후성유전학 분야를 처음 접하는 연구자들은 CUT&Tag가 ChIP 분석에 대한 훨씬 더 쉬운 대안임을 알게 될 것입니다. CUT&Tag는 희귀 및 원발성 세포 집단에 대한 후성유전학 연구에 큰 도움을 주어 극소수의 세포에서 고품질 데이터를 생성했습니다. 이 프로토콜은 마우스 뒷다리 근육에서 분리된 마우스 근아세포에 대해 H3K4me1 CUT&Tag 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tagmentation) 분석 사용
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜 논문은 새로운 연구자에게 CUT&Tagation(Cleavage Under Targets and Tagmentation)을 사용하여 염색질 결합 인자, 히스톤 마크 및 히스톤 변이체의 게놈 위치를 프로파일링하는 방법에 대한 전체 세부 정보를 제공하는 것을 목표로 합니다. CUT&Tag 프로토콜은 마우스 근아세포 및 갓 분리한 근육 줄기 세포(MuSC)와 매우 잘 작동합니다. 그들은 세포가 Concanavalin-A 비드로 고정될 수 있는 한 많은 다른 세포 유형에 쉽게 적용될 수 있습니다. CUT&Tag와 비교했을 때, 염색질 면역침전(ChIP) 어세이는 시간이 많이 걸리는 실험입니다. ChIP 분석은 염색질 물질을 면역침전에 사용하기 전에 염색질의 전처리가 필요합니다. 가교 ChIP (X-ChIP)에서 염색질의 전처리에는 염색질을 단편화하기위한 교차 결합 및 초음파 처리가 포함됩니다. 천연 ChIP(N-ChIP)의 경우, 단편화된 염색질은 일반적으로 미세구균 뉴클레아제(MNase) 분해에 의해 달성됩니다. 초음파 처리와 MNase 분해는 모두 ChIP 실험에 약간의 편향을 도입합니다. CUT&Tag 분석은 ChIP에 비해 더 적은 단계 내에 완료할 수 있고 훨씬 더 적은 세포를 필요로 하지만 다양한 게놈 위치에서 전사 인자 또는 히스톤 표시에 대한 보다 편향되지 않은 정보를 제공합니다. CUT&Tag는 최소 5,000개의 셀로 작동할 수 있습니다. ChIP보다 감도가 높고 배경 신호가 낮기 때문에 연구자들은 염기서열분석 후 수백만 번의 판독만으로도 신뢰할 수 있는 피크 데이터를 얻을 수 있을 것으로 기대할 수 있습니다.
서론
CUT&Tag 분석은 ChIP1의 몇 가지 명백한 결함을 보완하기 위해 발명되었습니다. ChIP의 두 가지 주요 단점은 1) 염색질을 단편화할 때 발생하는 바이어스와 2) 낮은 세포 수로 작업할 수 없다는 것입니다. X-ChIP 분석은 염색질 단편을 얻기 위해 초음파 처리 또는 MNase 분해에 의존하는 반면, N-ChIP는 주로 MNase 분해를 사용하여 뉴클레오솜을 얻습니다. 초음파 처리는 프로모터 영역2와 같은 이완 된 염색질 위치에 대한 편향을 보이며, 명백하게, MNase 소화는 또한 이완 된 염색질 섬유에서보다 효율적으로 작동합니다. 더욱이, 일부에서는 MNase 분해가 DNA 염기서열 의존성 편향(DNA sequence-dependent bias)을 나타낸다고 보고했다3. 따라서 ChIP 분석의 투입 준비 단계에서 모든 종류의 게놈 위치에서 완벽하게 무작위로 염색질 단편을 얻는 것은 불가능합니다. 또한 ChIP 분석은 일반적으로 CUT&Tag에 비해 더 높은 배경 신호를 생성하며 피크가1,4,5
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프로토콜
이 원고에 제시된 방법은 모두 광저우 실험실의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 이 원고의 대표 결과를 생성하는 데 사용된 마우스는 광저우 실험실의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 보관되고 유지되었습니다.
1. 마우스 뒷다리 근육에서 근모세포 분리(마우스 1마리 사용 예)
- 빙초산을 ddH2O로 0.02 M로 희석하고 고압 멸균한다.
- 콜라겐(쥐 꼬리에서)을 0.02M 아세트산으로 0.1mg/mL로 희석합니다.
- 이 콜라겐 용액을 배양 접시에 추가하여 37°C 세포 인큐베이터에서 하룻밤 동안 접시 바닥을 코팅합니다.
- 사용하기 전에 콜라겐 용액을 제거하고 1x PBS로 접시를 두 번 씻으십시오. 콜라겐 용액은 8-10 회 재사용 할 수 있습니다.
