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방법 논문

마우스 척수 미세아교세포(Mouse Spinal Cord Microglia)의 빠르고 효율적인 농축

2.6K 조회수

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DOI:

10.3791/65961

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2023년 9월 22일

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1Epidemiology, Endocrinology & Nutrition, Mexico Children's Hospital, 2Pharmacy Department, National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute, 3Graduate Department, Dr. Eduardo Liceaga General Hospital of Mexico, 4Pain Clinic and Palliative Care, Dr. Eduardo Liceaga General Hospital of Mexico, 5General Surgery Service, Metropolitan Angeles Hospital

이 논문에서

요약

미세아교세포는 신체에서 가장 다재다능한 세포 중 하나로 간주되며, 형태학적, 기능적 적응이 가능합니다. 이들의 이질성과 다기능성은 뇌의 항상성을 유지하는 동시에 다양한 신경학적 병리와 관련이 있습니다. 여기에서는 척수 미세아교세포를 정제하는 기술에 대해 설명한다.

초록

척추는 척추동물을 정의하고 척수를 둘러싸고 보호하는 구멍인 척추관을 형성합니다. 포유류 중추신경계의 적절한 발달과 기능은 미세아교세포(microglia)로 알려진 상주 대식세포의 활동에 크게 의존합니다. 미세아교세포는 이질성과 다기능성을 나타내어 척수와 뇌 내에서 뚜렷한 유전자 발현과 행동을 가능하게 합니다. 수많은 연구에서 대뇌 미세아교세포의 기능을 탐구하여 정화 방법을 광범위하게 설명했습니다. 그러나 생쥐의 척수에서 미세아교세포를 정제하는 것은 포괄적인 설명이 부족합니다. 대조적으로, 정제되지 않은 추출물과 달리 고도로 정제된 콜라겐분해효소의 활용은 중추 신경계 조직 내에서보고가 부족합니다. 이 연구에서는 8-10주 된 C57BL/6 마우스에서 척추와 척수를 절제했습니다. 후속 분해는 고도로 정제된 콜라겐분해효소를 사용했고, 미세아교세포 정제는 밀도 구배를 이용했습니다. 세포는 유세포 분석을 위해 염색을 거쳐 CD11b 및 CD45 염색을 통해 생존율과 순도를 평가했습니다. 그 결과 평균 생존율은 80%, 평균 순도는 95%였습니다. 결론적으로, 마우스 미세아교세포의 조작은 고도로 정제된 콜라겐분해효소를 사용한 분해와 밀도 구배를 수반했습니다. 이 접근법은 상당한 척수 미세아교세포 개체군을 효과적으로 생산했습니다.

서론

척추 동물의 특징은 척추 기둥 또는 척추이며, 척추 뼈는 척추 디스크로 나뉘어 진 척추 뼈라고 불리는 일련의 분절 된 뼈로 대체되었습니다. 이러한 골성 물질의 연속은 척수를 둘러싸고 보호하는 구멍인 척추관(spinal canal)을 형성한다1. Rodentia 속의 척추는 일반적으로 7 개의 경추, 13 개의 흉추, 6 개의 요추 및 다양한 수의 꼬리 척추 2,3에 의해 형성됩니다. 척수의 길이는 척추의 길이와 비슷하며, 말단 종사는 척수를 천골에 고정하는 비신경 구조입니다. 또한, 신경 섬유는 추간공(intervertebral foramen)을 통해 빠져나간다 1.

포유류에서 중추신경계의 발달과 적절한 기능은 미세아교세포(microglia4)라고 불리는 신경계의 상주 대식세포의 활동에 결정적으로 의존한다. 미세아교세포는 처음에 뇌 상주 식세포로 기술되었지만, 최근 연구는 이러한 세포에 많은 동적 기능을 부여했습니다 5,6. 미세아교세포의 크기는 항상성에서 7-10μm입니다. 그들은 신체에서 가장 다재다능한 세포 중 하나로 간주되며 끊임없이 변화하는 환경에 형태학적으로나 기능적으로 적응할 수 있습니다7. 이들 세포는 배아 단계와 성체 단계 모두에서 높은 이질성을 나타내며8,9 성체 단계에서는 시공간 맥락에 따라 복잡한 기능적 이질성을 나타낸다10. 미세아교세포의 이질성과 다양한 기능은 척수와 뇌에서 유전자 발현과 행동을 다르게 합니다. CD11b, CD45, CD86 및 CCR9 발현은 뇌에 비해 척수에서 더 높은 것으로 나타났습니다 8,9.

