분기된 A4F 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리

요약

세포외 소포체는 생물의학 응용 분야에 엄청난 가능성을 가지고 있지만, 현재의 분리 방법은 시간이 많이 걸리고 임상적으로 사용하기에는 비실용적입니다. 이 연구에서는 최소한의 단계로 연속적으로 많은 양의 생체 유체에서 세포외 소포체를 직접 분리할 수 있는 미세유체 장치를 제시합니다.

초록

세포외 소포체(EV)는 진단, 약물 전달 및 재생 의학을 포함한 다양한 생물의학 응용 분야에 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고 EV를 분리하는 현재의 방법론은 복잡성, 시간 소비, 부피가 큰 장비의 필요성과 같은 중요한 문제를 제시하여 임상 번역을 방해합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 당사는 연속적인 방식으로 대용량 샘플에서 EV를 효율적으로 분리하기 위해 COC-OSTE(Cyclic Olefin Copolymer-off-stoichiometry thiol-ene)를 기반으로 하는 혁신적인 미세유체 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구에 사용된 기술은 크기 및 부력 기반 분리를 활용하여 소변 및 세포 배지 샘플의 기존 접근 방식에 비해 훨씬 더 좁은 크기 분포를 달성하여 향후 응용 분야에서 특정 EV 크기 분획을 표적으로 삼을 수 있습니다. 분기된 비대칭 유동장-유동 분획 기술을 활용하는 당사의 혁신적인 COC-OSTE 미세유체 장치 설계는 대용량 시료에 대한 간단하고 지속적인 EV 분리 접근 방식을 제공합니다. 또한 이 미세유체 장치의 대량 제조 잠재력은 확장성과 일관성을 제공하여 높은 일관성과 처리량이 필수 요구 사항인 일상적인 임상 진단 및 산업 공정에 EV 절연을 통합할 수 있습니다.

서론

세포외 소포체(EV)는 엑소좀(30-200nm)과 미세소포(200-1000nm)의 두 가지 주요 유형으로 구성된 세포 유래 막 결합 입자입니다¹. 엑소좀은 다낭체(MVB) 내에서 엔도솜 막의 안쪽 발아를 통해 형성되며, 원형질막과 융합할 때 내강 내 소포(ILV)를 세포외 공간으로 방출합니다¹. 대조적으로, 미세소포는 세포막의 바깥쪽 발아와 핵분열에 의해 생성된다². EV는 단백질, 핵산, 지질 및 대사 산물을 운반하여 세포의 생리적 상태를 반영하여 성장, 혈관 신생, 전이, 증식 및 치료 저항성을 포함하여 세포 간 통신에 중요한 역할을 합니다³. 그 결과, 암을 포함한 질병에 대한 유망한 바이오마커 및 치료 표적으로 부상하여 진단 및 약물 전달 시스템에서의 잠재력을 강조하고 있습니다⁴.

질병 진단 및 치료에서 EV를 완전히 활용하려면 다양한 생체 유체로부터 효율적으로 분리하는 것이 중요합니다⁵. 일반적인 방법으로는 초원심분리(UC), 밀도 구배 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 여과 및 면역분리가 있습니다⁶. UC는 널리 사용되는 기술이지만 EV가 아닌 유사한 밀도의 입자를 생성할 수 있으며 EV 응집체를 생성할 수 있습니다⁷. SEC는 밀도가 아닌 크기에 따라 입자를 제외하여 더 높은 순도의 시료를 제공할 수 있는 능력으로 인해 인기를 얻고^{있다 8}. 그러나 SEC 컬럼에 적합한 공극 크기를 신중하게 선택하고 크로마토그래피 조건을 최적화하는 것은 킬로미크론 및 저밀도 지단백질과 같은 원치 않는 입자의 동시 분리를 최소화하는 데 필수적입니다⁸. 이러한 효과에도 불구하고, 두 방법 모두 시간이 많이 걸리고 자동화가 까다로우며, 특히 세포 배지나 소변과 같은 대용량 샘플의 경우 산업 응용 분야를 위한 확장성이 제한된다⁹.

최근 몇 년 동안 비대칭 전계 유동장 분획(A4F)은 크기 및 부력 기반 마이크로미터 및 나노미터 크기의 입자 분리를 위한 강력한 분리 기술로 발전했습니다¹⁰. A4F의 작동 원리는 베이스에 다공성 멤브레인이 부여된 미세유체 채널에 의존하여 크로스 플로우(¹⁰)라고 하는 멤브레인을 향해 가해지는 힘을 생성합니다. 브라운 운동(Brownian motion) 및 시스템에 내재된 푸아유유(Poiseuille) 흐름과 결합될 때, 교차 흐름은 유동 역학¹¹ 내의 다양한 입자 위치로 인해 효율적인 입자 분리를 용이하게 한다. 이점에도 불구하고, 이 방법은 마이크로리터 범위⁽¹² ) 내의 샘플 부피로 제한되며, 추가적인 포커싱 단계를 필요로 하며, 이는 공정(¹⁰)의 지속 시간을 연장시킨다.

지난 10년 동안 미세유체공학은 빠르고 효율적이며 임상적으로 신뢰할 수 있는 EV 분리를 위한 도구로 두각을 나타냈습니다¹³. 그러나 EV 분리를 위해 설계된 대부분의 미세유체 분석법은 소량, 고농도 EV 샘플에 최적화되어 있거나 복잡한 분리 절차에 의존한다¹⁴. 또한, 미세유체역학 분야에서 폴리디메틸실록산(PDMS)은 광학적 투명성, 생체 적합성 및 사용 편의성으로 인해 황금 표준 소재로 인정받고 있습니다¹⁵. 그럼에도 불구하고, EV를 포함한 작은 친유성 분자를 흡수하는 이의 알려진 성향은 EV 분야(¹³)에서의 응용에 문제가 될 수 있다.

