이 기사에서는 모기 안테나와 상악 팔프에서 화학 감각 수용체 유전자의 공간 및 세포 분해능에 대한 통찰력을 밝히기 위해 혼성화 연쇄 반응 RNA 전체 장착 형광 in situ 교잡(HCR, RNA WM-FISH)을 수행하는 데 필요한 방법과 시약을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
혼성화(hybridization) 연쇄반응 RNA Whole-Mount Fluorescence In situ Hybridization of Chemosensory Genes in Mosquito Olfactory Appendages
이 논문에서
요약
초록
모기는 치명적인 질병의 효과적인 매개체이며 후각 부속기에서 발현되는 화학 감각 수용체를 사용하여 화학적 환경을 탐색할 수 있습니다. 화학감각 수용체가 말초 후각 부속기에서 어떻게 공간적으로 조직되어 있는지 이해하면 냄새가 모기 후각계에서 어떻게 암호화되는지에 대한 통찰력을 제공하고 모기 매개 질병의 확산을 막는 새로운 방법을 알려줄 수 있습니다. 3세대 혼성화 연쇄 반응 RNA 전체 장착 형광 in situ 교잡화(HCR, RNA, WM-FISH)의 출현으로 여러 화학 감각 유전자의 공간 매핑 및 동시 발현 프로파일링이 가능합니다. 여기에서는 Anopheles 모기 안테나와 상악 손바닥에서 HCR RNA WM-FISH를 수행하기 위한 단계적 접근 방식을 설명합니다. 우리는 이온성 후각 수용체의 발현 프로파일을 조사하여 이 기술의 민감도를 조사했습니다. 설명된 HCR WM-FISH 기법이 RNA 프로브를 스펙트럼적으로 구별되는 3개의 형광단에 테더링하여 다중 연구에 적합한지 물었습니다. 그 결과 HCR RNA WM-FISH가 더듬이와 상악 팔 후각 부속기에서 여러 화학 감각 유전자를 동시에 검출할 수 있도록 매우 민감하다는 증거가 제공되었습니다. 추가 조사를 통해 이중 및 삼중 RNA 표적의 동시 발현 프로파일링에 대한 HCR WM-FISH의 적합성이 입증되었습니다. 이 기술은 변형과 함께 적용될 때 다른 곤충 종의 후각 조직이나 다른 부속지의 관심 유전자를 국소화하는 데 적응할 수 있습니다.
서론
Anopheles gambiae와 같은 모기 매개체는 복잡한 화학 세계에서 번성하기 위해 말초 후각 부속지에서 발현되는 풍부한 화학 감각 유전자 레퍼토리에 의존하며, 인간 숙주에서 나오는 행동 관련 냄새를 식별하고, 꿀 공급원을 감지하고, 산란 부위를 찾습니다1. 모기 안테나와 상악 손바닥에는 이러한 후각 부속 기관에서 냄새 감지를 유도하는 화학 감각 유전자가 풍부합니다. 리간드 개폐 이온 채널의 세 가지 주요 부류는 모기의 후각 부속지에서 냄새 감지를 유도합니다: 의무 냄새 수용체 공동 수용체(Orco)와 함께 기능하는 냄새 수용체(OR); 하나 이상의 IR 코어 수용체(IR8a, IR25a 및 IR76b)와 상호 작용하는 이온성 수용체(IR); 화학 감각 미각 수용체 (GRs), 이산화탄소 (CO2)를 검출하기 위하여 3개의 단백질의 복합물로 기능하는1,2.
RNA 형광 in situ hybridization은 내인성 mRNA3의 발현을 검출하기 위한 강력한 도구입니다.....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 자료의 고려 사항 및 준비
- 조직의 전체 마운트 또는 극저온 절편이 적절한지 결정합니다. 이 프로토콜은 냉동 절개 없이 Anopheles 모기 안테나와 상악 구개에서 RNA의 전체 마운트 in situ 이미징에 최적화되어 있습니다. 샘플이 5mm보다 두꺼우면 프로브 침투를 위해 극저온 절편을 사용하는 것이 좋습니다.
- 관심 유전자를 식별하고 적절한 데이터베이스에서 인트론 및 엑손을 포함한 염기서열을 복사합니다. 합성을 위해 유전자 염기서열을 RNA로 전사합니다.
- 상용 공급업체로부터 프로브를 구매할지 또는 실험실에서 프로브를 합성할지 여부를 결정합니다.
