOXJ1에 대한 유전자 발현 패턴은 이전 연구에서 기도 상피 배양에서 운동성 섬모가 나타나는 시간과 대략 상관관계가 있습니다64,66.

Teape 등의 최근 연구에서는 고산소증 노출이 ALI 배양에 미치는 단백질체학 및 대사체학적 효과를 평가했다67. 그러나 세포는 성인 기증자에서 유래했습니다. 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)62,68,69,70 및 최근의 COVID-19 팬데믹71에 대한 이전 연구에서는 기도 상피 반응 및 기능에서 연령과 관련된 차이의 중요성을 강조했습니다. Zhao 등은 유사한 워크플로우를 사용하여 신생아와 성인의 기도 상피 세포를 분리했으며, ALI 분화 21일 후 신생아와 성인 기도 상피 세포 간의 세포 구성에 유의한 차이가 없음을 보여주었습니다62. 그러나 RSV 감염에 대한 반응에는 뚜렷한 차이가 있었으며, 신생아 세포는 성인에 비해 RSV에 감염된 세포와 상피 손상이 더 많았습니다. 일반적으로 Zhao 등이 활용한 배양 조건은 당사보다 nTAEC에서 더 강력한 분화를 생성했으며, 섬모 세포(41% 대 22%)와 배상(10% 대 3%) 세포의 수가 더 많았습니다. 이러한 차이는 서로 다른 성장 배지의 사용에 기인할 수 있습니다. 이들의 그룹이 사용한 PneumaCult-ALI 배지(HBTEC-ALI 배지와 반대)는 섬모 세포와 배상 세포의 수가 많을수록 보다 강력한 분화를 유도하는 것으로 나타났습니다72. 이 모델에서, 섬모 세포, 곤봉 세포, 배상 세포에 대한 세포형 특이적 마커의 유전자 발현은 초기에 급격한 증가(ALI 0-7일)를 보였고 나중에 ALI 28일경에 감소했습니다. 가능한 이유는 ALI 14일 이후 분화가 정체된 것일 수 있으며, 이는 nTAEC42에 대한 이전 연구에서 입증되었습니다.

우리는 7일 동안 중등도의 과산소증(60%O2) 노출을 설명했는데, 이는 급성O2 독성의 위험이 증가하는 매우 높은O2 수준(> 80%O2)67의 사용과 비교하여 NICU에서 조산아의 실제 경험을 더 밀접하게 시뮬레이션한다고 생각합니다1, 5. 실제로, 신생아 폐 조직의 95%O2 노출은 카스파아제 활성화를 통해 세포 자멸사를 유도하는 것으로 나타났습니다73. 그러나 이러한 노출 전략은 NICU에서 O2 유발 급성 폐 손상의 결과로 만성 기관지 병리를 동반한 중증 BPD가 발생하는 신생아 중 소수에게만 해당됩니다(급성 폐 손상 모델)37. O2 요법을 현명하게 사용하는 현대 시대에 대부분의 미숙아는 그러한 높은 O2에 노출되지 않습니다. 그러나 그들은 여전히 미래의 기도 질환(발달 섭동 모델)으로 발전할 위험이 있습니다. 후자의 경우, 생애 초기의 산화환원 섭동으로 인한 손상은 처음에는 잠잠하다가 나중에 유아기 또는 그 이후에 만성 기도 질환의 형태로 나타날 수 있다37. 세포 산화 스트레스 분석을 활용한 당사의 데이터는 중등도의 고산소 노출(60% O2)이 nTAEC 세포 단층 내에서 산화 스트레스를 유의하게 증가시킨다는 것을 보여주었습니다. LDH 방출 및 세포 카스파제-3 활성화에 대한 분석은 우리의 고산소 노출 전략이 심각한 세포 사멸을 일으키지 않는다는 것을 시사했습니다. 우리가 설명하는 방법과 모델 시스템은 잠재적으로 이전 조산아의 폐 질환 발병에 대한 연결 고리로서 생애 초기에 O2에 민감한 분자 메커니즘을 밝히는 데 활용될 수 있습니다.

