에티올레이트 옥수수 잎 원형질체에 대한 자동화된 액체 취급을 사용하여 고처리량 이식유전자 발현 연구 가능

Summary

이 프로토콜은 자동화된 liquid handler를 사용한 무작위 transfection 레이아웃, etiolated maize leaf에 대한 protoplast 분리 프로토콜 및 liquid handler를 사용한 96-well transfection 절차의 생성을 설명합니다.

Abstract

식물 생명 공학 분야는 최근 몇 년 동안 놀라운 발전을 목격하여 다양한 목적을 위해 식물을 조작하고 엔지니어링하는 능력에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 이 분야의 연구가 다양해지고 점점 더 정교해짐에 따라 안정적인 혁신으로 나아가는 전략을 좁히기 위해 조기에 효율적이고 신뢰할 수 있으며 처리량이 많은 과도 스크리닝 솔루션의 필요성이 더욱 분명해지고 있습니다. 최근 몇 년 동안 다시 등장한 한 가지 방법은 식물 원형질체(protoplast)를 활용하는 것으로, 이를 위해 수많은 종, 조직 및 발달 단계에서 분리 및 형질주입 방법을 사용할 수 있습니다. 이 연구는 96웰 플레이트 내에서 플라스미드를 무작위로 준비하기 위한 간단한 자동화 프로토콜, 에티올레이트 옥수수 잎 프로토플라스트의 분리 방법 및 자동화된 transfection 절차를 설명합니다. 식물 생명공학에서 자동화 솔루션의 채택은 식물 원형질체 형질주입을 위한 이러한 새로운 액체 처리 프로토콜로 대표되며, 이는 수동 방법에 비해 상당한 발전을 나타냅니다. 자동화를 활용함으로써 연구원들은 기존 방법의 한계를 쉽게 극복하고 효율성을 높이며 과학적 발전을 가속화할 수 있습니다.

Introduction

세포벽이 없는 식물 세포에 외부 유전 물질을 도입하는 식물 원형질체 형질주입(transfection)은 중추적인 기술이며, 지난 반세기 동안 식물 생명공학 연구를 지원하기 위해 수많은 종을 포괄하고 있습니다. 그러나 이러한 방법의 활용은 고통스럽고 범위가 제한적일 수 있으며, 분리당 수백만 개의 원형질체가 생성되더라도 가능합니다. 기존의 식물 원형질체 transfection은 종종 힘들고, 시간이 많이 걸리고, 변동성이 발생하기 쉽고, 기술적으로 까다롭기 때문에 재현성이 낮은 틈새 시스템을 만들 수 있습니다¹. 그러나 최근 몇 년 동안 자동화된 솔루션이 도입한 잠재력은 60년 된 이 기술에 새로운 생명을 불어넣을 수 있는 가능성을 보여줍니다 ^2,3. 재료 준비, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 배양 및 후속 트랜스펙션 시약 분주와 같은 중요하지만 반복적인 단계를 자동화할 수 있는 잠재력을 통해 연구원들은 물리적 취급 요구 사항 및 기타 인적 오류의 잠재적 원인을 크게 줄일 수 있습니다⁴. 또한 자동화된 액체 취급 시스템이 제공하는 정밀한 제어와 균일성은 일관되고 재현 가능한 transfection 결과를 보장합니다.

원형질체 분리는 절단, 분해, 배양, 여과 및 원심분리를 포함하는 세심한 공정이지만, 이러한 프로토콜의 transfection 부분은 자동화된 liquid handler를 위해 맞춤 제작되었습니다. 대부분의 protoplast transfection 프로토콜에 대한 절차는 PEG 매개 절차이며, PEG와 정제된 plasmid DNA가 있는 상태에서 분리된 protoplast를 정확한 농도(종 및 조직에 따라 다름)로 지정된 기간 동안 혼합하면 이러한 세포가 plasmid DNA를 흡수할 수 있습니다⁵. 이 형질주입 후에는 일련의 세척 단계가 이어지며, 하룻밤 동안의 배양6으로 절정에 이^릅니다. 잠복기 후 모든 것이 적절하게 설계되고 전달되면 실험은 관심 성분의 발현 및/또는 다른^{조절 성분을} 평가할 수 있는 잠재력 7을 나타냅니다. 이 절차와 관련된 모든 흡인, 분주 및 교반/혼합 단계는 일반적으로 수동 피펫으로 처리됩니다. 이러한 프로토콜을 한 번에 하나의 개별 반응으로 수동으로 실행하는 것은 힘들고 샘플 간에 불필요한 변동을 유발하는 동시에 주어진 시간에 평가할 수 있는 용량을 제한합니다. 제약 산업에서 포유류 또는 곤충 세포의 조작 및 화학 합성을 위한 자동화된 프로토콜은 수년 동안 실제로 사용되어 왔습니다 ^4,8,9. 식물 물질의 자동화된 액체 취급과 관련된 원형질체 활용 및 프로토콜이 증가하고 있습니다 10,11,12,13.

