세포외 소포체는 생물의학 응용 분야에 엄청난 가능성을 가지고 있지만, 현재의 분리 방법은 시간이 많이 걸리고 임상적으로 사용하기에는 비실용적입니다. 이 연구에서는 최소한의 단계로 연속적으로 많은 양의 생체 유체에서 세포외 소포체를 직접 분리할 수 있는 미세유체 장치를 제시합니다.
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방법 논문
분기된 A4F 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포외 소포체(EV)는 진단, 약물 전달 및 재생 의학을 포함한 다양한 생물의학 응용 분야에 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고 EV를 분리하는 현재의 방법론은 복잡성, 시간 소비, 부피가 큰 장비의 필요성과 같은 중요한 문제를 제시하여 임상 번역을 방해합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 당사는 연속적인 방식으로 대용량 샘플에서 EV를 효율적으로 분리하기 위해 COC-OSTE(Cyclic Olefin Copolymer-off-stoichiometry thiol-ene)를 기반으로 하는 혁신적인 미세유체 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구에 사용된 기술은 크기 및 부력 기반 분리를 활용하여 소변 및 세포 배지 샘플의 기존 접근 방식에 비해 훨씬 더 좁은 크기 분포를 달성하여 향후 응용 분야에서 특정 EV 크기 분획을 표적으로 삼을 수 있습니다. 분기된 비대칭 유동장-유동 분획 기술을 활용하는 당사의 혁신적인 COC-OSTE 미세유체 장치 설계는 대용량 시료에 대한 간단하고 지속적인 EV 분리 접근 방식을 제공합니다. 또한 이 미세유체 장치의 대량 제조 잠재력은 확장성과 일관성을 제공하여 높은 일관성과 처리량이 필수 요구 사항인 일상적인 임상 진단 및 산업 공정에 EV 절연을 통합할 수 있습니다.
서론
세포외 소포체(EV)는 엑소좀(30-200nm)과 미세소포(200-1000nm)의 두 가지 주요 유형으로 구성된 세포 유래 막 결합 입자입니다1. 엑소좀은 다낭체(MVB) 내에서 엔도솜 막의 안쪽 발아를 통해 형성되며, 원형질막과 융합할 때 내강 내 소포(ILV)를 세포외 공간으로 방출합니다1. 대조적으로, 미세소포는 세포막의 바깥쪽 발아와 핵분열에 의해 생성된다2. EV는 단백질, 핵산, 지질 및 대사 산물을 운반하여 세포의 생리적 상태를 반영하여 성장, 혈관 신생, 전이, 증식 및 치료 저항성을 포함하여 세포 간 통신에 중요한 역할을 합니다3. 그 결과, 암을 포함한 질병에 대한 유망한 바이오마커 및 치료 표적으로 부상하여 진단 및 약물 전달 시스템에서의 잠재력을 강조하고 있습니다4.
질병 진단 및 치료에서 EV를 완전히 활용하려면 다양한 생체 유체로부터 효율적으로 분리하는 것이 중요합니다5. 일반적인 방법으로는 초원심분리(UC), 밀도 구배 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)....
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프로토콜
샘플 수집은 라트비아 대학 생명 및 의학 연구 윤리 위원회(결정 N0-71-35/54)의 승인을 받았습니다.
참고: 이 연구에 사용된 자료는 재료 목차 파일에 포함되어 있습니다.
1. 3차원(3D) 프린팅 금형 제작
- CAD 소프트웨어에서 상단 채널에 대해 높이 0.5mm, 너비 1mm, 길이 210mm의 치수를 사용하여 구불구불한 모양의 이중 네거티브 몰드를 설계합니다. 하단 채널의 경우 너비 1.5mm, 높이 0.6mm, 길이 210mm의 동일한 디자인을 사용합니다. 금형 너비, 길이, 높이 및 설계 등각 투영 그림과 같은 치수는 그림 1에 나와 있습니다. 디자인을 .stl 파일로 저장합니다.
- Z-Suite에서 파일을 준비합니다. 지원을 추가할 필요가 없습니다. 자외선 액정 디스플레이(UV LCD) 3D 프린터와 견고한 검은색 레진을 사용하여 금형을 인쇄합니다.
- 인쇄 후 프린터 표면에서 금형을 조심스럽게 제거합니다. 이소프로판올(IPA)로 몰드를 초음파 처리하여 20분 동안 세척합니다.