태아가 살아 있는 동안, 기도 상피 세포는 폐액에 잠겨서 상대적으로 저산소성 자궁 내 환경에 존재한다26. 신생아 기도 상피 세포는 빠른 전환과 분화를 겪으며 폐와 외부 세계 사이에 중요한 장벽을 형성합니다. 신생아가 출생 후 생활로 전환됨에 따라 기도 상피 세포는 상대적으로 과산소가 있는 산후 환경에 노출됩니다. 이러한 전환은 미숙아 및 임상적으로 질병을 앓고 있는 신생아에서 더욱 갑작스럽게 나타나는데, 이는 신생아 역시 일상적으로 치료의 일환으로 치료적O2를 필요로 하기 때문이며40,74 출생 후 산화적 손상의 위험이 높기 때문이다1. 고산소증이 출생 후 폐포개선에 미치는 영향은 동물모델을 사용하여 잘 규명되었지만75, 고산소증 노출이 기도 상피세포 발달에 미치는 영향은 상대적으로 연구가 부족하다38. ALI 동안 생리학적으로 관련된 고산소증 노출이 있는 인간 신생아 유래 기도 상피 세포의 사용은 본 모델에 중개적 관련성을 더합니다. 또한, 완전히 분화된 성숙한 기도 상피67이 아닌 활성 분화 및 세포 단층 형성의 초기-중기 단계에서 고산소증 노출을 사용하면 폐포7기가 아닌 폐 발달의 초기 단계(도관에서 천골)에 태어난 극도로 미숙한 신생아(임신 28주 <)의 임상 시나리오를 잠재적으로 시뮬레이션할 수 있습니다.

우리의 모델에는 인간 발달과 질병에 적용할 때 고려해야 할 한계가 있습니다. 우리는 이전에 nTAEC의 ALI 모델에 발표된 원발성 신생아 기도 상피 세포의 조건부 재프로그래밍을 사용했습니다39. 성장 인자 억제제(Rho/Smad/GSK3/mTOR)를 사용하면 이러한 세포를 더 빠르고 나중에 전달할 수 있습니다. 우리는 성장 배지에서 억제제가 없는 수중 및 ALI 조건 모두에서 nTAEC를 배양하려고 시도했습니다. 그러나 이러한 세포의 확장 및 전달은 현저히 느렸고, ALI의 세포 단층은 두 번째 주가 끝날 무렵에 누출되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 원발성 신생아 기도 상피 세포를 배양하기 위해 동일한 억제제를 사용하는 또 다른 그룹42 은 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 수행하여 이러한 억제제의 존재가 산화 스트레스, 상피-중간엽 전이 또는 세포 노화에 관여하는 유전자의 현저한 차등 발현을 일으키지 않는다는 것을 보여주었습니다. 그럼에도 불구하고, 본 연구에서는 이러한 한계를 고려하였고, 분화 배지에서 Rho 및 Smad 억제제를 제거한 후 고산소증 노출을 시행하기로 결정하였다. 이 연구에서는 nTAEC에 대한 중등도의 고산소증(60% O2) 효과만 테스트했습니다. 그러나 향후 연구에서는 등급별 고산소 노출(40%, 60% 및 95% O2)을 활용하고 nTAEC의 반응을 비교할 계획입니다. 여기에 설명된 모델은 NICU에 입원한 인간 신생아의 세포를 사용한다는 점을 감안할 때 번역적 매력이 있지만, 이는 체외 세포 배양 모델이므로 이 모델을 활용하는 중요한 결과는 상보적인 생체 내 동물 모델로 확인할 수 있습니다.

결론적으로, NICU에서 삽관된 신생아의 기관 흡인에서 분리된 신생아 기도 상피 세포를 활용하여 in vitro 3D ALI 배양 모델을 확립하는 단계별 방법을 설명했습니다. 우리는 이 모델을 사용하여 NICU의 미성숙 신생아에 대한 일반적인 환경적 모욕인 중등도의 고산소 노출의 영향을 조사했습니다. 고산소증 노출은 심각한 세포막 손상이나 세포 사멸을 일으키지 않고 세포 단층에 세포 산화 스트레스를 유발하여 ALI 배양을 계속하여O2 노출이 신생아 기도 상피 발달 및 기능에 미치는 장기적인 영향을 연구할 수 있었습니다. 이러한 방법을 활용하는 미래의 응용 프로그램은 이전의 조산아에서 흔히 볼 수 있는 고산소증으로 인한 폐 질환의 장기 발병과 관련된 조기 질병 메커니즘을 잠재적으로 밝힐 수 있습니다.