식물 프로토플라체 transfection을 위한 자동화된 액체 취급 프로토콜의 채택은 연구 응용 분야에 큰 가능성을 제시합니다. 연구자들은 더 큰 유전자 라이브러리를 탐색하고, 빠른 속도로 특정 유전자 기능을 스크리닝하고, 식물 스트레스와 관련된 복잡한 유전적 상호 작용을 보다 포괄적으로 조사할 수 있다¹⁴. 형광 스크리닝과 결합된 96웰 포드를 활용하는 자동화된 접근 방식의 확장성을 통해 고처리량 실험이 가능해지고 과학자들은 식물 생명공학 발전을 촉진할 수 있는 데이터와 통찰력을 신속하게 생성할 수 있습니다¹¹. 그러나 이러한 처리량 증가로 인해 수천 개는 아니더라도 수백 개의 데이터 포인트가 생성됨에 따라 결과를 혼동시킬 수 있는 오류 원인을 설명하는 추가 품질 관리가 있어야 합니다¹⁵. 수많은 과학 분야에서 기여 요인으로 확인된 한 가지 요소는 엣지 효과(edge effect)입니다. 일부 완화 전략은 이러한 현상을 방지하기 위해 우물 간 공간 또는 가장 바깥쪽 우물을 사용하거나 채우는 데 가장 적합한 플레이트를 제안할 것입니다^16,17. 그러나 이러한 전략은 시간을 추가하며, 특정 일회용품을 사용할 수 없는 경우 유일한 옵션은 더 적은 것으로 만족하거나 연기하는 것입니다. 또는 차단 체계를 통해 이러한 효과를 설명하는 전략을 살펴보는 것은 처리량을 희생하거나 실행을 지연시키지 않습니다.

이 etiolated maize leaf protoplast 프로토콜과 그림 1 에 예시된 두 가지 자동화된 방법은 canonical protoplast 방법의 여러 부분, transfection에 사용되는 vessel에 plasmid 물질의 할당 및 transfection 자체를 자동화하여 protoplast 실험에 내재된 가변성을 해결하려고 합니다. 이러한 방법은 에티올레이트 옥수수 잎 프로토플라스트 플랫폼에 대해 입증되었는데, 이는 잘 특성화되고 간단하며 효율적인 프로토플라스트 플랫폼이기 때문입니다. 여기에 자세히 설명된 모든 단계는 유사하거나 동일한 완충액을 사용하는 protoplast transfection 프로토콜에 즉시 액세스할 수 있습니다. 그러나 이러한 기술을 채택하기 전에 원형질체 출처 조직 및 종의 고유한 특성에 대한 특별한 주의를 기울여야 합니다. 자동화를 통한 이러한 개선은 개별 실험을 위한 재료 준비를 단순화하고 1:1 순차 transfection에서 동시에 처리되는 96개의 transfection에 이르기까지 처리량을 크게 향상시킵니다. 이 작업은 또한 플레이트 위치 편향을 설명하기 위해 무작위 불완전 블록을 사용하는 것에 대한 정당성을 보여줄 것입니다.

Protocol

1. Transfection 플레이트 생성

1. 데크 레이아웃 생성: DNA 플레이트 무작위 지정 방법을 생성하려면 액체 처리기 소프트웨어를 엽니다. 메뉴 모음에서 New Method(새 메서드) 버튼을 클릭하여 새 메서드를 만듭니다. 왼쪽 패널의 Instrument Setup 버튼을 눌러 Start 라인과 Finish 라인 사이에 Instrument Setup 라인을 추가합니다.
   참고: 이 자동화된 프로토콜과 함께 제공되는 관련 스크린샷은 보충 그림 1, 보충 그림 2 및 보충 그림 3에서 찾을 수 있습니다.
2. Instrument Setup 라인을 클릭하고, Labware 범주 메뉴에서 올바른 labware를 찾은 다음, 보충 그림 1과 같이 데크 레이아웃으로 드래그합니다.
   참고: 실험기구가 사전에 정의되지 않은 경우 제조업체의 사양에 따라 액체 처리기에 프로그래밍해야 하지만 이러한 지침은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다.
3. 파일 설정에서 전송: 단계 팔레트에서 Transfer From File 버튼을 누르고 Transfer From File 라인을 Instrument setup 라인 아래에 놓습니다. 팁 선택 및 교체가 보충 그림 3에 표시된 것과 같은지 확인하십시오.
4. 파일에 헤더 행이 있는지 확인하고 열 정보가 올바른지 확인합니다.
5. Source area를 눌러 활성화하고 데크 레이아웃에서 Source Plate를 클릭하고, 타겟 플레이트를 정의하고, 파이펫팅할 DNA의 양을 입력합니다.
6. Customize 버튼을 눌러 피펫팅 기법을 자세히 정의하십시오(예: 벽의 팁 터치).
7. 전달할 플라스미드 DNA의 양을 지정합니다. 이 프로토콜은 transfection(well)당 20 μL의 1 μg/μL plasmid DNA를 사용합니다.
   참고: protoplast transfection 전에 transfection plate로 전달되는 plasmid DNA의 양은 사용하는 protoplast 플랫폼에 따라 달라집니다.
8. 파일에서 전송 .csv 문서를 만듭니다.
   1. 이 문서는 두 개의 열로 구성되어 있습니다. 첫 번째 열, 즉 튜브 랙 내에서, 즉 샘플 1에 대한 스톡 플라스미드 DNA의 위치를 나타내는 From 열을 준비합니다. 이것은 잘 A01이 될 것입니다. 이 전송이 세 번(3회) 발생하므로 세 개의 행은 From 열에서 A01을 나타내야 합니다.
   2. 두 번째 컬럼, 즉 To 컬럼을 준비하여 96웰 플레이트의 플라스미드 구성 목적지 웰을 지정하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 샘플 1(A01)은 B02, D04 및 H07일 수 있습니다. 이것을 액체 처리기 소프트웨어와 호환되도록 .csv 파일로 저장하십시오.
9. 프로토콜을 실행하기 전에 데크 위치가 로드되었는지, 실험기구가 올바르게 정의되었는지, 무작위 배정 문서에 튜브 랙의 모든 샘플 DNA에 대한 웰 위치가 포함되어 있는지, 튜브에 프로토콜을 실행하기에 충분한 플라스미드 샘플이 있는지 확인하십시오.
10. Transfer From File(파일에서 전송) 단계의 File Properties(파일 속성 ) 메뉴를 확장하고 생성된 .csv 파일을 선택하고 프로토콜을 실행합니다.
11. 프로토콜이 성공적으로 완료되면 transfection 플레이트를 알루미늄 호일 씰로 덮습니다. 사용할 준비가 될 때까지 -20°C에서 트랜스펙션 플레이트를 보관하십시오. 분리된 etiolated maize leaf protoplast는 3.3단계에서 이 transfection plate에 추가됩니다.