고리형 올레핀 공중합체(COC)는 생체 적합성, 분자 흡수율이 낮고 내화학성이 높기 때문에 미세유체역학에서 자주 사용되는 재료입니다¹⁵. 그러나, COC 장치의 제조에는 종종 복잡한 공정이나 특수 장비가 포함된다¹⁶. 대안으로, 오프화학량론 티올-엔(OSTE)은 저분자의 흡수 감소, 우수한 화학적 안정성, 제조 용이성 및 확장 가능한 제조 공정으로 인해 PDMS에 대한 유망한 대안입니다^17,18. 그러나, 튜빙에 대한 복잡한 연결로 인해, 장치는 누출되기 쉬울 수 있다¹⁹.

이 연구의 목적은 소변이나 세포 배지와 같은 대용량 샘플에서 EV 분리를 위해 OSTE와 COC와 분기된 A4F 원리를 결합한 미세유체 장치를 설계하고 제작하는 것이었습니다.

프로토콜

샘플 수집은 라트비아 대학 생명 및 의학 연구 윤리 위원회(결정 N0-71-35/54)의 승인을 받았습니다.

참고: 이 연구에 사용된 자료는 재료 목차 파일에 포함되어 있습니다.

1. 3차원(3D) 프린팅 금형 제작

1. CAD 소프트웨어에서 상단 채널에 대해 높이 0.5mm, 너비 1mm, 길이 210mm의 치수를 사용하여 구불구불한 모양의 이중 네거티브 몰드를 설계합니다. 하단 채널의 경우 너비 1.5mm, 높이 0.6mm, 길이 210mm의 동일한 디자인을 사용합니다. 금형 너비, 길이, 높이 및 설계 등각 투영 그림과 같은 치수는 그림 1에 나와 있습니다. 디자인을 .stl 파일로 저장합니다.
2. Z-Suite에서 파일을 준비합니다. 지원을 추가할 필요가 없습니다. 자외선 액정 디스플레이(UV LCD) 3D 프린터와 견고한 검은색 레진을 사용하여 금형을 인쇄합니다.
3. 인쇄 후 프린터 표면에서 금형을 조심스럽게 제거합니다. 이소프로판올(IPA)로 몰드를 초음파 처리하여 20분 동안 세척합니다.
4. N₂로 금형을 불어 건조시킵니다.
5. ND33 필터를 사용하여 금형을 홍수 노출에 810초 동안 노출시킨 다음 60°C의 오븐에 48시간 동안 넣습니다.

2. PDMS 금형의 준비

1. PDMS의 무게를 10:1 w/w 비율로 측정합니다(각 금형에 대해 엘라스토머 베이스 16g과 가교제 1.6g 사용). 유성 원심 믹서에서 구성 요소를 혼합하고 1RPM에서 500분 동안 혼합합니다.
2. 혼합된 PDMS를 3D 프린팅 금형에 넣고 -800mbar의 진공 데시케이터에서 30분 동안 또는 기포가 관찰되지 않을 때까지 가스를 제거합니다.
3. 액체 PDMS 위에 100μm 두께의 폴리염화비닐 라이너를 조심스럽게 놓습니다.
   알림: 기포가 형성되지 않도록 라이너를 한쪽에서 다른 쪽으로 천천히 바르십시오.
4. PDMS가 있는 금형을 Mold-in-Place 지그에 삽입하고 0.3Nm으로 설정된 토크 렌치를 사용하여 지그를 조입니다.
5. 지그를 60°C 오븐에 3시간 동안 넣어 PDMS를 경화시킵니다.
6. 육각 키를 사용하여 지그를 분해하고 지그에서 3D 프린팅 금형을 제거합니다.
7. 3D 프린팅된 마스터 금형에서 PDMS 금형을 조심스럽게 탈형하여 메스로 금형 가장자리를 돌린 다음 핀셋으로 금형을 제거합니다.
   알림: 더 쉬운 곰팡이 제거를 위해 IPA를 사용할 수 있습니다. 그러나 과도한 IPA를 증발시키기 위해 금형을 60°C에서 10분 동안 가열해야 합니다.

3. OSTE-COC 탑 채널 준비

1. 무게 OSTE는 1.09:1 w/w 비율입니다(장치 5개의 경우 A 부품 1.56g, B 부품 1.44g 필요). 유성 원심 믹서에서 구성 요소를 혼합합니다: 750RPM에서 5분 동안 혼합한 다음 750RPM에서 5분 동안 가스를 제거합니다.
2. 혼합된 OSTE를 원심분리 튜브로 옮기고 진공 데시케이터에서 -800mbar에서 30분 동안 가스를 제거합니다.
3. 2 x 16 미니 루어 커넥터로 COC 슬라이드를 IPA에서 10 분 동안 초음파 처리하여 청소하십시오. N₂로 슬라이드를 조심스럽게 말리십시오.
4. 평평한 표면이 위쪽으로 오도록 깨끗한 COC 슬라이드를 플라즈마 애셔에 놓고 표면을 800 SCCM 산소 플라즈마로 2분 동안 700W 전력, 0.133mbar 압력으로 처리합니다.
5. 처리된 표면이 PDMS의 구조화된 표면과 접촉하도록 산화된 COC 슬라이드를 상단 채널의 PDMS 금형에 놓습니다. 어셈블리를 Mold-in-Place 지그에 놓고 0.3Nm으로 설정된 토크 렌치로 지그를 조입니다.
6. 압력 시스템을 6bar의 압축 공기 라인에 연결합니다. 가스가 제거된 OSTE가 있는 원심분리기 튜브를 가져다가 내경(ID)이 0.8mm인 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 튜브를 사용하여 압력 시스템 지침에 따라 조립합니다.
7. PTFE 튜브를 PDMS 금형의 입구에 연결하고 압력 시스템에 있는 압전 펌프에 의해 유지되는 1000mbar 압력을 사용하여 장치를 채웁니다. 유리 면이 위로 향하게 하여 지그를 마스크 얼라이너에 넣고 ND33 필터를 사용하여 850mJ 선량으로 노출시킵니다.
8. 노출 후 육각 키를 사용하여 지그를 분해하고 PDMS 금형에서 구조화된 OSTE 레이어가 있는 COC 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다.
9. 구조화된 OSTE를 50nm 기공 및 11.8% 공극 밀도의 25mm x 75mm 멤브레인과 접촉시켜 채널이 멤브레인으로 완전히 덮이도록 합니다.
   알림: 적용 과정에서 멤브레인을 가능한 한 똑바로 유지하는 것이 특히 중요합니다.
10. 멤브레인 면이 위로 향하게 하여 60°C로 설정된 열판에 어셈블리를 놓고 멤브레인 위에 깨끗한 유리 슬라이드를 놓고 상단에서 1.6kPa 압력을 가하여 균일한 접착을 보장합니다. 어셈블리를 밤새 가열합니다.
    참고: 이 단계 후에는 본딩 성능과 채널 변형을 평가하는 것이 특히 중요합니다.