공개 사항

저자는 공개할 내용이 없으며 보고할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 Presbyterian Health Foundation(PHF) 및 Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources(U54GM104938 NIGMS의 IDeA(Institutional Development Award))에서 AG에 자금을 지원받습니다. 매사추세츠주 보스턴에 있는 하버드 의과대학 매사추세츠 종합병원의 Paul LeRou 박사와 Xingbin Ai 박사에게 일부 실험에 사용된 신생아 기증자 세포를 제공해 주신 데 대해 감사드립니다. 피규어는 Biorender로 제작되었습니다. 통계 분석은 GraphPad Prism을 사용하여 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% 완충 포르말린Fisher Scientific23-426796
1X PBS(인산염 완충 식염수) 용액, pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell 인서트, 6.5mmCorning3470
Anti-Acetylated Tubulin 항체, 마우스 단클론SigmaT7451
항알파 튜불린 항체Abcamab7291
항-사이토케라틴 5 항체Abcamab53121
BronchiaLife 상피 기도 매체(BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Cleaved caspase-3 항체세포 신호9664T
SCGB1A1 또는 클럽 세포 단백질(CC16) 인간, 토끼 다클론 항체BioVendor R& DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)Thermo ScientificC6827
Corning Cell Culture Treated T25 FlasksCorning430639
Corning U-Shaped Cell Culture T75 FlasksCorning430641U
CyQUANT LDH 세포독성 분석Thermo ScientificC20300
DAPI 용액 (1 mg/mL)Fisher ScientificEN62248
Dimethyl sulfoxide [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
Distilled waterGibco15230162
EVOM Manual for TEER MeasurementWorld Precision InstrumentEVM-MT-03-01
FBS (Fetal Bovine Serum)Gibco10082147
Fluorescein Isothiocyanate Dextran (평균 mol wt 10,000)Fisher ScientificF0918100MG
Fluorescein isothiocyanate– Dextran (average mol wt 20,00)SigmaFD20-100MG
Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Human ads-HRPSouthern Biotech1031-05
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsobed Secondary 항체, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsobed secondary 항체, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
염소 Anti-Rabbit IgG(H+L), 마우스/인간 광고-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Air-Liquid Interface (ALI) 분화 매체LifeLine Cell TechnologyLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator, 165 LThermo Scientific51030411
대용량 cDNA 역전사 키트Thermo Scientific4368814
HLL 보충제LifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/A
Invivogen Normocin - 항균 시약Fisher ScientificNC9273499
L-글루타민LifeLine Cell TechnologyLS-1013
Normal Goat SerumGibco
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 항체Santa Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman 유전자 배설 어세이: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Gene Exression 어세이: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Gene Exression 어세이: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Gene Exression 어세이: GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
Taqman 유전자 배설 어세이: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Taqman 유전자 배설 어세이: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Taqman 유전자 배설 어세이: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman 유전자 배설 어세이: KRT5Thermo Scientific
Taqman 유전자 배설 어세이: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman 유전자 배설 어세이: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Taqman 유전자 배설 어세이: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman 유전자 배설 어세이: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
PES 멤브레인이 있는 Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow 멸균 일회용 필터 장치(0.22 μ m 모공, 500 ml)ThermoScientific5660020
TM-1 Combined SupplementLifeLine Cell TechnologyLS-1055
Total caspase-3 antibodyCell signaling14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.05%), Phenol redGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris제12-541-0
imagej.nih.gov/ij/ PCN5000Hs00361185_m1호

