<ol><li> 로 비디오에 나타난 흐름 챔버를 구성. parafilm 밀봉이 꽉 있는지 확인하고 세탁 coverslips을 사용합니다. </li><li> 50-10 &#39;에 대한 챔버에 품어 굴지 바인딩 요원. </li><li> 차단 단백질과 유리 coverslip에 비 특정 바인딩 사이트를 차단합니다. </li><li> 버퍼 polymerizing에서 G - 굴지 흐르는하여 챔버 내부의 중합 굴지. </li><li> 초과 버퍼 흐르는으로 희미 unpolymerized의 굴지. </li></ol>

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

오늘은 정립 현미경(upright microscope)에서 이미징을 하기 위한 유동 챔버인 퓨전 챔버(fusion chamber)를 제작하는 방법을 보여드리겠습니다. 우선 필름을 사용하여 두 개의 공간을 만듭니다. 이를 위해 파라필름(para film)을 작은 조각으로 자릅니다.다음으로 저는 이 작업을 수행할 것인데, 이는 기본적으로 벽면을 위한 채널을 형성하게 되며, 경사진 공기로 이를 건조합니다. 파라핀 위에 커버 슬립을 덮고, 여기 완성된 모습이 있습니다. 그런 다음 히팅 블록에서 가열하여 파라핀을 녹이고 기본적으로 밀봉 상태를 만듭니다.여기 보이는 것이 커버 글라스이며, 그 커버 글라스 위에 보시는 바와 같이 두 층의 phim이 놓여 있습니다. 그리고 그 위에 다시 22 by 22 mm 크기의 커버 슬립이 있습니다. 바로 이 부분을 phim에 밀착시켜 씰을 형성했습니다.좋습니다. 액체는 이 방향으로 들어가고, 여기서는 여과지를 사용하여 이 방향으로 빨아낼 수 있습니다. 잠시 후에 그 방법을 보여드리겠습니다. 제가 선호하는 방식은 매우 간단한 가습 챔버에 넣는 것입니다.두 종류의 높게 돋은 스트립을 준비하고 그 아래에 여과지를 둡니다. 그리고 내부를 밀폐하기 위해 플로우 챔버 위에 커버 슬립을 덮습니다. 이제 챔버에 용액을 주입하는 방법은 피펫 팁을 챔버 입구에 대고 그대로 분주하는 것입니다.이제 뚜껑을 닫은 채로 챔버를 10분 동안 배양합니다. 반대편에서 액체를 흡입하기 위해 제가 주로 사용하는 방법은 필터 페이퍼를 가져와 이렇게 얇은 띠 모양으로 자르는 것입니다. 이 얇은 띠 하나를 사용하여, 입구로 용액을 주입하는 동시에 출구에 필터 페이퍼를 대어 용액이 교체되며 흡수되도록 합니다.용액을 통해 액체가 흐르는 것을 볼 수 있습니다. 그런 다음 중간 폐쇄를 위해 5분 동안 기다립니다. 이제 실제로 액틴을 넣을 준비가 되었는데, 액틴은 유체 챔버 내부에서 중합시켜야 하며, 이는 이전과 동일한 절차로 진행합니다.따라서 이런 식으로 액틴이 중합되었으므로, 이제 다량의 버퍼만을 사용하여 중합되지 않은 과잉 액틴을 모두 씻어냅니다. 여기에는 약 100 µL의 버퍼가 있으며, 이는 반응 챔버 부피의 몇 배에 해당하는 양입니다. 필터 페이퍼가 포화되면 흐름 방향을 바꿔주어야 합니다. 아시겠습니까?이제 이를 이용해 이미징을 수행할 준비가 되었습니다. 액틴이 부착된 관류 챔버입니다. 이제 슬라이드를 가져와 현미경 아래에 장착하고, 오일 대물렌즈로 이미징할 예정이므로 커버글라스 상단 표면에 침전유를 도포하겠습니다. 이렇게 하면 내부에 액틴과 함께 용액이나 단백질 또는 기타 물질이 포함된 상태로 평가할 수 있습니다.따라서 저는 타임랩스 이미징을 수행하는 동안 실제로 용액 측을 교체할 수 있습니다.

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