4. OSTE-COC 하단 채널 및 장치 조립 준비

1. 1.09:1 w/w 비율로 OSTE를 혼합합니다(5개의 장치에 대해 A부 1.56g과 B부 1.44g이 필요함). 유성 원심 믹서에서 구성 요소를 혼합합니다 : 750 RPM에서 5 분 동안 혼합 한 다음 750 RPM에서 5 분 동안 가스를 제거합니다.
2. 혼합된 OSTE를 팔콘 튜브로 옮기고 진공 데시케이터에서 -800mbar에서 30분 동안 가스를 제거합니다.
3. IPA에서 10분 동안 초음파 처리로 COC 슬라이드를 청소합니다. N₂로 슬라이드를 조심스럽게 말리십시오.
4. 깨끗한 COC 슬라이드를 플라즈마 애셔에 넣고 0.133mbar 압력으로 700W 전력에서 2분 동안 800SCCM 산소 플라즈마로 표면을 처리합니다.
5. 처리된 표면이 PDMS의 구조화된 표면과 접촉하도록 하단 채널의 PDMS 금형에 산화된 COC 슬라이드를 놓습니다. 어셈블리를 Mold-in-Place 지그에 놓고 0.3Nm으로 설정된 토크 렌치로 지그를 조입니다.
6. 가스가 제거된 OSTE가 있는 팔콘 튜브를 가져와 0.8mm ID의 PTFE 튜브를 사용하여 압력 시스템 지침에 따라 조립합니다.
7. PTFE 튜브를 PDMS 금형의 입구에 연결하고 1000mbar 압력을 사용하여 장치를 채웁니다. 유리 면이 위로 향하도록 지그를 마스크 교정장치에 넣고 ND33 필터를 사용하여 1100mJ 선량으로 노출시킵니다.
8. 노출 후 육각 키를 사용하여 지그를 분해하고 PDMS 금형에서 구조화된 OSTE 레이어가 있는 COC 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다.
9. 구조화된 OSTE 층을 상단 채널 어셈블리와 결합하여 상단 및 하단 레이어의 설계가 서로 정렬되고 OSTE 하단 레이어가 멤브레인과 접촉하도록 합니다.
10. 디자인을 Mold-in-Place 지그에 삽입하고 불독 클립을 사용하여 장치에 1.6kPa 압력을 고르게 적용합니다. 지그를 60°C 오븐에 밤새 넣습니다.
    알림: 클립을 고르지 않게 배치하면 접착이 고르지 않을 수 있습니다.

5. 장치 평가

1. 접합 후 현미경으로 장치의 시각적 결함(예: 채널 변형 또는 결합 실패)을 육안으로 평가합니다.
2. 0.02μm 여과된 탈이온수를 30mbar 압력의 채널을 통과시켜 결함이 없는 장치를 테스트합니다. 흐름 채널과 루어 포트 누출 및 물의 흐름을 관찰하십시오.
   알림: 누출을 감지할 수 없고 채널 흐름이 중단되지 않으면 장치를 추가 실험에 사용할 수 있는 것으로 간주됩니다.

6. 장치 설정

1. 2개의 5mL 주사기에 20nm로 여과된 3% H_2O2를 채우고 주사기 펌프에 맞춥니다(필요한 거리에 대한 이동 화살표 사용, 주사기 삽입 및 상단 막대로 제자리에 고정).
   주의! H₂O₂를 취급 할 때는 항상주의하십시오. 실험실 가운, 보호용 고무 장갑 및 보안경을 착용하십시오.
2. 주사기 바늘을 사용하여 14cm 길이의 800μm ID PTFE 튜브를 주사기에 연결하고 Luer 커넥터를 사용하여 장치의 입구에 연결합니다.
3. 20cm 길이의 200μm ID 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK) 튜브를 콘센트에 연결합니다.
4. PEEK 튜브의 다른 쪽 끝을 폐기물 용기에 연결합니다. 설정은 그림 3에서 볼 수 있습니다.
5. 각 주입구에 대해 500μL/min의 유속으로 시린지 펌프를 시작합니다(기기 화면에서: 설정 > 시스템 세트 > 주사기 (제조업체: 의료용 주사기, 주사기: 5mL) > 뒤로 버튼 > 파라미터 (선택: 주입, 반복: 1, 용량: 1.5mL, 흐름: 500μL/분) > 뒤로 버튼> 뒤로 버튼). 폐기물 용기에 흐름을 수집하십시오.
6. 2개의 새 5mL 주사기에 20nm로 여과된 70% 에탄올 2mL를 채웁니다.
7. 이전 주사기를 에탄올로 채워진 주사기로 교체하고 6.5단계에서 설명한 것과 동일한 매개변수를 사용하여 주사기 펌프를 시작합니다.
8. 새 5mL 주사기를 사용하고 5mL의 20nm 여과 인산염 완충 식염수(PBS)로 채웁니다.
9. 이전 주사기를 PBS 충전 주사기로 교체하고 6.1단계를 반복하여 4mL의 PBS로 장치를 플러시합니다. 및 6.5.
   참고: 시스템 설정 파라미터를 Volume: 4 mL(기기 화면에서: Settings > Parameters > (Select: Volume: 4 mL)로 변경해야 합니다.
10. 장치에서 튜브의 플러그를 뽑고 루어 플러그로 각 입구와 출구를 닫습니다.
    알림: PBS를 장치에 그대로 두고 닫기 전에 마이크로피펫을 사용하여 각 입구와 출구에 PBS를 추가하여 공기가 갇히지 않도록 하십시오.
11. 실온(RT)의 어두운 곳에 밤새 장치를 두십시오.
12. 다음 날, PBS 충전 장치를 4mL의 20nm 여과 PBS로 플러시합니다(6.8단계 참조).
13. 두 배출구에서 마지막 1mL의 플로우 스루를 2mL 단백질 저결합 튜브에 모으고 4°C에서 장치에 의해 유입된 입자를 위한 블랭크로 보관합니다.
14. PBS 충전 주사기를 제거하고 공기가 채워진 새 5mL 주사기로 교체합니다.
15. 모든 액체가 장치와 튜브에서 나올 때까지 4mL의 공기로 장치를 퍼지합니다.