참고문헌

  1. Torres-Cuevas, I., et al. Oxygen and oxidative stress in the perinatal period. Redox Biol. 12, 674-681 (2017).
  2. Hanidziar, D., Robson, S. C. Hyperoxia and modulation of pulmonary vascular and immune responses in COVID-19. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 320 (1), L12-L16 (2021).
  3. Amarelle, L., Quintela, L., Hurtado, J., Malacrida, L. Hyperoxia and lungs: What we have learned from animal models. Front Med. 8, 606678(2021).
  4. Mach, W. J., Thimmesch, A. R., Pierce, J. T., Pierce, J. D. Consequences of hyperoxia and the toxicity of oxygen in the lung. Nursing Res Pract. 2011, 260482(2011).
  5. Kallet, R. H., Matthay, M. A. Hyperoxic acute lung injury. Respir Care. 58 (1), 123-141 (2013).
  6. Penkala, I. J., et al. Age-dependent alveolar epithelial plasticity orchestrates lung homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 28 (10), 1775-1789 (2021).
  7. Thébaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  8. Ibrahim, J., Bhandari, V. The definition of bronchopulmonary dysplasia: an evolving dilemma. Pediatr Res. 84 (5), 586-588 (2018).
  9. Higgins, R. D., et al. Bronchopulmonary Dysplasia: Executive summary of a workshop. J Pediatr. 197, 300-308 (2018).
  10. Collins, J. J. P., Tibboel, D., de Kleer, I. M., Reiss, I. K. M., Rottier, R. J. The future of bronchopulmonary Dysplasia: Emerging pathophysiological concepts and potential new avenues of treatment. Front Med (Lausanne). 4, 61(2017).
  11. Northway, W. H., Rosan, R. C., Porter, D. Y. Pulmonary disease following respirator therapy of hyaline-membrane disease. Bronchopulmonary dysplasia. N Engl J Med. 276 (7), 357-368 (1967).
  12. Collaco, J. M., McGrath-Morrow, S. A. Bronchopulmonary dysplasia as a determinant of respiratory outcomes in adult life. Pediatr Pulmonol. 56 (11), 3464-3471 (2021).
  13. Tepper, R. S., Morgan, W. J., Cota, K., Taussig, L. M. Expiratory flow limitation in infants with bronchopulmonary dysplasia. J Pediatr. 109 (6), 1040-1046 (1986).
  14. Davidson, L. M., Berkelhamer, S. K. Bronchopulmonary Dysplasia: Chronic lung disease of infancy and long-term pulmonary outcomes. J Clin Med. 6 (1), 4(2017).
  15. Filbrun, A. G., Popova, A. P., Linn, M. J., McIntosh, N. A., Hershenson, M. B. Longitudinal measures of lung function in infants with bronchopulmonary dysplasia. Pediatr Pulmonol. 46 (4), 369-375 (2011).
  16. Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
  17. Colin, A. A., McEvoy, C., Castile, R. G. Respiratory morbidity and lung function in preterm infants of 32 to 36 weeks gestational age. Pediatrics. 126 (1), 115-128 (2010).
  18. Doyle, L. W., Ranganathan, S., Cheong, J. Bronchopulmonary dysplasia and expiratory airflow at 8 years in children born extremely preterm in the post-surfactant era. Thorax. 78 (5), 484-488 (2022).
  19. Doyle, L. W., et al. Ventilation in extremely preterm infants and respiratory function at 8 Years. N Engl J Med. 377 (4), 329-337 (2017).
  20. Brozmanova, M., Hanacek, J., Tatar, M., Strapkova, A., Szepe, P. Effects of hyperoxia and allergic airway inflammation on cough reflex intensity in guinea pigs. Physiol Res. 51 (5), 529-536 (2002).
  21. Burghardt, J. S., Boros, V., Biggs, D. F., Olson, D. M. Lipid mediators in oxygen-induced airway remodeling and hyperresponsiveness in newborn rats. Am J Respir Crit Care Med. 154, 4 Pt 1 837-842 (1996).
  22. Mazurek, H., Haouzi, P., Belaguid, A., Marchal, F. Persistent increased lung response to methacholine after normobaric hyperoxia in rabbits. Respir Physiol. 99 (2), 199-204 (1995).
  23. Onugha, H., et al. Airway hyperreactivity is delayed after mild neonatal hyperoxic exposure. Neonatology. 108 (1), 65-72 (2015).
  24. Regal, J. F., Lawrence, B. P., Johnson, A. C., Lojovich, S. J., O'Reilly, M. A. Neonatal oxygen exposure alters airway hyper-responsiveness but not the response to allergen challenge in adult mice. Pediatr Allergy Immunol. 25 (2), 180-186 (2014).