대뇌 미세아교세포(cerebral microglia) 분리를 위한 여러 프로토콜이 존재한다11,12; 그러나 척수 미세아교세포(spinal cord microglia)에 대해서는 소수만이 존재한다13,14. 척수에서 미세아교세포를 정제하는 방법을 최적화하면 미세아교세포의 생리학을 발견하는 데 중점을 둔 여러 연구의 개발을 촉진할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 재현성이 높은 쥐 척수 추출과 미세아교세포의 정제를 설명하는 것을 목표로 합니다(그림 1).

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프로토콜

이 연구는 공식 멕시코 표준 NOM-062-ZOO-1999 및 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 대한 승인은 멕시코 아동 병원의 연구, 윤리 및 생물 안전 위원회(HIM/2023/006)와 멕시코 종합 병원 에두아르도 리체아가의 연구 및 생명 윤리 위원회(DI/21/501/04/62)로부터 획득되었습니다. 생후 6주에서 8주령의 C57BL/6 마우스 3마리를 멕시코 아동 병원에서 입수하여 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 환기 랙에서 격리된 조건에서 사육했습니다.

1. 재료 및 시약의 준비

  1. Ca 2+ 및 Mg2+가 없는 PBS와 Hank의 균형 소금 용액(HBSS)을 37°C로 예열합니다.
  2. HBSS 용액에 리베라아제 100μg/mL와 DNase(HBSS-LD) 4μg/mL를 보충합니다. 용액이 7.4의 생리학적 pH를 유지하는지 확인하십시오.
    참고: 척수당 1mL의 작업 용액이 필요합니다.
  3. 밀도 구배 원심분리를 위한 등장성 90% 용액(상업적으로 이용 가능, 재료 표 참조)을 준비하고 37°C로 예열합니다.
  4. 5% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)과 PBS를 결합하여 염색 완충액을 준비하고 혼합물을 얼음 위에 보관합니다.
  5. Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (1g/L) (DMEM)를 37°C로 예열합니다.
  6. DMEM 배지에 10% FBS, 2mM L-글루타민, 200U/mL 페니실린, 스트렙토마이신 200μg/mL, 암포테리신 B 500pg/mL( 재료 표 참조)를 보충하여 DMEM-S를 제조합니다.

2. 척수의 해부와 준비

  1. 펜토바르비탈을 복강내 과다 투여한 쥐를 150mg/kg으로 안락사시킨다. 70% 에탄올을 사용하여 쥐의 흉부와 등을 소독합니다.
    알림: 마우스 해부를 진행하기 전에 안락사가 성공했는지 확인하십시오.
  2. 흉요추 부위를 면도하고 접착 테이프를 사용하여 사지를 해부판에 고정합니다.
  3. 메스를 사용하여 후두부에서 천골 부위까지 등쪽 정중선을 따라 조심스럽게 절개합니다(그림 2).
  4. 입체 수술 현미경의 도움을 받아 요추에 도달하고 마지막 늑골 아치를 식별할 때까지 층으로 절개합니다.
    참고: 13개의 늑골 아치는 흉추에서 관절이 있습니다. 해부하면 L1 척추2보다 우월하게 보입니다.
  5. 마지막 경추와 천골을 결정한 다음 척추를 분리하기 위해 절개합니다(그림 2).
  6. 해부 겸자를 사용하여 척추뼈의 등쪽 후궁 절제술을 수행하여 척수를 추출합니다(그림 3A-D).
    참고: 처음 두 개의 경추(아틀라스 및 축)를 제외하고 모든 가동 가능한 척추는 다양한 영역(경추, 흉추 또는 요추)에서 공통된 형태학적 디자인을 공유합니다. 각각의 전형적인 움직일 수 있는 척추뼈는 앞쪽 끝에 원통형 척추체를 가지고 있습니다. 몸의 뒤쪽에는 척추궁(신경궁)으로 알려진 뼈 아치가 붙어 있으며, 판과 가시 돌기로 구성되어 있습니다. 이 구조들 사이에는 척추공(vertebral foramen)15이 있다.
  7. 말초 신경계를 구성하고 침윤된 대식세포를 포함할 수 있는 구멍(등쪽 및 배쪽 뿌리)을 통해 나오는 신경을 제거합니다(그림 3D).
    참고: 밀도 구배 배지가 오염된 성상교세포를 효과적으로 제거하므로 pia mater 또는 수막을 제거할 필요가 없습니다. 또한 수막을 유지하면 정제 시간이 단축되고 생존력이 향상됩니다.