7. 표준화된 라텍스 비드를 사용한 장치 테스트

1. 1.0μm 폴리스티렌과 0.1μm 카르복실레이트 비드를 사용하여 표준화된 비드 샘플을 준비합니다. 15mL 튜브에 500μL의 1.0μm 폴리스티렌 비드 표준물질, 1μL의 0.1μm 카르복실레이트 비드 표준물질 및 9499μL의 20nm 여과 PBS를 추가합니다(1.0 및 0.1μm 비드 혼합물의 최종 농도는 5 × 108 비드/mL 및 3.6 × 1010 비드/mL입니다).
2. 비드 샘플을 30초 동안 소용돌이치고 사용하지 않는 동안 +4°C에서 보관합니다.
3. 새 5mL 주사기 하나에 표준화된 비드 혼합물 1.5mL를 채우고 다른 주사기에 1.5mL의 20nm 여과 PBS를 채웁니다.
4. 이전에 부착한 주사기를 제거하고 비드 혼합물 주사기를 첫 번째 주입구 튜브에 부착하고 다른 주입구에 다른 주입구에 부착합니다.
5. 폐기물 용기를 제거하고 각 배출 튜브에 대해 최소 5개의 0.5mL 미세 원심분리기 튜브를 준비합니다.
6. 시린지 펌프 시스템 시작 파라미터를 용량: 1mL로 변경합니다. 유량: 250μL/분
   참고: 사용자의 필요에 따라 250μL/min, 200μL/min, 150μL/min, 100μL/min 및 50μL/min과 같은 다양한 유속을 설정할 수 있습니다. 원하는 결과에 가장 유리한 속도를 선택하기 위한 예비 연구가 권장됩니다.
7. 주사기 펌프를 시작하고 각 미세 원심 분리기 튜브에 5-6 방울의 유출을 수집하십시오.
   알림: 동일한 장치를 여러 번 사용하는 경우 6.8단계에 설명된 대로 장치를 세척하고 모든 커넥터, 플러그 및 바늘을 교체하십시오. 사용한 커넥터, 플러그 및 바늘을 20nm 여과된 70% 에탄올에 최소 30분 동안 그대로 두어 세척합니다. 그런 다음 모든 부품을 20nm 여과된 탈이온수가 들어 있는 튜브로 옮기고 튜브를 완전히 흔든 다음 20nm 여과된 탈이온수 20mL가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 페트리 접시를 셰이커에 30rpm에서 최소 100분 동안 그대로 둔 다음 재사용하기 전에 마른 페트리 접시에서 건조시키십시오(최소 12시간 동안).

8. 소변 샘플을 사용한 장치 테스트

1. 6.1-6.15단계에 설명된 대로 장치를 준비합니다.
2. 소변 멸균 용기를 사용하여 기증자당 100mL의 아침 소변을 수집하고 채취 후 2시간 이내에 처리를 위해 실험실로 전달합니다.
3. 각 소변 샘플을 두 개의 50mL 튜브로 분리하고 RT에서 15분 동안 2'000 x g 으로 원심분리합니다.
4. 상층액을 모으고 펠릿을 버리십시오.
5. 상층액을 상온에서 10'000 x g 에서 30분 동안 원심분리하여 큰 입자와 세포 파편을 제거합니다.
6. 상층액을 모으고 펠릿을 버리십시오.
7. 6.6에 설명된 대로 장치를 세척하십시오.
8. 5mL 주사기를 시료 주입구용으로 준비된 소변 샘플로 채워진 20mL 주사기로 바꾸고, 완충액 주입구를 위해 20mL 여과된 DEPC-PBS 20mL로 채운 또 다른 20mL 주사기로 교체합니다. 주사기 펌프 설정을 BDPlastipak으로 변경합니다. 주사기 : cc; 용량: 20mL; 유량: 250μL/min(최적 유량), 6.2단계에서 설명한 것과 유사. 시린지 펌프를 시작하고 각 배출구의 플로우스루를 별도의 50mL 튜브에 모읍니다.
9. 4°C에서 3,000 x g 에서 각각 100μL까지 100,000개의 분자량 컷오프 농축 튜브를 사용하여 각 플로우 스루를 별도로 농축합니다.
10. 농축액을 0.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
11. 농축된 샘플을 30초 동안 소용돌이친 다음 10초 동안 회전시킵니다.
12. 튜브당 25μL의 시료를 이송하여 시료를 분취하고, 라벨링하고, 장기 보관을 위해 -80°C에서 동결합니다.