  25. Mayer, C. A., et al. CPAP-induced airway hyper-reactivity in mice is modulated by hyaluronan synthase-3. Pediatr Res. 92 (3), 685-693 (2022).
  26. Ganguly, A., Martin, R. J. Vulnerability of the developing airway. Respir Physiol Neurobiol. 270, 103263(2019).
  27. Yee, M., Buczynski, B. W., O'Reilly, M. A. Neonatal hyperoxia stimulates the expansion of alveolar epithelial type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (4), 757-766 (2014).
  28. Balasubramaniam, V., Mervis, C. F., Maxey, A. M., Markham, N. E., Abman, S. H. Hyperoxia reduces bone marrow, circulating, and lung endothelial progenitor cells in the developing lung: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292 (5), L1073-L1084 (2007).
  29. Crystal, R. G., Randell, S. H., Engelhardt, J. F., Voynow, J., Sunday, M. E. Airway epithelial cells. Proc Am Thoracic Soc. 5 (7), 772-777 (2008).
  30. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thor Soc. 15, Supplement_3 S143-S148 (2018).
  31. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  32. Whitsett, J. A., Kalin, T. V., Xu, Y., Kalinichenko, V. V. Building and regenerating the lung cell by cell. Physiol Rev. 99 (1), 513-554 (2019).
  33. Maeda, H., et al. Involvement of miRNA-34a regulated Krüppel-like factor 4 expression in hyperoxia-induced senescence in lung epithelial cells. Respir Res. 23 (1), 340(2022).
  34. Zhu, Y., Mosko, J. J., Chidekel, A., Wolfson, M. R., Shaffer, T. H. Effects of xenon gas on human airway epithelial cells during hyperoxia and hypothermia. J Neonatal Perinatal Med. 13 (4), 469-476 (2020).
  35. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol - Animal. 57 (2), 104-132 (2021).
  36. Garcia, D., et al. Short exposure to hyperoxia causes cultured lung epithelial cell mitochondrial dysregulation and alveolar simplification in mice. Pediatr Res. 90 (1), 58-65 (2020).
  37. Crist, A. P., Hibbs, A. M. Prematurity-associated wheeze: current knowledge and opportunities for further investigation. Pediatr Res. 94 (1), 74-81 (2022).
  38. Lee, R. M., O'Brodovich, H. Airway epithelial damage in premature infants with respiratory failure. Am Rev Respir Dis. 137 (2), 450-457 (1988).
  39. Amonkar, G. M., et al. Primary culture of tracheal aspirate-derived human airway basal stem cells. STAR Protoc. 3 (2), 101390(2022).
  40. Shui, J. E., et al. Prematurity alters the progenitor cell program of the upper respiratory tract of neonates. Sci Rep. 11 (1), 10799(2021).
  41. Hillas, J., et al. Nasal airway epithelial repair after very preterm birth. ERJ Open Res. 7 (2), 00913-02020 (2021).
  42. Lu, J., et al. Rho/SMAD/mTOR triple inhibition enables long-term expansion of human neonatal tracheal aspirate-derived airway basal cell-like cells. Pediatr Res. 89 (3), 502-509 (2020).
  43. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Meth Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  44. You, K., et al. Moderate hyperoxia induces senescence in developing human lung fibroblasts. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (5), L525-L536 (2019).
  45. Wang, H., et al. Severity of neonatal hyperoxia determines structural and functional changes in developing mouse airway. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307 (4), L295-L301 (2014).
  46. Ravikumar, P., et al. α-Klotho protects against oxidative damage in pulmonary epithelia. Am J Physi-Lung Cell Mol Physiol. 307 (7), L566-L575 (2014).
  47. Hartman, W. R., et al. Oxygen dose responsiveness of human fetal airway smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303 (8), L711-L719 (2012).
  48. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  49. Bodas, M., et al. Cigarette smoke activates NOTCH3 to promote goblet cell differentiation in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 64 (4), 426-440 (2021).