2. Etiolated 옥수수 잎 protoplast 격리

1. 에티올화된 옥수수 잎 프로토플라스트의 분리를 시작하기 위해, 여기에 사용된 NP222와 같은 프로토플라스트 호환 유전적 배경을 얻는다¹⁸. 실험 시작 전에 표 1 에 나열된 3개의 완충액, 즉 MMg, W5 및 WI 완충액만 준비하고 4°C로 유지합니다. 최상의 결과를 위해 실험 당일에 소화 용액과 PEG를 준비하십시오.
2. 먼저 25개의 씨앗을 25% 상업용 표백제 용액에 담그고 실온에서 약 15-20분 동안 회전식 플랫폼 셰이커에서 흔들어 표면 살균합니다.
3. 교반 후 멸균수(DI)를 사용하여 씨앗을 철저히 헹굽니다. 헹굼 단계를 5회 반복합니다. 씨앗을 실온에서 밤새 멸균 된 물에 흡수하십시오.
4. 다음 날 촉촉한 오토클레이브 토양에 씨앗을 파종합니다. 곰팡이 오염을 방지하기 위해 토양에서 과도한 수분을 흡수하기 위해 건조 점토 펠릿을 추가하십시오.
5. 옥수수 묘목을 28 ° C (상대 습도 (RH) 30 %)의 16 시간 광 성장 챔버에서 coleoptile이 토양에서 1-2cm 위에 올 때까지 약 3 일 동안 재배 한 다음 추가로 5-7 일 동안 동일한 온도와 RH의 어두운 챔버로 옮깁니다.
6. 첫 번째 잎 조직을 첫 번째 고리 바로 위로 잘라 수확합니다.
7. 25% 상업용 표백제와 250μL의 20% Tween 20 용액에서 1분 동안 잎 조직을 잠시 표면 살균합니다. 잎 재료를 DI 물로 5번 철저히 헹굽니다.
8. 보푸라기가 없는 티슈로 옥수수 잎 조직을 두드려 말리고(부드럽게) 날카로운 칼날을 사용하여 각 잎 잎의 끝과 바닥에서 ~1.5cm를 제거합니다.
9. 남은 잎 조직을 좁은(0.5mm - 1mm) 가로 스트립으로 자르고 100 x 25mm 페트리 접시에 넣습니다.
10. 0.22μm 주사기 필터를 통해 25mL의 분해 용액을 얇게 썬 조직이 들어 있는 페트리 접시에 직접 필터 멸균합니다.
11. 약 -75mbar 압력의 진공 데시케이터에서 실온에서 30분 동안 진공을 적용하여 소화액으로 잎 조직에 진공을 침투시킵니다.
    참고: 수많은 학술 및 개인 실험실의 실내 진공 압력은 이 단계에 충분해야 합니다.
12. 회전식 플랫폼 셰이커에 놓고 25°C의 어둠 속에서 60RPM으로 2.5-3시간 동안 흔듭니다. 분해 시간이 끝날 때까지 10분이 남았을 때 속도를 90RPM으로 높입니다.
13. 소화 용액과 소화되지 않은 식물 물질을 40μm 체 필터 상단의 깔때기를 통해 50mL 튜브에 붓습니다.
14. 50mL 튜브 내부의 용액을 150 x g 에서 4분 동안 원심분리하여 프로톱플라스트를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 10 - 15 mL의 MMg Buffer 용액에 재현탁시킵니다.
15. 원심분리를 반복하고 상층액을 제거합니다. 5 - 10 mL의 새로운 MMg 완충액에 재현탁합니다.
16. 혈구계를 사용하여 분리된 원형질체의 밀도를 주의 깊게 측정합니다. 대략 5 x 10 mL당⁵ 프로토플라스트의 밀도로 재현탁합니다.
17. transfection하기 전에 격리물을 얼음 위에서 ~30분 동안 그대로 두십시오. 이 시간 동안 PEG 용액을 준비합니다. 37°C 수조를 사용하여 PEG를 용액에 완전히 용해시키고 transfection까지 그대로 둡니다.

3. 자동화된 protoplast transfection

참고: 3.6단계부터 3.15단계까지는 수동 원심분리가 필요한 3.10단계와 3.13단계에서 두 번의 사용자 일시 중지를 제외하고 자동 액체 처리기에 의해 완전히 관리됩니다. 이 자동화된 프로토콜과 함께 제공되는 관련 스크린샷은 보충 자료, 보충 그림 1, 보충 그림 3, 보충 그림 4 및 보충 그림 5에서 확인할 수 있습니다.