9. 컨디셔닝된 매체를 사용한 장치 테스트

1. 6.1-6.15단계에 설명된 대로 장치를 준비합니다.
2. Bajo-Santos et ^al.20에 따르면 총 카운트가 1억 개에 도달할 때까지 37°C에서 5%_CO2 가습 환경에서 세포를 배양합니다.20 세포를 2% B-27 혈청 대체 보충제가 보충된 100mL의 무혈청 배지에 단일 T175 현탁 플라스크로 통과시키고 37°C에서 5%_CO2 가습 환경에서 추가로 48시간 동안 배양합니다.
3. 세포 현탁액을 수집하고 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 제거합니다.
4. 상층액을 다시 수집하고 3,000 x g 에서 +4°C에서 30분 동안 원심분리하여 큰 입자와 세포 파편을 제거합니다.
5. 상층액을 수집하여 분리가 이루어질 때까지 +4°C에서 보관하되 3시간을 넘지 않도록 합니다.
6. 5mL 주사기를 20mL 주사기로 교체하고, 시료 주입구용으로 준비된 조절된 배지로 채우고 완충액 주입구를 위해 20mL 여과 PBS 20mL로 채웁니다.
7. 7.8단계에 설명된 대로 펌프 스테이션에서 설정을 지정합니다.
8. 시린지 펌프를 시작하고 각 배출구의 플로우스루를 별도의 50mL 튜브에 모읍니다.
9. 100,000개의 분자량 컷오프 농축 튜브를 사용하여 +4°C에서 3,000 x g 에서 각각 150μL까지 각 플로우 스루를 별도로 농축합니다.
10. 농축액을 0.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
11. 소용돌이는 30초 동안 샘플을 집중시켰습니다.
12. 농축 샘플을 10초 동안 회전시킵니다.
13. 튜브당 25μL의 시료를 이송하여 시료를 분취하고, 라벨을 부착하고, 장기 보관을 위해 -80°C에서 동결합니다.

10. 초원심분리를 이용한 전기차 분리

1. 고정각 로터가 있는 원심분리기를 사용하여 +4°C에서 70분 동안 100,000 x g 에서 20mL의 소변 또는 조절된 세포 배지를 원심분리합니다.
2. 상층액을 버리고 펠릿을 20nm 여과된 PBS 20mL에 재현탁시킵니다.
3. 10.1에 설명된 대로 다시 원심분리기.
4. 상층액을 버리고 펠릿을 12mL의 20nm 여과된 PBS에 재현탁시킵니다.
5. 스윙 로터를 사용하여 +4°C에서 70분 동안 100,000 x g 의 원심분리기.
6. 상층액을 버리십시오.
   알림: 이번에는 상층액을 버릴 때 주의하십시오. 피펫으로 하는 것이 좋습니다.
7. 펠릿을 100μL의 20nm 여과 PBS에 재현탁시킵니다.
8. 샘플을 분취하고 EV 특성화를 위해 설정 12로 진행합니다. 그렇지 않으면 나중에 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

11. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용한 EV 분리

1. +4°C에서 3,000 x g 에서 15분 동안 100kDa 분자량 컷오프(MWCO) 원심 필터 장치를 사용하여 20mL의 소변 또는 조절된 세포 배지를 500μL로 농축합니다.
2. 농축액을 SEC 컬럼(35nm 부하 범위)으로 옮깁니다.
3. 20nm 여과된 PBS를 컬럼에 붓고 0.5mL 분획 15개를 수집합니다.
4. 제조업체의 지침에 따라 동적 광산란(DLS) 시스템으로 분획을 분석합니다.
5. 선택한 분수를 합산합니다. 감쇠기가 11보다 작고 전체 입자의 30% 이상이 40nm보다 큰 분획을 선택하십시오.
6. 15분 동안 +4°C에서 14,000 x g 에서 3kDa 분자량 컷오프(MWCO) 원심 필터 장치를 사용하여 선택한 분획을 100μL로 농축합니다.
7. 샘플을 분취하고 EV 특성화를 위해 섹션 12로 진행합니다. 그렇지 않으면 나중에 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

12. EV 특성화

1. 냉동실에서 특성화할 샘플을 꺼내 천천히 해동합니다(얼음 블록 또는 +4°C에서).
2. 나노 입자 추적 분석(NTA)을 수행하여 입자 크기 분포 및 양을 결정합니다¹³. 고친화성 T 세포막 단백질 4(TIM-4) 이중 샌드위치 효소 결합 면역 흡착 분석(dsELISA)¹⁴ 을 수행하여 샘플에서 EV의 존재를 확인합니다.

13. 국세청

1. 해동된 EV 샘플을 30초 동안 소용돌이치고 10초 동안 회전시킨 다음 2mL 미세 원심분리기 튜브에서 20nm 여과된 PBS의 1μL에서 999μL로 옮겨 1000배로 희석합니다. 희석에 사용되는 추가 PBS 1mL를 저장하여 입자가 포함되어 있지 않은지 확인합니다. 측정할 때까지 모든 것을 +4°C에서 보관하십시오.
   알림: 사용하기 전에 0.02nm 필터를 통해 PBS를 필터링하십시오.
2. EV 샘플 또는 블랭크를 30초 동안 소용돌이치고 주사기를 사용하여 모듈에 삽입합니다. 모듈에 약 0.7mL의 시료를 채우고 기기에 넣습니다.
3. 제조업체의 지침에 따라 나노 입자 분석기 기기를 사용하여 샘플을 측정합니다.