- 8-12주 된 쥐를 희생합니다. (늙은 쥐는 MuSC와 근아세포의 수율이 낮습니다.)
- 쥐의 모든 뒷다리 근육을 분리하여 10cm 접시에 넣습니다.
- 1x PBS(페니실린/스트렙토마이신 포함)를 사용하여 근육을 4번 헹굽니다.....
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결과
세포를 Concanavalin-A beads에 결합하기 전에 현미경으로 세포 현탁액을 확인하십시오. 따라서 Concanavalin-A 비드로 세포를 배양한 후 샘플 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 현미경을 사용하여 상층액을 다시 관찰해야 합니다. 이는 세포가 Concanavalin-A 비드에 의해 얼마나 효율적으로 포획되었는지 평가하기 위한 것입니다. 7 x 105 cells/mL를 포함하는 세척 완충액은 현미경으로 볼 때 그림 1A 와 같아야 합니다. 대조적으로, 그림 1B 는 비드가 모든 세포를 제거한 Concanavalin-A 비드 결합 후의 상층액을 보여줍니다. Concanavalin-A beads가 세포를 효율적으로 포획하지 못했다면 CUT&Tag의 다음 단계를 진행하는 것은 의미가 없습니다. 세척 완충액은 Concanavalin-A 비드에 대한 세포막의 결합을 폐지할 수 있으므로 혈청 함량 .......
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토론
특정 CUT&Tag 반응에 필요한 특정 세포 수는 테스트 할 히스톤 마크 / 변이체 또는 염색질 결합 단백질의 농축에 전적으로 의존합니다. 일반적으로 H3K4me1, H3K4me3 및 H3K27ac 등과 같은 매우 풍부한 히스톤 표시의 경우 25,000-50,000 개의 근 아세포가 하나의 CUT & Tag 반응에 충분합니다. 그러나 일부 희귀 염색질 결합 단백질은 최대 250,000개의 세포가 필요할 수 있습니다. CUT&Tag 어세이에 사용되는 셀 수는 매우 중요하며, 잘 처리하지 않으면 일반적으로 어세이의 실패를 유발합니다. CUT&Tag 반응에서 과도한 수의 세포를 사용하는 것은 특히 매우 풍부한 히스톤 마크를 테스트 할 때 해롭습니다. 너무 많은 세포로 시작한다는 것은 각 세포에 할당된 항체가 충분하지 않다는 것을 의미합니다. CUT&Tag는 매우 낮은 셀 수에서 작동할 뿐만 아니라 실제로 단일 셀 레벨1에서 적용할 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 밝힐 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국과학원(Chinese Academy of Science)의 전략적 우선 순위 연구 프로그램(Strategic Priority Research Program, XDA16020400에서 PH까지)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (32170804에서 PH).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| bFGF | R& D 시스템 | 233-FB-025 | |
| 콜라겐 | 코닝 | 354236 | |
| 콜라겐 분해 효소 II | Worthington | LS004177 | |
| Concanavalin-A | 시그마-알드리치 | C5275 | |
| Concanavalin-A 구슬 | Bangs Laboratories | BP531 | |
| 디지토닌 | 시그마-알드리치 | 300410 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| 소태아 혈청 | Hyclone | SH30396.03 | |
| H3K4me1 항체 | abcam | ab8895 | |
| Ham's F10 매체 | Thermo Fisher Scientific | 11550043 | |
| Hyperactive Universal CUT& Illumina용 태그 분석 키트 | Vazyme | TD903 | 이 키트는 |
| 1.5mL EP 튜브용 마그네틱 랙 | Qualityard | QYM06 | |
| 8-PCR 튜브 스트라이프용 마그네틱 랙 | Anosun Magnetic | CLJ16/21-021 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | NEB | M0541L | 라이브러리 제작 PCR 반응용 |
| pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | 사용하기 전에 어댑터와 함께 장착해야 |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| Proteinase K | Beyotime | ST535-100mg | |
| RPMI-1640 배지 | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Secondary 항체 (Guinea Pig anti-rabbit IgG) | 항체-온라인 | ABIN101961 | |
| Spermidine | Illumina용 Sigma-Aldrich | S2626 | |
| TruePrep 인덱스 키트 V2 | Vazyme | TD202 | 이 키트는 Illumina N7XX 및 N5XX 프라이머를 제공합니다 |
| VAHTS DNA 클린 비즈 | Vazyme | N411 | Ampure XP 비드를 대체할 수 있습니다. CUT&를 순화할 수 있습니다. 라이브러리에 태그를 지정하고 크기별로 DNA 단편을 선택합니다. |
참고문헌
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930(2019).
- Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLi....
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재인쇄 및 허가