1. 다음 단계에 설명된 protoplast transfection 방법에 따라 transfection을 위해 liquid handler의 데크 레이아웃을 준비합니다. 다음 재료를 조립합니다: 목적지 플레이트(이 경우 형광 측정을 위한 투명한 바닥 마이크로플레이트가 있는 96웰 블랙), PEG 흡입 단계를 위한 25 - 250 μL 광폭 구경 자동화 팁 1상자, 나머지 액체 처리 단계를 위한 25 - 250 μL 피펫 자동화 팁 5상자, 시약 저장소로 사용되는 플라스틱 트로프 3개, 폐기물 수거를 위한 빈 96웰 플레이트 1개, 잔여 트랜스펙션 완충액 세척 용액, W5 및 WI.
2. transfection 절차가 시작되기 직전에 0.22μm 멸균 일회용 진공 필터 장치를 통해 PEG 용액을 새 50mL 튜브로 필터 멸균합니다.
3. MMg 완충액에 재현탁된 프로토플라스트에서 100μL(약 50,000개의 프로토플라스트)를 사전 준비되고 해동된 트랜스펙션 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 이를 위해 프로토플라스트 함유 완충 용액을 멸균 10mL 트로프에 붓고 멀티채널 피펫을 사용합니다. 이 수동 전달 단계에서 원형질체가 용액에서 침전되는 것을 방지하기 위해 트로프를 계속 부드럽게 교반합니다.
4. PEG 용액을 적절한 트러프에 붓고 이제 프로토플라스트가 들어 있는 트랜스펙션 플레이트와 1단계를 사용하여 준비된 트랜스펙션 플레이트를 포함하는 플라스미드 DNA를 데크 레이아웃에 따라 지정된 위치에 내려놓습니다.
5. protoplast transfection Method를 생성하려면 liquid handler 소프트웨어를 열고 아래에 설명된 단계를 수행합니다.
   1. 데크 간 실험기구 이동: 실험기구 이동 명령을 사용하여 팁 로딩 데크의 빈 팁 상자를 새 것으로 교체합니다. 구성 보기에서 시작 및 종료 데크를 선택합니다.
   2. 부피가 200μL보다 큰 경우: 이송 사이에 팁을 교체하지 마십시오. 첫 번째 전송 단계에 대한 팁을 로드하고 마지막 전송 단계 후에 언로드합니다. 이 경우 보충 그림 3과 같이 각 전송 단계에 대해 Loading/Unloading 옵션을 올바르게 지정해야 합니다.
6. 데크 레이아웃 생성: transfection plate 생성 방법과 마찬가지로 DNA 자동 transfection 방법을 생성하려면 liquid handler 소프트웨어를 엽니다. 메뉴 모음에서 New Method 버튼을 클릭하여 새 Method를 만듭니다. 왼쪽 패널의 Instrument Setup 버튼을 눌러 Start lines와 Finish lines 사이에 Instrument Setup 라인을 추가합니다. 보충 그림 1에 표시된 데크 레이아웃에 따라 데크 레이아웃을 만듭니다.
7. 세포/DNA 혼합: Device Action 버튼을 사용하여 PEG를 추가하기 전에 프로토플라스트와 DNA를 혼합하는 단계를 추가하고 장치(자동 실험기구 포지셔너 또는 ALP 쉐이킹), 쉐이킹 속도(1500rpm) 및 쉐이킹 시간(10초)을 설정합니다.
8. PEG 첨가 및 혼합: transfection을 시작하려면 96-pod 피펫을 사용하여 PEG reservoir에서 110μL의 PEG를 추가하는 Transfer 단계를 추가합니다. 지정된 데크 레이아웃에 따라 올바른 소스 및 목적지 위치가 프로그래밍되었는지 확인합니다. 저장소 바닥에서 PEG를 1mm 흡입하고 프로토플라스트/DNA 혼합물이 포함된 96웰 플레이트의 바닥에서 PEG를 3mm 증착하도록 전달 단계를 프로그래밍합니다. PEG 추가 후 이전에 프로그래밍된 단계를 복사하여 붙여넣어 다른 쉐이킹 단계를 추가합니다.
9. PEG 인큐베이션: 일시 중지 버튼을 선택하여 일시 중지 단계를 추가하고, 셰이커를 선택하고, PEG 추가부터 미리 결정된 배양 시간을 입력합니다.
   참고: 일시 중지 타이머는 오류 메시지를 발생시키는 라이트 커튼 중단 또는 중단이 없는 한 계속됩니다. 갑판 조작이 필요한 경우 떠나기 전에 이러한 메시지가 지워졌는지 확인하십시오.
10. W5 완충액 추가/혼합: PEG 배양 반응을 소멸시키기 위해 총 600μL의 W5 완충액을 형질주입 플레이트로 전달하기 위해 200μL를 3줄로 전달합니다. W5 완충액을 첨가하려면 진탕 및 사용자 일시 중지를 통해 transfection plate의 원심분리를 허용합니다.
11. 사용자 일시 중지 1: 100 x g 에서 protoplast transfection plate를 4분 동안 원심분리합니다. 이제 펠릿화된 프로톱플라스트가 있는 transfection plate를 적절한 데크 위치로 되돌립니다. Pause 버튼을 클릭하여 사용자 일시 중지를 추가합니다. 단, 지금은 Pause the whole system and display the message 옵션이 선택되어 있습니다.
    알림: 일시 중지 메시지 팝업을 지워야 액체 처리기가 프로토콜의 나머지 부분을 계속 진행합니다.
12. 상층액 제거: 두 줄의 전사를 추가하여 400μL의 상층액을 제거하고 폐기물 플레이트로 이송합니다. 상층액 제거 중 세포 흡인을 방지하려면 바닥으로부터의 거리를 6mm로 설정하십시오.
13. WI 첨가/혼합: 3라인의 Transfer를 추가하여 580μL의 WI 버퍼를 transfection plate로 전달합니다. WI 추가 후 이전에 프로그래밍된 단계를 복사하여 붙여넣어 다른 쉐이킹 단계를 추가합니다. 다음 사용자 일시 중지로 진행합니다.
14. 사용자 일시 중지 2: 100 x g 에서 4분 동안 protoplast transfection plate를 원심분리합니다. 이제 펠릿화된 프로톱플라스트가 있는 transfection plate를 적절한 데크 위치로 되돌립니다.
15. 상층액 제거: 4줄의 전사를 추가하여 680μL의 상층액을 제거하고 폐기물 플레이트로 이송합니다. 상층액 제거 중 세포 흡인을 방지하려면 바닥으로부터의 거리를 6mm로 설정하십시오.
16. 프로토플라스트를 마이크로플레이트로 전달: 이 프로토콜의 최종 전달은 두 개의 150μL 전달 단계로 구성됩니다. 각 개별 단계에 앞서 transfection 플레이트 하단에서 2mm 지점에서 50μL/s의 속도로 프로톱플라스트를 반복적으로 흡인하고 3mm에서 분주합니다. 그런 다음 동일한 피펫 팁을 사용하여 대상 마이크로플레이트로 옮깁니다.
    참고: 마이크로플레이트로 옮기기 전에 펠릿 위의 완충액을 흡입하고 분주하면 트랜스펙션 플레이트 바닥에 펠릿화된 남아있는 프로토플라스트를 방해하여 샘플 손실이 없도록 합니다. transfection plate 생성 중에 무작위화가 수행되었기 때문에 이것으로 자동화된 프로토콜을 마칩니다.
17. 첫 번째 형광 측정 전에 24-48시간 동안 실온의 어두운 곳에서 마이크로플레이트를 배양합니다.

