극저온 전자 현미경(cryoEM) 그리드에 지지층을 적용하면 입자 밀도를 높이고, 공기-물 계면과의 상호 작용을 제한하고, 빔 유도 동작을 줄이고, 입자 배향 분포를 개선할 수 있습니다. 이 백서에서는 cryoEM 그리드를 그래핀 단층으로 코팅하여 cryo-sample 전처리를 개선하기 위한 강력한 프로토콜에 대해 설명합니다.
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방법 논문
고분해능 구조 측정을 위해 Monolayer Graphene을 Cryo-Electron Microscopy Grid에 적용
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
극저온 전자 현미경(cryoEM)에서 정제된 거대분자는 구멍이 있는 탄소박이 있는 그리드에 적용됩니다. 그런 다음 분자를 블롯트하여 과도한 액체를 제거하고 약 20-100nm 두께의 유리질 얼음 층에서 약 1μm 너비의 호일 구멍에 부유하여 빠르게 동결합니다. 결과 샘플은 극저온 투과 전자 현미경을 사용하여 이미지화되고 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리 후 거의 원자 분해능 구조를 결정할 수 있습니다. CryoEM이 널리 채택되었음에도 불구하고 시료 전처리는 CryoEM 워크플로우에서 여전히 심각한 병목 현상을 겪고 있으며, 사용자는 부유 유리체 얼음에서 시료가 제대로 작동하지 않는 것과 관련된 문제에 자주 직면합니다. 최근에는 그래핀의 단일 연속 층으로 CryoEM 그리드를 수정하는 방법이 개발되었으며, 그래핀은 종종 이미징 영역의 입자 밀도를 증가시키고 입자와 공기-물 계면 간의 상호 작용을 줄일 수 있는 지지 표면 역할을 합니다. 여기에서는 CryoEM 그리드에 그래핀을 적용하고 결과 그리드의 상대적 친수성을 신속하게 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 특징적인 회절 패턴을 시각화하여 그래핀의 존재를 확인하는 EM 기반 방법을 설명합니다. 마지막으로, 상대적으로 낮은 농도의 순수 샘플을 사용하여 Cas9 복합체의 2.7 Å 분해능 밀도 맵을 신속하게 재구성하여 이러한 그래핀 지지체의 유용성을 입증합니다.
서론
단일 입자 극저온 전자 현미경(cryoEM)은 생물학적 거대분자를 시각화하는 데 널리 사용되는 방법으로 발전했습니다1. 직접 전자 검출 2,3,4, 데이터 수집5 및 이미지 처리 알고리즘 6,7,8,9,10의 발전에 힘입어 CryoEM은 이제 빠르게 증가하는 거대분자11의 원자 분해능에 가까운 3D 구조를 생성할 수 있습니다. 더욱이, 접근법의 단일 분자 특성을 활용함으로써, 사용자는 단일 샘플 12,13,14,15로부터 여러 구조를 결정할 수 있으며, 이는 이종 구조 앙상블을 이해하기 위....
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프로토콜
1. CVD 그래핀의 제조
- 아래와 같이 그래핀 에칭 용액을 준비한다.
- 4.6g의 과황산암모늄(APS)을 1M 용액용 50mL 비커에 있는 분자 등급 물 20mL에 녹이고 알루미늄 호일로 덮습니다. 1.2단계를 진행하는 동안 APS가 완전히 용해되도록 합니다.
- 메틸 메타크릴레이트(MMA) 코팅을 위한 CVD 그래핀 절편을 준비합니다. CVD 그래핀의 정사각형 부분을 조심스럽게 자릅니다. 깨끗한 페트리 접시 안에 있는 커버슬립(50mm x 24mm)에 사각형을 옮기고 스핀 코터로 운반하는 동안 덮습니다.
알림: 18mm x 18mm 정사각형은 25-36개의 그래핀 코팅 그리드를 생성해야 합니다.
2. CVD 그래핀에 MMA 코팅
- 스핀 코터 설정을 60rpm에서 2,500초 고속 스핀으로 설정합니다. CVD 그래핀을 적절한 크기의 척에 조심스럽게 놓습니다.
참고: 이상적으로는 CVD 그래핀이 선택한 척의 가장자리 위로 1-2mm 확장되어 진공 시스템으로의 MMA 흡인을 방지합니다. - Take/Absorb 버튼을 눌러 진공 펌프를 결합하....