알림: 이 연구에서 현장 프로브는 상용 공급업체에서 구입했습니다( 재료 표 참조). 대안적으로, 이전에 보고된 바와 같이 합성될 수있다 10. 연구에 사용된 시약은 표 1에 설명되어 있습니다. 시약을 준비하는 데 필요한 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.
2. 조직 전 고정
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
Anopheles 안테나에서 화학감각 유전자의 강력한 검출
모기 후각 조직에서 화학감각 수용체의 발현을 감지하기 위해 HCR FISH 방법(그림 1)의 민감도를 조사했습니다. 암컷 아노펠레스(Anopheles) 모기 안테나에서 이전에 보고된 RNA 전사체 데이터에 따라 다양한 IR을 표적으로 하는 프로브를 생성했습니다. 4개의 독립적인 더듬이 전사체 연구의 평균 전사체 값은 Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 RPKM) 및 Ir7t (13 RPKM)가 공동 수용체 Ir25a (197 RPKM) 및 Ir76b (193 RPKM)5,11,12,13,14에 비해 안테나에 덜 풍부하다는 것을 보여주었습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
3세대 혼성화 연쇄 반응(hybridization chain reaction, HCR)은 여러 RNA 표적을 시각화할 수 있는 감도와 견고성으로 주목할 만하다8. HCR WM-FISH는 초파리, 닭, 생쥐 및 제브라피쉬의 배아뿐만 아니라 선충류 및 제브라피시의 유충에도 성공적으로 사용되었습니다 10,16,17. 모기 더듬이와 상악 손바닥은 일반적으로 자가형광이 높고 프로브 침투가 약하기 쉬우며, 이는 기존의 전체 장착 in situ 방법을 수행할 때 특히 까다롭습니다. 이러한 단점은 HCR 프로토콜에 통합된 신호 증폭 단계에 의해 감소되어 신호 대 배경 비율을 개선하고 후각 화학 수용체 mRNA 전사체를 검출할 수 있습니다(그림 2). .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
Aedes aegypti 후각 부속기에 대한 현장 교잡 프로토콜을 공유해 주신 Margo Herre와 Leslie Vosshall 연구실에 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 C.J.P.(NIAID R01Al137078), J.I.R.의 HHMI Hanna Gray 펠로우십, J.I.R.의 Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award, J.I.R.의 Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship의 지원을 받았습니다. 존스 홉킨스 말라리아 연구소(Johns Hopkins Malaria Research Institute)와 블룸버그 자선재단(Bloomberg Philanthropies)의 지원에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 증폭 버퍼 | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | 현장 혼성화 + 면역형광 | 50 mL |
| 염화칼슘 (CaCl2) 1M | 시그마-알드리치 | 21115-100ML | |
| 키티나제 | 시그마-알드리치 | C6137-50UN | |
| 키모트립신 | 시그마-알드리치 | CHY5S-10VL | |
| 디메틸 설폭사이드 (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf 튜브 | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| 펜치 | Dumont | 11251 | 번호 5 |
| 젤 로딩 팁 | Costar | 4853 | 1-200 µ L 팁 |
| 헤어핀 | 분자 기기 | 분자 기기, Inc. | 현장 혼성화 + 면역형광 | h1 및 h2 개시자 분할 |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a 프로브 | 분자 기기 | 프로브 세트 ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 프로브 | 분자 기기 | 프로브 세트 ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a 프로브 | 분자 기기 | 프로브 세트 ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d 프로브 | 분자 기기 | 프로브 세트 ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b 프로브 | 분자 기기 | 프로브 세트 ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t 프로브 | 분자 기기 | 프로브 세트 ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a 프로브 | 분자 기기 | 프로브 세트 ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind 튜브 | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind 튜브 |
| 마그네슘 클로라이드 (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| 메탄올 | 피셔 | A412-500 | |
| 뉴클레아제가 없는 물 | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D 미니 록커 |
| Orco 프로브 | 분자 기기 | 프로브 세트 ID PRD954 | |
| AGAP002560 파라포름알데히드 (20%) | 전자 현미경 서비스 | 15713-S | |
| 인산염 완충 식염수(10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| 프로브 혼성화 버퍼 | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| 프로브 세척 버퍼 | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | 현장 혼성화 + 면역형광 | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| 식염수-시트르산나트륨 (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade 다이아몬드 | Thermo Fisher | S36972 | 마운팅 솔루션 |
| 나트륨 염화물 (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | 시그마-알드리치 | 93443 | |
| Tween-20 (10%) | Teknova | T0027 | |
| 시계 유리 | Carolina | 742300 | 1 5/8" 정사각형; 투명한 |
참고문헌
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967(2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