Results

에지 효과가 반응 측정에 영향을 미칠 수 있음을 뒷받침하는 관찰 데이터를 얻기 위해; 이러한 의심을 확인하기 위해 파일럿 연구가 수행되었습니다. 이 연구를 위해 위의 방법은 단일 처리 수준으로만 3개의 복제 96웰 플레이트에 적용되었습니다. 모든 프로토플라스트는 ZsGreen을 구성적으로 발현하는 플라스미드인 pSYN11250¹⁹를 사용하여 형질주입되었으며, 이를 통해 플레이트의 두 번째 줄 및 플레이트의 중앙 영역과 비교하여 플레이트의 가장자리에 있는 단위에 대한 반응 수준에 체계적인 차이가 있음을 보여주었습니다. 플레이트의 바깥쪽 가장자리에 있는 36개의 웰은 블록 1로, 가장자리에서 두 번째 줄에 있는 28개의 웰은 블록 2로, 중앙의 32개 웰은 블록 3으로 정의됩니다( 그림 2A 오른쪽 하단 패널 참조). 이 배열은 28개의 처리 수준을 무작위 완전 블록 설계(RCBD)로 수용하거나 32개의 처리 수준을 무작위 불완전 블록 설계(RIBD)로 수용할 수 있습니다. 그림 2A에서 각 반복실험(rep)에 대해 각 웰에 대한 원시 데이터 포인트는 해당 플레이트의 평균으로 정규화되었습니다. 실험의 세 가지 반복 실험 모두에서 플레이트 가장자리의 반응은 평균적으로 최소값보다 1-1.5배 큽니다. 그림 2B 는 각 반복실험에 대한 전체 플레이트 평균의 백분율로 블럭 평균을 보여줍니다. 표 2 는 선형 모델을 블록이 고정 효과로 피팅하는 단방향 분산 분석표를 보여줍니다. 블록 설계와 관련된 제한된 무작위화와 관련된 이유로, 블로킹 요인에 대한 가설 검증을 기반으로 한 추론은 기껏해야 근사치로 간주되고 최악의 경우 유효하지 않은 것으로 간주됩니다. 그러나 고정 차단 계수로 모델을 적합하면 차단 체계가 유익한지 여부를 평가하는 데 유용합니다. Mn_Sq(블록)은 전체 평균에 대한 블록 평균의 평균 제곱 편차를 나타냅니다. Mn_Sq(오차)는 해당 그룹 평균에 대한 개별 관측치의 평균 제곱 편차를 나타내며, 이 경우 모델에 처리 요인이 없기 때문에 전체 평균입니다. Mn Sq(블록)가 Mn Sq(오차)보다 큰 경우, 즉 F-비율이 1보다 큰 경우 평균 제곱 오차의 크기는 완전 무작위 설계(CRD)에 비해 효과적으로 감소하여 관심 있는 처리를 비교하기 위한 통계적 검정력을 높이고 처리 대비를 추정하는 신뢰 구간의 너비를 줄입니다. 그림 2B 는 1을 훨씬 초과하는 F-비율을 보여주며, 측정된 응답은 3개의 반복판 모두에서 중심을 향해 이동함에 따라 감소하는 경향이 있습니다. 세 번의 반복실험 모두에서 관측된 플레이트 평균을 포함하지 않는 하나 이상의 블럭에 대해 수준 0.05에서 95% 신뢰 구간이 관측됩니다. 따라서, 블로킹 방식이 이러한 추정치의 정밀도를 실질적으로 증가시킨다는 결론을 내릴 수 있습니다. 정밀도가 떨어지는 것 외에도, 공간적 방해 변동성을 고려하지 못하면 가장자리 효과와 처리 효과를 혼동할 가능성이 있기 때문에 가짜 결과로 이어질 수 있습니다.