  50. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  51. Jakubowski, W., Bartosz, G. 2,7-dichlorofluorescin oxidation and reactive oxygen species: what does it measure. Cell Biol Int. 24 (10), 757-760 (2000).
  52. Oksvold, M. P., Skarpen, E., Widerberg, J., Huitfeldt, H. S. Fluorescent histochemical techniques for analysis of intracellular signaling. J Histochem Cytochem. 50 (3), 289-303 (2002).
  53. Hewitt, R. J., et al. Lung extracellular matrix modulates KRT5(+) basal cell activity in pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 6039(2023).
  54. Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
  55. Zou, X. L., et al. Down-expression of Foxj1 on airway epithelium with impaired cilia architecture in non-cystic fibrosis bronchiectasis implies disease severity. Clin Respir J. 17 (5), 405-413 (2023).
  56. Li, X., et al. Low CC16 mRNA expression levels in bronchial epithelial cells are associated with asthma severity. Am J Respir Crit Care Med. 207 (4), 438-451 (2023).
  57. Li, T., Wang, Y., Huang, S., Tang, H. The regulation mechanism of MUC5AC secretion in airway of obese asthma. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 68 (7), 153-159 (2022).
  58. Nekooki-Machida, Y., Hagiwara, H. Role of tubulin acetylation in cellular functions and diseases). Med Mol Morphol. 53 (4), 191-197 (2020).
  59. Creagh, E. M., Conroy, H., Martin, S. J. Caspase-activation pathways in apoptosis and immunity. Immunol Rev. 193, 10-21 (2003).
  60. Abo, K. M., et al. Air-liquid interface culture promotes maturation and allows environmental exposure of pluripotent stem cell-derived alveolar epithelium. JCI Insight. 7 (6), e155589(2022).
  61. Guénette, J., Breznan, D., Thomson, E. M. Establishing an air-liquid interface exposure system for exposure of lung cells to gases. Inhal Toxicol. 34 (3-4), 80-89 (2022).
  62. Zhao, C., et al. Age-related STAT3 signaling regulates severity of respiratory syncytial viral infection in human bronchial epithelial cells. bioRxiv. , (2023).
  63. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cellular Signalling. 65, 109421(2020).
  64. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 731-739 (2010).
  65. You, Y., et al. Role of f-box factor foxj1 in differentiation of ciliated airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L650-L657 (2004).
  66. Pan, J., You, Y., Huang, T., Brody, S. L. RhoA-mediated apical actin enrichment is required for ciliogenesis and promoted by Foxj1. J Cell Sci. 120, Pt 11 1868-1876 (2007).
  67. Teape, D., et al. Hyperoxia impairs intraflagellar transport and causes dysregulated metabolism with resultant decreased cilia length. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (3), L325-L334 (2023).
  68. Hall, C. B. Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus. N Engl J Med. 344 (25), 1917-1928 (2001).
  69. Guillien, A., et al. Determinants of immunoglobulin G responses to respiratory syncytial virus and rhinovirus in children and adults. Front Immunol. 15, 1355214(2024).
  70. Ito, K., Daly, L., Coates, M. An impact of age on respiratory syncytial virus infection in air-liquid-interface culture bronchial epithelium. Front Med (Lausanne). 10, 1144050(2023).
  71. Zimmermann, P., Curtis, N. Why does the severity of COVID-19 differ with age?: Understanding the mechanisms underlying the age gradient in outcome following SARS-CoV-2 infection. Pediatr Infect Dis J. 41 (2), e36-e45 (2022).
  72. Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
  73. Dieperink, H. I., Blackwell, T. S., Prince, L. S. Hyperoxia and apoptosis in developing mouse lung mesenchyme. Pediatric research. 59 (2), 185-190 (2006).
  74. Looi, K., et al. Preterm birth: Born too soon for the developing airway epithelium. Paediatr Respir Revi. 31, 82-88 (2019).
  75. Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (2), 233-245 (2014).

재인쇄 및 허가

태그

3D
동영상 곧 제공
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.