- N2
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결과
우리는 분기된 A4F 원리(그림 2B, C)를 기반으로 고처리량 EV 분리를 위해 소프트 리소그래피(그림 2A)를 통해 3D 프린팅된 이중 네거티브 몰드(그림 1)를 사용하여 미세유체 장치를 제작했습니다. 이 설정에는 그림 3에서 볼 수 있듯이 자동화된 방식으로 EV를 격리하기 위해 펌프와 플로우 스루 스테이션이 필요합니다. 첫째, 장치의 개념 증명을 평가하기 위해 직경이 100nm 및 1000nm인 폴리스티렌 비드의 혼합물을 제조하여 각각 소포 및 미세 세포 파편(10)을 나타냅니다. 선형 속도가 분리 효율에 미치는 영향을 조사하기 위해 분기 흐름이 있거나 없는 비드 혼합물에 대해 다양한 유속으로 실험을 수행했습니다. 모든 실험에서 작은 비드의.......
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토론
제시된 미세유체 장치는 생물학적 유체에서 EV를 분리하고 추출하기 위한 유망한 방법을 제공하여 UC 및 SEC12와 같은 기존 골드 스탠다드 방법의 중요한 한계 중 일부를 해결합니다. UC 및 SEC는 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리며 수율이 낮은 것으로 알려져 있어 많은 양의 EV가 필요한 고처리량 애플리케이션에는 적합하지 않습니다21,22. 대조적으로, 설명된 미세유체 장치는 최소한의 사용자 입력으로 최대 20mL의 생물학적 유체를 지속적으로 처리할 수 있어 산업 또는 임상 환경에서 잠재적인 게임 체인저가 될 수 있습니다. 이 미세유체 장치의 주요 장점 중 하나는 수동 단계를 포함하는 기존 방법에 비해 EV 절연을 표준화하고 재현성을 개선할 수 있다는 것입니다. 대량 제조를 통해 EV 절연 장치 제조의 변동성을 줄임으로써 장치의 성능을 더 잘 제어하고 일관성을 유지할 수 있으며.......
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공개 사항
A.A., G.M. 및 R.R.은 Cellbox Labs, LLC의 설립자, 이사회 구성원 및 지분 보유자입니다
감사의 글
이 연구에 참여한 모든 기증자, 샘플을 제공해주신 라트비아 게놈 데이터베이스 직원에게 감사드립니다. 라트비아 대학의 고체 물리학 연구소(Institute of Solid-State Physics, the Center of Excellence)는 보조금 계약 번호 739508, 프로젝트 CAMART2에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 프레임워크 프로그램 H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2로부터 자금을 지원받았습니다. 이 연구는 라트비아 과학 위원회 프로젝트 번호의 지원을 받았습니다. lzp-2019/1-0142 및 프로젝트 번호: lzp-2022/1-0373.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
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|---|---|---|---|
| 0.1 & 마이크로; m 카르복실레이트 FluoSpheres | Invitrogen | #F8803 | 재고 농도: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT에 따라 다름) |
| 0.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Starstedt | 72.704 | |
| 1 mL Luer cone syringe 일회용 without needle RAYS | TUB1ML | ||
| 1.0 µ m 폴리스티렌 FluoSpheres | Invitrogen | #F13083 | 재고 농도: 1 x 1010 beads/mL (LOT에 따라 다름) |
| 10 mL 혈청학적 피펫 | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters | Merck Millipore | UFC910024 | |
| 2.0 mL Protein LoBind tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| 20 mL syringes | BD PlastikPak | ||
| 250 &마이크로; m ID 폴리에테르 에테르 케톤 튜빙 | Darwin Microfluidics | CIL-1581 | |
| 3 kDa MWCO 원심 필터 장치 | Merck Millipore,UFC200324 | ||
| 5 mL 의료용 주사기(바늘 없음 | Anhui Hongyu Wuzhou Medical | 159646 | |
| 50 mL 원추형 튜브 | Sarstedt | 62.547.254 | |
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| 800 &마이크로; m ID 폴리테트라플루오로에틸렌 튜빙 | Darwin Microfluidics | LVF-KTU-15 | |
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참고문헌
- Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Sm....
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재인쇄 및 허가