1990년대 초반으로 거슬러 올라가는 etiolated maize protoplast 분리 및 transfection 프로토콜의 오랜 역사가 있지만, 이 프로토콜은 high-throughput protoplast transfection²⁰을 위해 재현 가능한 벌크 protoplast 분리를 더 용이하게 하기 위해 기존 절차에 몇 가지 추가 수정을 도입했습니다. 분해 전 종자 및 잎 조직 표면 살균 단계는 무균 매체를 필요로 하지 않고 곰팡이 오염을 줄입니다. 토양을 활용하면 특수 성장 배지를 사용하거나 멸균 일회용 용기를 구입하는 것에 비해 비용을 절감하는 데도 도움이 됩니다. 다양한 단계의 프로토콜은 다양한 수준의 처리량을 수용할 수 있도록 확장할 수 있습니다. 약 2g의 첫 번째 잎 조직은 5 x 10⁶ - 10 x 10⁶ 개의 원형질체를 생성합니다. 96-well plate transfection당 5 x 10⁶ protoplast가 필요하기 때문에 isolation protocol은 작성된 대로 transfection protocol을 2회 실행할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 표준 W5 용액 대신 MMg를 세척 용액으로 사용합니다. 이것은 원래 프로토프플라스트 형질주입 절차의 주어진 단계에 사용되는 완충 용액의 수를 줄이는 수단으로 Arabidopsis 뿌리 프로톱플라스트에 대한 출판물에서 파생되었습니다²¹. 그러나 2022년^{22월 22}일 이내에 etiolated 옥수수 잎 원형질체에도 사용되었습니다. 모든 protoplast 프로토콜의 분리 및 transfection에 대한 추가 개선은 완충액의 단순화 및 감소입니다. 현재 이 프로토콜은 표준 소화 버퍼, W5 버퍼, MMg 버퍼 및 WI 버퍼 간에 전환됩니다. 용액을 단순화하면 프로토플라스트 실험의 재현성을 개선하고 실험 간 사람 대 사람 또는 배치 간 변동성을 줄이는 데 매우 도움이 될 것입니다. 주목할 만한 점은 이 프로토콜의 마지막 신기한 점은 PEG transfection 후 완충액이 완전히 제거되지 않는다는 것입니다. 자동화가 가능한 이유는 여기에 표시된 원형질체, 에티올레이트 옥수수 및 우리가 테스트한 다른 옥수수가 다른 완충 용액(¹¹)을 완전히 제거하는 것보다 반응을 담금질하는 수단으로 희석을 허용하는 것처럼 보이기 때문입니다. 여기에 사용된 GFP transfection control에서 알 수 있듯이 reporter production은 protoplast가 형광 강도에 부정적인 영향을 미치지 않고 최대 5%의 PEG를 견딜 수 있음을 나타냅니다(보충 그림 6). 이 값은 여기에 설명된 프로토콜 완료 시 예상되는 PEG 농도의 두 배 이상입니다.

그림 1: protoplast 분리 및 transfection 절차의 예시 개략도. 자동화가 도입된 단계는 빨간색 파선과 함께 제공되는 파란색 상자로 표시됩니다. 빨간색 원으로 둘러싸인 숫자는 설명된 세 가지 방법에 해당합니다. BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 가장자리 효과와 반복 레이아웃 완화의 영향. (A) 3개의 독립 복제(Rep) 실험에 대한 플레이트 평균을 기준으로 pSYN11250으로 형질 주입된 96웰 플레이트에 대한 형광 강도의 접힘 변화를 보여주는 지형도. 이러한 실험의 평균은 또한 차단 체계로 표시되며, 그 위에 놓인 다양한 색상의 점선으로 표시됩니다. (B) 복제 플레이트 1, 2 및 3에 대한 전체 플레이트 평균의 백분율로 블록 평균을 보여주는 스트립 플롯(왼쪽에서 오른쪽). 반투명 원은 플레이트 평균으로 나눈 후의 원시 데이터 포인트를 나타냅니다. 오차 막대는 수준 0.05에서 95% 신뢰 구간이며 중앙 대시는 평균을 나타냅니다. 갈색, 황금색 및 회색은 각각 플레이트의 가장자리, 두 번째 행 및 내부 부분을 나타냅니다. 100%의 빨간색 파선은 전체 플레이트 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

완충기	시약
소화	1.5% 셀룰로오스 Rs
	0.3% 고효소
	0.6 M 만니톨
	10mM MES(산도 5.7)
	1mM CaCl2
	0.1% (w/v) BSA
	0.5nM β-메르캅토에탄올 또는 0.5mM DTT
음...	0.6 M 만니톨
	재질 보기 15 mM MgCl2
	4mM MES, pH 5.7
승5	154mM 나트륨
	재질 보기 125 mM CaCl2
	5mM KCl
	2mM MES, pH 5.7
위스콘신	0.6 M 만니톨
	4mM MES, pH 5.7
	4mM KCl
페그	30% 나무못 (w/v)
	0.6 M 만니톨
	100 mM CaCl2

표 1: etiolated maize protoplast의 분리 및 transfection을 위한 완충 용액.

담당자	근원	디에프	제곱합	미네소타 스퀘어	F 값	홍보 (>F)
복제 1	차단	2	0.26	0.13	10.64	<0.001
	잔여	93	1.135	0.012
복제 2	차단	2	0.507	0.25	21.41	<0.001
	잔여	93	1.102	0.012
복제 3	차단	2	0.179	0.09	4.48	0.014
	잔여	93	1.861	0.02

표 2: 96웰 pSYN11250 형질주입 실험의 3회 반복에 대한 편도 분산분석표. 각 반복 플레이트에 대해 Source 열은 변동 원인, Df는 자유도, Sum Sq는 제곱합, Mn Sq는 평균 제곱(Sum Sq/Df), F 값은 Mn_Sq(블록)과 Mn_Sq(오차)의 비율, Pr(>F)은 전역 F-검정의 p-값을 나타냅니다.