14. EV 마커용 dsELISA

1. 1μg/mL TIM4-Fc 단백질 용액을 준비합니다. 필요한 각 웰에 100μL의 용액을 옮겨 96웰 ELISA 플레이트의 웰을 코팅하고 +4°C에서 200RPM으로 진탕하여 밤새 배양합니다.
2. 다음날 세척액(1x TBS + 0.05% Tween20 + 2mM CaCl₂)을 준비합니다.
3. 각 우물에 있는 모든 액체를 버리십시오. 세척액 200μL를 넣고 상온에서 200RPM에서 5분 동안 흔들어 각각 잘 씻은 후 버립니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
4. 차단 용액을 준비합니다(1x TBS + 0.05% Tween20 + 1% 소 혈청 알부민). 각 웰에 200μL의 차단 용액을 추가하고 200RPM으로 흔들면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
5. 14.3단계에 설명된 대로 각각을 잘 씻으십시오.
6. 세척 완충액에서 각 시료 희석액 220μL를 준비합니다(최적의 EV 농도는 2.7 × 10 5EVs/μL). 웰당 100μL의 희석된 샘플을 추가하고 두 번의 반복을 수행합니다. 200RPM에서 흔들면서 90분 동안 실온에서 배양합니다.
7. 14.3단계에 설명된 대로 각각을 잘 씻으십시오.
8. 각 웰에 해당 항체 100μL를 추가합니다. EV 및 오염 물질을 확인하기 위해 적절한 EV 마커 사용⁴. 200 RPM으로 흔들면서 2 시간 동안 실온에서 배양합니다. 참고: 2차 항체를 사용하는 경우 14.7-14.8단계를 반복합니다. 그러나 2차 항체의 잠복기를 1시간으로 줄입니다.
9. 14.3단계에 설명된 대로 각각을 잘 씻으십시오.
10. 100μL의 양 고추 냉이 과산화 효소 기질을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 1 분 동안 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양합니다.
11. 반응을 중지하기 위해 각 웰에 1 M H₂SO₄ 를 첨가하십시오.
12. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정합니다.

결과

우리는 분기된 A4F 원리(그림 2B, C)를 기반으로 고처리량 EV 분리를 위해 소프트 리소그래피(그림 2A)를 통해 3D 프린팅된 이중 네거티브 몰드(그림 1)를 사용하여 미세유체 장치를 제작했습니다. 이 설정에는 그림 3에서 볼 수 있듯이 자동화된 방식으로 EV를 격리하기 위해 펌프와 플로우 스루 스테이션이 필요합니다. 첫째, 장치의 개념 증명을 평가하기 위해 직경이 100nm 및 1000nm인 폴리스티렌 비드의 혼합물을 제조하여 각각 소포 및 미세 세포 파편(¹⁰)을 나타냅니다. 선형 속도가 분리 효율에 미치는 영향을 조사하기 위해 분기 흐름이 있거나 없는 비드 혼합물에 대해 다양한 유속으로 실험을 수행했습니다. 모든 실험에서 작은 비드의 회수율은 90%¹⁰ 이상으로 일관되게 유지되어 EV를 회수할 수 있는 장치의 잠재력을 보여주었습니다.

그런 다음 최소한의 사전 처리로 복잡한 생체 유체에서 대용량(>1mL)의 EV를 분리하는 COC-OSTE 장치의 잠재력을 평가하고 비교했습니다. 따라서 10명의 건강한 기증자의 소변(그림 4)과 두 개의 서로 다른 전립선 세포주의 세포 배지(그림 5)를 템플릿으로 사용하여 초원심분리(UC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 A4F 미세유체역학 기반 OSTE-COC 장치의 세 가지 절차에 따라 EV를 동시에 분리했습니다. 분리 후, 나노 입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 입자의 총 수와 크기 분포를 평가했습니다. 평균적으로 OSTE-COC 장치는 UC에 비해 생체 유체에서 더 나은 총 입자 회수율을 보였지만 통계적 유의성은 두 포트의 입자 수를 결합할 때만 달성되었습니다(그림 4A). 장치 성능을 다른 시스템과 비교하려면 R & L 콘센트를 함께 고려해야합니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이, L & R 콘센트 함께 EV 복구 성능이 UC 및 SEC를 능가합니다. 이와 별도로 L-포트는 작은 EV 분획을 포착하도록 설계된 반면, R-포트는 유사한 크기의 다른 분자와 함께 더 큰 EV 분획을 수집하도록 설계되었습니다. 흥미롭게도 OSTE-COC 장치의 R-PORT를 사용한 복구율은 SEC 및 UC만 사용한 복구율보다 약간 높았습니다(그림 4A). CD63 발현은 유사한 패턴을 보였다(그림 4C). 이 결과는 OSTE-COC 장치가 전체 EV 복구에 더 효과적이었음을 나타냅니다. 더 큰 입자 크기 분포를 보여주는 UC를 제외하고는 서로 다른 방법론 간에 동등한 크기 분포가 발견되었습니다(그림 4B).

세포 배지 배양에서 유사한 결과가 관찰되었습니다. 두 시나리오 모두에서 두 장치 포트의 총 입자 회수율은 SEC 또는 UC 방법론에 비해 우수한 성능을 보였습니다(그림 5A,B 참조). 특히, PC3 세포에서 파생된 EV는 다른 실험군과 비교할 때 L-PORT 분포에서 더 큰 균질성과 함께 뚜렷한 크기 분포를 보여주었습니다(그림 5C,D). 또한 CD63 발현 분석은 COC-OSTE 장치를 사용하여 달성된 더 높은 EV 회수율을 확인했습니다(그림 5E,F 참조). 본 연구에서 조사한 다양한 방법론의 분리 특성을 비교한 요약은 표 1에서 확인할 수 있다.