3. 미세아교세포의 조직 소화 및 분리

  1. 척수를 해부판에 놓고 Vannas 가위를 사용하여 척수를 2mm 조각으로 자르면 평균 10개가 됩니다.
  2. 척수 절편을 2mL 바닥이 평평한 마이크로튜브로 옮깁니다(그림 3E,F).
  3. HBSS-LD 작업 용액 1mL를 추가합니다(1.2단계). 37°C에서 25분 동안 배양하고 5분마다 격렬하게 소용돌이칩니다.
  4. 각 분해액의 내용물을 40μm 스트레이너에 통과시킨 다음 2% FBS가 포함된 HBSS 7mL를 추가하여 분해를 중화합니다.
  5. 1mL 주사기 플런저를 사용하여 남은 조직을 분쇄합니다. 현탁액을 50mL 코니컬 튜브에 넣고 220 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  6. 1mL 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 버리고 15mL 원뿔형 튜브에 2% FBS가 있는 2mL의 HBSS에 펠릿을 재현탁시킵니다. 2mL의 90% 등장 밀도 그래디언트 배지와 결합합니다. 160 x g, 18°C에서 25분 동안 원심분리합니다.
    알림: 느린 가속을 사용하고 브레이크를 사용하지 마십시오.
  7. 이송 피펫을 사용하여 인터페이스를 회수하고 15mL 코니컬 튜브로 이송합니다. PBS 10mL로 세포를 세척하고 220 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  8. DMEM-S(1.6단계)에서 세포를 재현탁하고 얼음 위에 보관합니다.

4. 순도/생존력 결정

  1. 혈구계 챔버를 사용하여 생존 가능한 세포를 정량화하려면 0.4% Trypan blue 염색을 사용합니다( 재료 표 참조).
    참고: 평균적으로 마우스 한 대는 4-6백만 개의 세포를 제공합니다.
  2. 유세포 분석기를 통해 생존 가능한 세포를 정량화하려면 시중에서 판매되는 아민 반응성 형광 염료 염색을 사용하십시오( 재료 표 참조).
    1. 100만 개의 세포를 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥(FACS) 튜브에 이식합니다. 형광 염료를 PBS로 1:1000의 비율로 희석합니다(생존력 작업 용액 생성).
    2. 생존도 용액과 함께 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 씻습니다. 400μL의 염색 완충액에 세포를 재현탁시킵니다(단계 1.4).
    3. 4°C에서 15분 동안 얼음처럼 차가운 염색 완충액에서 2.4G2 anti-FcRIII/I( 재료 표 참조)로 세포를 차단합니다.
    4. 형광 표지 단클론 항체 CD45-PerCP 및 CD11b-eFluor 450을 염색 완충액에 첨가하여(1:300 희석) 항체 염색 칵테일을 제형화합니다( 재료 표 참조).
      참고: 두 기술을 모두 사용할 수 있지만 후속 프로토콜에 가장 적합한 기술을 선택합니다.
    5. 항체 염색 칵테일과 함께 샘플을 어두운 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 얼음처럼 차가운 염색 완충액으로 세포를 두 번 씻습니다. 400μL의 염색 완충액에 세포를 재현탁시킵니다.
    6. 6단계의 게이팅 전략에 설명된 대로 유세포 분석기에서 250,000개의 이벤트를 수집합니다(그림 4).

5. 면역형광 염색

  1. 전처리된 커버슬립을 6웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
    참고: 커버슬립을 처리하려면 500μL의 L-폴리리신(0.01mg/mL, 재료 표 참조) 용액이 있는 페트리 접시에 넣고 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 증류수로 세 번 씻고 말리십시오.
  2. 500μL의 DMEM-S 용액을 사용하여 처리된 커버슬립에 200,000개의 세포를 파종합니다. 24 시간 동안 배양하십시오.
  3. 커버슬립을 제거하고 실온에서 3.7% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 20분 동안 셀을 고정합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 커버슬립을 세 번 세탁합니다.
  4. PBS에서 0.2% Triton X-100으로 실온에서 15분 동안 세포를 투과시킵니다. 그런 다음 차가운 PBS로 커버 슬립을 세 번 씻습니다. 실온에서 1시간 동안 PBS에서 0.2% BSA로 세포를 차단합니다.
  5. 형광 표지 단클론 항체(1:300 희석, 재료 표 참조)를 차단 용액에 희석하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 커버슬립을 세 번 세탁합니다.
  6. DAPI가 들어 있는 장착 매체를 슬라이드에 부착한 다음 커버슬립으로 밀봉합니다.
    참고: 슬라이드는 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 즉시 분석하거나 -20°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다.

6. 척수 미세아교세포에 대한 게이팅 전략

  1. 점도표를 생성하고, 생존도 염색 및 빈 형광 채널(16)에 기초하여 생존 가능한 세포를 분리하기 위한 게이트를 설정한다. 생존할 수 없는 세포를 제외합니다.
  2. 파편을 제거하기 위해 전방 및 측면 산란 매개변수를 사용하여 다른 플롯을 생성합니다16.
  3. 추가 점도를 개발하고 CD11b 및 CD45의 발현을 분석하여 미세아교세포를 구별합니다.