보충 그림 1: 소프트웨어 대시보드의 스크린샷. 새로운 Method를 만드는 것과 관련된 선택 범주와 randomization 및 transfection 프로토콜에 대한 데크 레이아웃. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: transfection plate 생성 프로토콜 설정의 주요 단계. transfection plate 생성 프로토콜을 생성하는 동안 찍은 스크린샷. 각 패널의 번호와 제목은 프로토콜의 단계에 해당합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: transfection 프로토콜 생성을 위한 실험기구 조작 및 팁 로딩에 대한 스크린샷. 이는 프로토콜 전체에서 여러 번 발생하는 단계를 나타내므로 반복되는 언급을 피하기 위해 대표 단계가 여기에 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: 사용자 일시 중지를 통한 세포-DNA 혼합 1. transfection 프로토콜을 만드는 동안 찍은 스크린샷. 각 패널의 번호와 제목은 프로토콜 본문 내의 단계에 해당합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 5: 사용자 일시 중지 1 후 샘플을 마이크로플레이트로 옮기는 상등액 제거. transfection 프로토콜을 만드는 동안 찍은 스크린샷. 각 패널의 번호와 제목은 프로토콜 본문 내의 단계에 해당합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 6: WI 완충 시간 과정에서 다양한 농도의 PEG로 처리된 ZsGreen의 에티올화 옥수수 잎 원형질체. 마이크로플레이트 리더에 의한 측정으로 24, 48 및 72시간에 PEG 처리 후 protoplast의 상대적 형광 강도를 보여주는 막대 차트. 오차 막대 = SD, n = 4. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 원고는 자동 transfection을 통해 transfection plate 생성 및 etiolated maize leaf protoplast isoliation을 자동화하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜의 transfection plate 생성 부분을 성공적으로 완료하려면 8채널 포드가 장착된 자동화된 액체 처리 로봇이 필요합니다. transfection 프로토콜의 경우, 완전하고 균일한 96-well plate transfection을 위해 96-well pod가 권장됩니다. transfection 분석법은 8채널 포드를 사용하여 완료할 수 있지만, 흡인 및 분주 단계에 소요되는 시간과 컬럼 간 팁 변경으로 인해 발생할 수 있는 시간을 특별히 고려해야 합니다. PEG 배양 기간의 차이는 transfection 효율 및 발현에 상당한 영향을 미치는 것으로 잘 문서화되어 있으므로, 검체 취급의 차이를 방지하기 위해 이러한 기여 요인에 대한 특별한 주의를 기울여야 합니다¹³. 액체 처리기 프로토콜을 시작하기 전에 프로토콜의 단계와 특정 활동을 동시에 완료할 수 있는지 여부를 고려하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 데크의 96개 위치에서 1웰 포드의 팁을 로드하는 장치를 사용합니다. 이 프로토콜의 액체 처리기에는 프로토콜에 추가 시간이 추가되지 않도록 인큐베이션 기간 동안 또는 사용자 일시 중지 단계 중에 로봇이 팁 상자를 교체하는 기능이 포함되어 있습니다. 액체 처리기 구매 결정을 내릴 때 기능과 잠재적인 시간 절약 편의성을 고려하십시오.

이 프로토콜은 벡크만쿨터 NXp 및 Biomek FX 장치를 활용하기 위해 개발되었지만, 이 프로토콜은 유사한 모든 액체 취급 장치에 적용할 수 있습니다. 모든 액체 처리기에는 한 위치에서 다른 위치로 부피를 전송하는 방법과 양을 나타내는 몇 가지 수단이 있습니다. 이 프로토콜의 경우 이러한 장치는 파일에서 전송 줄 명령을 사용했습니다. 실험기구가 올바르게 정의되면 사용자는 모든 용기에서 또는 모든 용기로 이동할 수 있습니다. 튜브 랙 또는 어댑터가 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우와 같은 예외적인 상황에서는 이러한 커넥터를 3D 프린팅으로 사용할 수 있습니다. 일반적인 protoplast transfection 프로토콜의 경우, 1 μg/μL transfection 농도의 20 μg DNA는 수많은 protoplast 플랫폼을 위한 표준 부피의 물질입니다¹³_. transfection 플레이트를 생성하는 동안 추가 예방 조치로 0.2 - 20 μL 필터 팁을 사용하여 전달 중 에어로졸화된 플라스미드로 인한 오염 위험을 최소화합니다. 전처리에서 인간적인 구성 요소를 제거하면 시간이 지남에 따라 변동이 줄어들고 이러한 고처리량 실험의 재현성이 향상됩니다. 또한 접시를 미리 준비할 수 있습니다. 이 제제는 실험 당일 transfection 과학자의 스트레스를 완화할 것입니다. 그러나 샘플이 증발할 수 있으므로 이러한 plasmid DNA 플레이트를 4°C에서 장기간 보관하지 않는 것이 중요합니다. 샘플은 -20°C 냉동고에 보관해야 하며 형질주입 전에 4°C 냉장고에서 해동할 수 있습니다. 이 transfection plate 생성 프로토콜이 프로그래밍되면 새로운 Transfer From File .csv 제공하고 샘플, 실험기구 및 시약에 대해 동일한 데크 위치를 차지하여 쉽게 반복할 수 있어야 합니다.