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결과
여기에 설명된 장비(그림 1)와 프로토콜(그림 2)을 사용하여 그래핀 코팅 CryoEM 그리드를 성공적으로 제작하면 호일 구멍을 덮는 그래핀 단층이 생성되며, 이는 특징적인 회절 패턴으로 확인할 수 있습니다. 그래핀 표면에 대한 단백질 흡착을 촉진하기 위해 UV/오존 처리를 사용하여 산소 함유 작용기를 설치하여 표면을 친수성으로 만들 수 있습니다. 그러나 공기 중의 탄화수소 오염 물질은 UV/오존 처리 후 5분 이내에 그래핀 표면에 흡착되어 이 효과를 상쇄할 수 있습니다38,39. 중요한 것은 UV/오존 처리 기간과 처리 및 플런지 사이의 경과 시간이 모두 시료 품질에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 표면 접촉각을 기반으로 코팅된 그리드의 친수성 특성을 평가하는 간단한 방법을 사용하여 이러한 효과를 시연합니다(
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토론
CryoEM 시료 전처리에는 여러 가지 기술적 문제가 수반되며, 대부분의 워크플로우에서는 연구원이 손상을 방지하기 위해 극도로 주의를 기울여 깨지기 쉬운 그리드를 수동으로 조작해야 합니다. 또한 유리화에 대한 모든 샘플의 적합성은 예측할 수 없습니다. 입자는 종종 공기-물-계면 또는 그리드를 덮고 있는 고체 지지 포일과 상호 작용하며, 이는 매우 높은 단백질 농도가 적용되지 않는 한 입자가 선호하는 방향을 채택하거나 이미징 구멍에 진입하지 못하게 할 수 있습니다24. 구멍이 뚫린 CryoEM 그리드를 그래핀의 연속적인 단층으로 오버레이하는 것은 현미경 사진의 입자 분포를 개선하고, 낮은 농도에서 입자 수를 증가시키고, 공기-물-계면(30)에서의 상호 작용에 의해 구동되는 선호 방향을 줄이는 데 엄청난 가능성을 보여주었습니다.
CryoEM 그리드를 위한 기존 그래핀 코팅 프로토콜의 한계는 코팅 공.......
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공개 사항
저자는 공개할 갈등이 없습니다.
감사의 글
표본은 MIT.nano의 CryoEM 시설에서 Arnold and Mabel Beckman Foundation 덕분에 획득한 현미경으로 준비되고 이미지화되었습니다. 접촉각 이미징 장치는 MIT Metropolis Maker Space에서 인쇄되었습니다. 우리는 Nieng Yan과 Yimo Han의 실험실, 그리고 이 방법의 채택을 통하여 그들의 지원을 위한 MIT.nano에 직원에게 감사한다. 특히 통찰력 있는 토론과 피드백을 주신 Guanhui Gao 박사와 Sarah Sterling 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 NIH 보조금 R01-GM144542, 5T32-GM007287 및 NSF-CAREER 보조금 2046778의 지원을 받았습니다. 데이비스 연구실의 연구는 알프레드 P. 슬론 재단(Alfred P. Sloan Foundation), 제임스 H. 페리 기금(James H. Ferry Fund), MIT J-클리닉(MIT J-Clinic) 및 화이트헤드 가족(Whitehead Family)의 지원을 받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 250 mL 비커(3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL 비커(2x) | Corning | 1000-50 | |
| 아세톤 | Fisher | A949-4 | |
| 알루미늄 호일 | Fisher | 15-078-292 | |
| 과황산암모 | Fisher | (I17874 | |
| 커버슬립 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD 그래핀 | 그래핀 슈퍼마켓 | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow 방전기 | Ted-Pella | 91000S | |
| 에탄올 | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| 플랫 팁 핀셋 | Fisher | 50-239-60 | |
| 유리 커터 | Grainger | 21UE26 | |
| 유리 페트리 플레이트 및 커버 | VWR | 75845-544 | |
| 유리 혈청학 피펫 | Fisher | 13-676-34D | |
| 그리드 보관 케이스 | EMS | 71146-02 | |
| 핫 플레이트 | Fisher | 07-770-108 | |
| 이소프로판올 | 시그마 | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| 실험실 가위 | 피셔 | 13-806-2 | |
| 메틸-메타크릴레이트 EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| 분자 등급 물 | Corning | 46-000-CM | |
| 네거티브 액션 핀셋 (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 피펫 | Rainin | 17014392 | |
| P200 피펫 | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| 피펫 팁 | Rainin | 30389291 | |
| 구멍이 있는 탄소가 있는 Quantifoil 그리드 | EMS | Q2100CR1 | |
| 스핀 코터 | SetCas | KW-4A | SCA-19-23 |
| 직선 가장자리 | ULINE | H-6560 | |
| 온도계 | 그레인저 | 3LRD1 | |
| UV/오존 클리너 | BioForce | SKU: PC440 | |
| 진공 건조기 | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman 종이 | VWR | 28297-216 |
참고문헌
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife
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재인쇄 및 허가
