현미경 검사의 도움을 받은 병기 간절제술 절차를 위한 연관 간 분할 및 문맥 결찰의 마우스 모델

요약

단계적 간절제술(ALPPS)을 위한 간 분할 및 문맥 결찰술의 연관성은 1단계 수술 후 몇 주 후에 놀라운 간 재생을 초래하는 것으로 나타났습니다. ALPPS를 받은 동물 모델은 잠재적인 간 재생 능력을 탐색하고 유리한 임상 결과를 달성하기 위해 개발되었습니다.

초록

간절제술은 간 악성 종양의 주요 치료법으로 널리 알려져 있습니다. 그러나 수술 후 간부전은 여전히 수술 전후 사망률의 주요 원인으로 남아 있어 환자의 결과에 심각한 영향을 미치고 있습니다. 튼튼한 간 환경에서는 미래의 간 잔존량(FLR)이 25%를 초과해야 하며, 간경변증의 경우 이 요구량은 40% 이상으로 증가합니다. FLR의 부적절성은 현재 간 수술 진행에 큰 장애물이 되고 있습니다.

FLR 비대를 향상시키는 전통적인 방법은 주로 문맥 색전술(PVE)에 중점을 두지만 그 효과는 상당히 제한적입니다. 최근 몇 년 동안 간절제술(ALPPS)을 위한 간 분할 및 문맥 결찰 연관으로 알려진 간 분할 및 문맥 결찰을 포함하는 새로운 이족 간절제술 방법에 대한 수많은 보고가 있었습니다. ALPPS는 효율적이고 상당히 FLR 비대를 유발한다는 점에서 PVE를 능가합니다. 그러나 ALPPS를 촉진하는 간 재생을 촉진하는 자세한 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 따라서 동물 모델에서 ALPPS를 복제하는 것은 간 재생의 분자 메커니즘을 철저히 조사하는 데 중요하며, 귀중한 이론적 및 실제적 통찰력을 제공합니다.

서론

간은 엄청난 재생 잠재력을 가지고 있으며, 다양한 간 질환에 대한 절제 후 단 3개월 이내에 신진대사 요구량을 빠르게 증식하고 회복합니다¹. 그러나 종양 가장자리의 완전성을 확인하는 것은 불가피한 일이며, 이는 광범위한 간 절제술의 불가피성을 필요로 합니다. 따라서 미래의 간 잔여물(FLR)로 알려진 참여적 간 환경의 충분한 양을 확보하는 것이 가장 중요하다². ALPPS는 지난 수십 년 동안 간 수술의 획기적인 기술로, 특히 종양 절제 후 잔존 간 용적이 부족한 환자를 위해 맞춤화되었으며, 간 종양 수술 영역에서 가장 상서로운 돌파구 중 하나로 알려져 있습니다³.

ALPPS 동물 모델 개발에서 놀라운 진전이 이루어졌습니다. 이상적인 모델은 일반적으로 보존된 간엽에서 독립적인 혈액 유입(문맥 및 간동맥)과 유출(간정맥)을 필요로 하며, 부수적 순환을 방지하기 위해 보존된 간엽과 절제 예정인 간엽을 명확하게 분리해야 한다⁴. ALPPS는 남아 있는 간 조직의 빠른 간 재생을 자극하지만, 이 과정의 구체적인 메커니즘은 아직 불분명합니다.

현재 ALPPS 모델은 대형 동물 모델(예: 돼지 및 양), 중형 모델(예: 토끼 및 설치류), 소형 모델(예: ^{마우스)의} 세 가지 유형으로 분류됩니다5. 생쥐의 빠른 번식과 유전자 변형의 용이성은 간 재생 메커니즘에 대한 심층적인 연구에 특히 효과적이다⁶. 또한 생쥐의 간 구조, 특히 중간 간정맥은 인간의 간 구조와 매우 유사하여 ALPPS 모델 개발에 매우 적합합니다.

임상에 있는 대부분의 간세포암 환자는 연구에서 일반적으로 사용되는 건강한 간 모델과 달리 기저 간 질환을 가지고 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다⁷. 따라서, 간 섬유증 또는 바이러스 감염이 사전 조절된 마우스를 사용하면 다양한 간 질환이 있는 환자에서 볼 수 있는 수술 반응 및 수술 후 간 재생을 보다 정확하게 시뮬레이션할 수 있다⁸. 이 접근법은 임상적 관련성이 있는 새로운 치료 표적을 밝힐 수 있습니다.