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결과

쥐의 척수 조직을 이용하여, 콜라겐분해효소와 써모리진이 고도로 농축된 혼합물을 사용하여 효소 소화를 수행하였다. 그 결과 소화된 조직은 40μm 필터를 통과하여 소화되지 않은 물질을 제거했습니다. 수집된 세포는 퍼콜 밀도 구배를 통해 농축되었으며, 하부는 90%, 상부는 45%였습니다. 그런 다음 계면 내의 미세아교세포가 풍부한 세포를 CD45 및 CD11b 항체로 염색하고 유세포 분석을 실시했습니다(그림 1).

후두부에서 천골까지 뻗어 있는 척추의 해부는 척추 주위 근육의 노출과 해부를 포함합니다. 척추를 풀어주기 위해 늑골 아치를 노출시키고 척추 T13에서 T1까지 측정을 수행했습니다. 두개골 및 천골과 관절을 이루는 척추가 보이기 시작했고, 이를 완전히 해방시키기 위해 양쪽을 절개했습니다(그림 2).

척수의 발치는 척추...

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토론

뇌 항상성에서의 중요성 때문에 미세아교세포 연구를 위해 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. 이러한 방법에서, 미세아교세포는 전형적으로 배아 또는 신생아 쥐 및 마우스의 대뇌 반구에서 공급된다17. 제한된 수의 연구가 성체 마우스의 척수에서 미세아교세포의 정제를 다루었다13,14. 이러한 기술에는 DNAse와 함께 콜라겐분해효소 및/또는 파파인을 사용한 효소 분해가 포함되며, 종종 Percoll 또는 OptiPrep을 사용한 그래디언트 분리와 결합됩니다. 그러나, 그래디언트 분리 없이 파파인 기반 척수 소화를 사용하면 pia mater14,17을 제거한 후에도 성상교세포 오염이 발생할 수 있습니다.

이 연구는 성체 쥐 척수에서 미세아...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 702361(National Council of Science and Technology)에서 수여하는 장학금의 지원으로 이루어졌습니다. 저자는 국립 폴리테크닉 연구소(National Polytechnic Institute)의 국립 생물 과학 학교(National School of Biological Sciences)의 생물 화학 과학 박사 과정을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 수집 튜브Corning, USA430790
2 mL 마이크로튜브Axygen, USAMCT-200-G
2.4G2 anti-FcRBioLegend, 미국101302
50 mL 수집 튜브Corning, USA430829
70% 에탄올
항생제-항진균제(페니실린, 스트렙토마이신, amphotericin b)Gibco, USA15240062
항체 CD11b eFluor 450 anti-mouseeBioscience, USA48-0112
항체 CD45 PerCP anti-mouse   BioLegend, 미국103130
평형 소금 용액 (PBS) 칼슘 - 마그네슘 프리Corning, 미국46-013-CM
블루 셀 스트레이너 40 μ mCorning, USA352340
Costar 6-well Clear 미처리 미국 코닝CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath Thermo Scientific Digital HS Drybath, 미국88870001
의미세 수술용 겸자 해부
s 변형 독수리&급성; s 중고 포도당(DMEM) Merck, USAD6429
전기 면도기
FACS 튜브Thermo, USA352058
Fetal bovine serum (FBS)PAN Biotech, AlemaniaP30-3306
플로우 사이토미터 Cytoflex 베크먼 쿨터
행크 S 균형 잡힌 소금 용액 Merck, 미국H2387
L-글루타민Corning, 미국 
리베라제 TM Roche, 미국5401119001
Neubauer 챔버 계수 챔버중국1103
Pentobarbital
Percoll Merck, 미국17089101밀도 구배 원심분리 
폴리-L-라이신 용액 Merck, 미국P8920
메스 No. 25 HERGOM, 멕시코H23
Snaplock 마이크로 원심분리기 튜브 2mLAxygen, 미국10011-680
실체 현미경Velab, 멕시코HG927831
스트레이트 수술용 가위(10cm)HERGOM, 멕시코
스트레이트 바나스 가위HERGOM, 멕시코
Triton X100Merck, 미국X100
트리판 블루 스테인 0.4% Merck, USA15250-061
Vortex mixerDLAB, 중국8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend, 미국423102아민 반응성 형광 염료 염색 
DUMONT DNase Roche, 미국 4536282001 Dulbecco´;15393631

참고문헌

  1. Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
  2. Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
  3. Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205(2007).
  4. Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
  5. Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
  6. Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  7. Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  8. de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  9. Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504(2019).
  10. Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  11. Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
  12. Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
  13. Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
  14. Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
  15. Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
  16. Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
  17. Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  18. Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
  19. Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).

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