자동 transfection 절차(3단계)의 경우, 트로프에서 점성 액체의 동일한 흡인을 보장하기 위해 잉량의 PEG 용액을 준비하며, 일반적으로 데드 볼륨을 설명하기 위해 40mL를 초과합니다. transfection에 필요한 양을 정확히 사용하면 공기가 파이펫으로 유입되고 96채널 헤드를 가로질러 균일하지 않은 양의 PEG가 흡입될 수 있습니다. 이 용액은 미리 준비할 수도 있지만 transfection 당일에 준비하는 것이 좋습니다. PEG 용액의 멸균은 주사기 필터를 사용하여 수행할 수 있지만 점도로 인해 어려울 수 있습니다. 진공 필터 장치를 사용하면 더 빠르며 이 활동과 관련된 좌절이나 통증을 완화할 수 있습니다. PEG 용액과 마찬가지로 다른 transfection 완충액 용액(W5, WI)도 과도하게 제공되어 96채널 헤드에서 동일한 피펫팅을 보장합니다. 버퍼 용액(W5 및 WI)은 향후 액체 처리기 실행에 사용하기 위해 미리 대량으로 준비할 수 있습니다. 시약은 비용이 많이 들지 않지만 완충 용액의 희생이 많이 있습니다. 하루에 실행되는 횟수가 증가함에 따라 실행이 끝날 때 버려지는 초과분을 줄일 수 있는 저장소의 대안을 사용하는 것이 더 나을 수 있습니다. 액체 처리기 프로토콜이 실행되는 동안 W5 및 WI는 프로토콜 시작 전, 15분 배양 중 또는 프로토콜의 사용자 일시 중지 단계 중에 해당 골에 추가할 수 있습니다. 배양 기간 동안 버퍼를 추가할 때는 라이트 커튼과 같은 안전 기능으로 인해 주의하십시오. 프로토콜의 의도하지 않은 중단을 방지하기 위해 소프트웨어에서 경고 메시지를 지워야 합니다.

이 프로토콜은 protoplast^12,13의 처리를 위해 이전에 문서화된 자동화 프로토콜에 대한 신뢰할 수 있고 반복 가능하며 널리 적용 가능한 개선 사항을 반영합니다. 이 방법은 많은 사람들이 동일한 일련의 버퍼 조작 단계에 의존하기 때문에 끝이 없어 보이는 프로토플라스트 프로토콜의 레퍼토리에 적용할 수 있습니다. 자동화된 transfection plate 생성 중에 RICBD를 통해 edge effect를 완화하면 edge effect를 통계적으로 유의미하게 보정하는 동시에 effort와 variability를 줄일 수 있습니다. 프로토플라스트의 96웰 pod transfection은 PEG 배양 시간과 관련된 변동 가능성을 제거하여 96웰 내에서 동시에 반응을 수행합니다. 이 프로토콜은 형질주입 단계의 완전한 자동화를 달성하기 위한 것이지만, 사용자 일시 중지는 형질주입 과학자의 물리적 개입을 필요로 합니다. 최근 몇 년 동안 불균형을 견디는 자동화 호환 원심분리기에 대한 많은 발전이 있었습니다. 이 장비를 사용하면 사용자 개입 없이 전체 방법을 자동화할 수 있습니다. 대안적으로, 다른 프로토콜은 protoplast가 transfection^12,13 후 well의 바닥에 가라앉도록 함으로써 원심분리를 피했습니다. 그러나 이는 transfection 절차에 추가 시간을 추가하고 WI에서 야간 배양 전에 W5 버퍼에서 인큐베이션하는 데 과도한 시간을 추가합니다.

transfection 방법의 여러 위치에서 200μL를 초과하는 부피의 취급을 설명하며, 여기서 액체 취급은 다중 전달을 사용하여 수행해야 합니다. Liquid Handler의 연식과 모델에 따라 이 단계는 하나의 단일 볼륨으로 수행될 수 있으며 수행되어야 합니다. 여기에 설명된 모델과 같은 구형 액체 분주기의 경우 96웰 헤드를 사용하여 흡입할 수 있는 최대 값은 200μL입니다. 효율성과 정확성 모두에서 이 방법의 명백한 개선은 유출, 물방울 또는 오염의 잠재적 위험을 최소화하기 위해 이송 횟수를 줄이는 것입니다. 액체 취급 프로토콜의 개선을 위한 다른 고려 사항은 이러한 기술과 생명공학 분야에서의 활용에 대한 검토에 요약되어 있습니다²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-메르캅토에탄올	Sigma	M6250
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Sigma	69892
50mL 원심분리기 튜브(플랫 캡 포함 멸균	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Black w/Lid Cell Culture Sterile PS .4mL Well	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX 로봇 팁, 비멸균, 광경	Fisher	14-222-096
Axygen 로봇 팁 30uL 필터, 멸균, 랙 Fisher		14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style 진공 탈착기	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 피트 롤 실험실 파라필름	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
칼슘 클로라이드 디하이드레이트	Sigma	C5080
Chemglass 생명 과학 일회용 혈구계	Fisher	50-131-1352
Clorox 살균 표백제, 집중	Fisher	NC1871274
Corning Microplate 알루미늄 밀봉 테이프	Fisher	07-200-684
Corning 96-Well 분석 블록, 2mL, 96 well 표준	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL 플라스틱 주사기	Fisher	14-955-461
Fisherbrand 멸균 세포 여과기 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand 페트리 접시, 투명 뚜껑, 쌓을 수 있음, 100 mm x 25 mm, 325 Fisher		FB0875711
마그네슘 클로라이드 육수화물	Sigma	M2670
케이스Millex 주사기 구동 필터 유닛 멸균 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Millex 주사기 구동 필터 유닛 멸균 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip 멸균 일회용 진공 청소기 유닛 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poly(ethylene glycol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth 플러그 및 묘목 믹스	Wyatt Quarles	GP92747
Regular Duty Single Edge Razor Blades 스틸 백 .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
염화나트륨	Sigma	S7653
트레이 삽입 - 36 셀 - 6x6 중첩	Hummert	11635000
트윈-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 진공 펌프, 100-120V, 50/60 Hz, US 플러그	VWR	97058-164