그림 1: 3DP 구불구불한 모양의 이중 네거티브 금형 치수 및 등각 투영 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: COC-OSTE 미세유체 장치. (A) OSTE-COC 장치 제작의 다양한 주요 단계 구성표. (B) 장치 작동 원리. (C) 완성된 장치의 이미지. 눈금자: 15mm. 이 수치는 Priedols et ^al.10 및 Bajo-Santos et ^al.20의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 장치의 실험적 구성. 주사기 펌프는 왼쪽에, OSTE-COC 장치는 가운데에, 회수 스테이션은 오른쪽에 있습니다. 이 수치는 Priedols et ^al.10 및 Bajo-Santos et ^al.20의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 초원심분리(UC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 COC-OSTE 장치를 사용한 10명의 기증자의 소변 EV 크기 분포 및 입자 회수. (A) 나노 입자 추적 분석(NTA)에 의해 각 분리 방법에서 회수된 입자량. 데이터는 평균 +/- 표준 편차로 표시됩니다. * (p<0.05)로 표시되는 통계적 유의성. (B) 상자 그림은 NTA에서 평가한 모든 소변 샘플의 평균 입자 크기 분포를 표시하며, 수염은 최소값과 최대값을 나타냅니다. p-값은 UC와의 비교에서 도출되었으며, ****는 높은 통계적 유의성을 나타냅니다(p<0.0001). (C) 각 분리 방법에 대해 이중 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(dsELISA)을 사용하여 평가한 평균 CD63 양의 중앙값 및 범위는 모든 샘플에서 계산되었습니다. L-포트: 왼쪽 포트; R-포트: 오른쪽 포트. 이 그림은 Bajo-Santos et ^al.20의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 다양한 방법을 사용하여 PC3 및 LNCaP 전지에서 분리된 EV의 특성 분석. (A) 평균+/- 표준 편차로 표시되는 나노 입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 PC3 매체에서 회수된 입자량. (B) NTA를 사용하여 LNCaP 세포 매질에서 회수된 입자량은 평균 +/- 표준 편차로 표시됩니다. (C) 범위와 함께 PC3 배양에서 EV의 중간 입자 크기 분포는 NTA에 의해 결정되었습니다. (D) 범위가 있는 LNCaP 배양에서 분리된 EV의 중간 크기 분포. (E) 이중 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(dsELISA)을 사용한 PC3 세포주 유래 EV에 대한 각 분리 방법에 대한 CD63 발현의 중앙값 및 범위. (F) 각 분리 방법에 대한 dsELISA에 의한 LNCaP 유래 EV CD63 발현의 중앙값 및 범위. UC: 초원심분리; SEC: 크기 배제 크로마토그래피; L-포트: 왼쪽 포트; R-포트: 오른쪽 포트. 이 그림은 Bajo-Santos et ^al.20의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

	UC (영어)	초	COC-OSTE (영어)
처리 시간/샘플	++/+++	+++	+
처리량	++	+	+++
비용/샘플	+	+++	++
순도	+	+++	++
자동화	++	+	+++
EV 수율	++	++	+++
사이즈 선택	+	++	++

표 1. EV의 절연 특성과 UC, SEC 및 COC-OSTE 장치의 세 가지 방법 비교. UC: 초원심분리; SEC: 크기 배제 크로마토그래피. COC-OSTE: 고리형 올레핀 공중합체-오프-화학량론 티올-엔. +: 낮음; ++: 중간; +++: 높음. * 장치에 따라 다릅니다.

토론

제시된 미세유체 장치는 생물학적 유체에서 EV를 분리하고 추출하기 위한 유망한 방법을 제공하여 UC 및 SEC¹²와 같은 기존 골드 스탠다드 방법의 중요한 한계 중 일부를 해결합니다. UC 및 SEC는 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리며 수율이 낮은 것으로 알려져 있어 많은 양의 EV가 필요한 고처리량 애플리케이션에는 적합하지 않습니다^21,22. 대조적으로, 설명된 미세유체 장치는 최소한의 사용자 입력으로 최대 20mL의 생물학적 유체를 지속적으로 처리할 수 있어 산업 또는 임상 환경에서 잠재적인 게임 체인저가 될 수 있습니다. 이 미세유체 장치의 주요 장점 중 하나는 수동 단계를 포함하는 기존 방법에 비해 EV 절연을 표준화하고 재현성을 개선할 수 있다는 것입니다. 대량 제조를 통해 EV 절연 장치 제조의 변동성을 줄임으로써 장치의 성능을 더 잘 제어하고 일관성을 유지할 수 있으며, 이는 EV 기반 치료 및 진단과 같은 응용 분야에 매우 중요합니다. 또한 적절한 기판의 반응 사출 성형을 통한 대량 제조와의 호환성은 확장성과 광범위한 채택 가능성을 더욱 향상시킵니다.

재현성과 일관된 성능을 보장하려면 칩을 생산하고 실험에 사용하기 위해 광범위하고 잘 정의된 프로토콜이 필요합니다. 이 칩은 산업화를 염두에 두고 설계되었습니다. 그러나 실험실 환경에서 장치를 제조하는 동안 기포 형성을 방지하고, 정밀하고 견고한 결합을 보장하고, 실제 실험에서 예상되는 것보다 더 높은 유속에서 철저한 테스트를 수행하는 데 주의를 기울여야 합니다. 이 예방 조치는 COC-OSTE 장치에 특히 중요한데, 특히 높은 유속에서 접합 실패로 인해 누출이 발생하기 쉽기 때문입니다. 또한 OSTE는 감광성 소재이기 때문에 UV에 불필요하게 노출되지 않도록 황색광에서 장치 제작을 수행해야 합니다. 이 기술은 아직 초기 단계에 있기 때문에 이 새로운 방법에 대한 표준화된 프로토콜이 아직 확립되지 않았고 액체 점도가 결과에 따라 EV 격리 효율에 분명히 영향을 미칠 수 있기 때문에 연구원들은 특정 응용 분야에 대한 최적의 설정을 식별하기 위해 다양한 유속을 실험해야 합니다. 이러한 지침을 따르고 표준화 문제를 해결함으로써 EV 절연을 위한 이 미세유체 장치의 잠재력은 다양한 연구 분야 및 응용 분야에서 완전히 실현될 수 있습니다.

미세유체 장치를 사용하는 EV 분리 방법은 성능을 최적화하기 위해 광범위한 수정 및 문제 해결을 허용합니다. 입자 분리를 개선하기 위해 연구원들은 더 긴 채널, 다양한 막 다공성 및 공극 밀도, 변경된 치수를 탐색할 수 있습니다. 작은 입자 배출구에 큰 입자가 많은 경우 더 높은 버퍼 입구 속도를 테스트하는 것이 도움이 될 수 있으며, 큰 입자 배출구에 작은 입자가 많은 경우 더 긴 채널 또는 더 큰 기공이 있는 멤브레인으로 실험하는 것이 좋습니다. 입자 흡수 문제를 해결하려면 유속, 표면 수정 및 OSTE 구성을 조정하거나 UV 노출 시간을 변경해야 할 수 있습니다. 불안정 및 누출이 발생하는 장치의 경우 유속을 줄이고 적절한 접착을 보장하는 것이 중요한 단계입니다. EV 손상을 최소화하기 위해 연구원들은 유속을 줄이고, 장치 멸균 후 PBS로 더 철저히 세척하고, 더 작은 멤브레인 공극 또는 대체 금형 설계 기술 및 재료 사용을 고려할 수 있습니다. 이러한 조정을 통해 미세 유체 장치를 미세 조정할 수 있어 EV 연구 및 관련 분야의 다양한 응용 분야에 대한 잠재력을 발휘할 수 있습니다. 또한 장치의 성능을 최적화하기 위해 밀도 및 점도 측정을 포함한 업스트림 시료 특성화를 통합하여 유량 매개변수를 조정할 수 있습니다. 더욱이, 시료의 성질에 특히 강조되어야 하는데, 이는 생체유체의 확립된 비멸균성을 감안할 때²³. 결과적으로, 임상 적용에서 투여하기 전에 샘플의 멸균을 적절하게 고려해야 합니다.

이러한 어려움에도 불구하고 미세유체 장치는 다양한 연구 분야에서 엄청난 잠재력을 보유하고 있습니다. 대량의 매우 이질적인 샘플에서 EV를 지속적으로 분리할 수 있는 기능은 자동화의 문을 열어 고처리량 애플리케이션을 촉진하고 다양한 소스의 EV에 대한 보다 심층적인 분석을 가능하게 합니다. 이 미세유체 모듈을 중공사 세포 바이오리액터 카트리지 또는 고분해능 유세포 분석기와 같은 다양한 장치에 통합하면 EV 애플리케이션을 보다 산업 친화적으로 만들고 약물 전달, 진단 및 화장품과 같은 분야에서 혁신을 주도할 수 있습니다⁴. 전반적으로, 이 미세유체 장치는 EV 연구 분야에서 중요한 진전을 나타내며 광범위한 연구 및 산업 환경에서 유망한 응용 분야로 EV 격리를 위한 효율적이고 표준화된 방법을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.1 & 마이크로; m 카르복실레이트 FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	재고 농도: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT에 따라 다름)
0.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	Starstedt	72.704
1 mL Luer cone syringe 일회용 without needle RAYS		TUB1ML
1.0 µ m 폴리스티렌 FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	재고 농도: 1 x 1010 beads/mL (LOT에 따라 다름)
10 mL 혈청학적 피펫	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters	Merck Millipore	UFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubes	Eppendorf	30108132
20 mL syringes	BD PlastikPak
250 &마이크로; m ID 폴리에테르 에테르 케톤 튜빙	Darwin Microfluidics	CIL-1581
3 kDa MWCO 원심 필터 장치	Merck Millipore,UFC200324
5 mL 의료용 주사기(바늘 없음	Anhui Hongyu Wuzhou Medical	159646
50 mL 원추형 튜브	Sarstedt	62.547.254
70 Ti 고정각 초원심분리기 로터	Beckman Coulter
800 &마이크로; m ID 폴리테트라플루오로에틸렌 튜빙	Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
96 웰 마이크로플레이트, f-bottom, med. 결합	Greiner Bio-One	655001	ELISA 플레이트
B-27 보충제(50개), 무혈청	Thermo Fisher Scientific	17504044
소 혈청 알부민	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Topas 현미경 슬라이드 플랫폼	Microfluidic Chipshop	10000002
COC Topas 현미경 슬라이드 플랫폼 2 x 16 Mini Luer	미세유체 칩샵	10000387
Elveflow OB1 압력 컨트롤러	Elvesys Group
Luer 커넥터	Darwin Microfluidics	CS-10000095
마스크 정렬기 Suss MA/BA6	SUSS MicroTec 그룹
믹서 Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300	나노 입자 분석기
광학 현미경 Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg 무료입니다. 피셔 생물 시약. 100g	Fisher Scientific	BP2944-100
PC 멤브레인(50nm 공극 직경, 11.8% 밀도)	it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
페트리 접시, 멸균	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35nm 컬럼	Izon	SP5	SEC 컬럼
QSIL 216 실리콘 엘라스토머 키트	PP& S
Resin Tough Black	Zortrax
SW40 Ti 스윙 초원심분리기 로터	Beckman Coulter	331301
주사기 펌프	DK Infusetek	ISPLab002
T175 서스펜션 플라스크	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-Fc 단백질	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)	SigmaAldrich	T0440-100ML	양고추냉이 과산화효소 기판
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
초원심분리기 Optima L100XP	Beckman Coulter
초음파 세척 장치 P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
범용 마이크로플레이트 분광 광도계	Bio-Tek Instruments	71777-1
소변 수집 컵, 150mL, 멸균	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25 주사기 필터	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		동적 광 산란(DLS) 시스템
Zortrax Inkspire	조트랙스