지금까지 취리히 대학 (University of Zurich)과 도쿄 대학 (University of Tokyo)과 같은 몇몇 유명한 연구 그룹은 쥐 ALPPS 모델 ^9,10을 성공적으로 개발했습니다. 통제된 조건에서 표준화된 쥐 모델을 만들면 ALPPS 시술 후 관찰되는 빠른 간 재생에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜의 모든 실험은 Jiangxi Provincial People's Hospital(번호 70/2022)의 수의학 당국의 승인을 받았습니다. 또한, 모든 실험 단계는 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

1. 수술 시작

참고: 20-22g의 수컷 C57BL/6 마우스는 환기가 잘 되는 케이지에 보관되었으며 12시간/12시간의 밝음/어두운 주기로 표준 병원체가 없는 환경에서 유지되었습니다. 동물들은 22 ± 1 °C의 통제된 주변 온도에서 음식과 물에 대한 자유로운 접근을 제공받았습니다. 수술은 전용 미세수술실에서 수술용 현미경을 사용하여 수행되었습니다(그림 1). 가짜 그룹의 쥐는 개복술에 의해서만 수술을 받았고, 간에 대해서는 수술을 하지 않았다. PVL 그룹에서는 문맥 가지의 일부를 결찰하였고, ALPPS 그룹에서는 간맥 결찰(PVL)을 기준으로 중간 간엽을 절제하였다.

1. 생쥐에게 수술 전 4-6시간의 금식 기간을 둡니다.
   참고: 먹는 것은 쥐의 위 팽창을 유발하기 때문에 단식이 필요하며, 이는 수술 영역을 열악하게 만들고 위벽에 우발적인 손상을 입히기 쉽습니다.
2. 마이크로 집게, 가위, 복부 견인기를 포함한 멸균 수술 기구를 준비하고 미리 준비한 8-0 사이드 테이블에 있는 문맥 결찰 봉합사. 멸균 거즈와 면봉으로 구성된 수술 중 재료를 37°C 식염수에 담그십시오.
3. 유도를 위해 동물을 5% v/v 이소플루란에 30초 동안 노출시킨 다음 깊은 마취 상태에 도달할 때까지 3vol% 이소플루란을 사용하여 유지 마취를 합니다. 마취 수준을 확인하기 위해 발가락 꼬집기 반사를 검사합니다. 유도 단계에서 5mg/kg의 용량으로 메데토미딘을 피하 주사합니다.
4. 동물의 눈에 연고를 바르고 5% 포도당과 혼합된 젖산 링거 용액 1mL를 피하로 주입하여 양쪽 하복부에 용량을 균등하게 나눕니다.
5. 작은 동물 이발기를 사용하여 복부 부위를 꼼꼼하게 면도하며, 시푸이드 돌기에서 생식기 부위까지 2cm의 측면 영역을 포함합니다.
6. 포비돈-요오드와 알코올을 번갈아 가며 수술 부위를 3회 철저히 소독합니다.
7. 수술용 메스를 사용하여 피부에 2.5-3.0cm의 정중선을 절개한 다음 수술용 가위를 사용하여 복강을 섬세하게 엽니다.
8. 복부 견인기를 사용하여 절개 부위를 확장하고 멸균되고 촉촉한 면봉을 사용하여 십이지장과 소장 분절의 부드러운 견인을 용이하게 합니다. 이러한 구조를 미리 준비된 멸균 거즈로 덮고 동시에 문맥의 간 부분을 노출시킵니다.

2. 문맥 결찰술(PVL)

알림: 전체 절차에서 모든 작업이 부드럽게 수행되어야 합니다. 간 조직을 조작할 때는 물에 적신 면봉을 사용하십시오.

1. 복막과 장관을 벗겨내고 문맥이 완전히 노출되었는지 확인합니다.
2. 주 문맥을 노출시키는 과정에서, 느리고 의도적으로 앞으로 밀고 퍼지는 움직임을 사용하여 가지를 둘러싸는 것으로 진행하십시오.
3. 문맥의 다양한 가지를 (1) 우측 후방 분지, (2) 결합된 좌측 측면 및 좌측 정중 분지, (3) 미상동맥 분지의 순서로 순차적으로 식별합니다(그림 2A).

3. 문맥 가지의 우측 후방 분지 절개

1. 주문맥을 통해 간을 가로지르는 동안, 우측 후엽의 눈에 띄는 가지가 보이는 것을 관찰한다.
2. 물에 적신 면봉을 충전제로 사용하고 간의 중엽과 우측 후엽을 분리하여 잠재적인 부상을 방지합니다.
3. 글리슨낭(Glisson's cante, 간 표면을 덮고 있는 복막)을 따라 절개하고 1.5cm 길이의 실크를 당겨 문맥 가지를 묶습니다.
4. 문맥의 오른쪽 후방 가지를 8-0으로 결찰합니다. 실크 봉합사. 성공적인 문맥 결찰술의 신뢰할 수 있는 지표는 간의 눈에 보이는 창백함입니다.

4. 문맥의 좌측, 외측 및 좌측 내측 가지의 절개

1. 좌측엽(LLL)과 좌측 내측엽(Love my Life) 가지는 공통의 주문맥을 공유합니다. LLL과 미상엽 사이의 잠재적인 틈새를 절개해야 합니다.
   참고: 문맥의 LLL 및 love my life 가지의 결찰은 미세집자가 문맥 주변 공간을 가로지르고 간 손상을 피해야 하기 때문에 이 수술 모델에서 가장 어렵습니다.
2. 4.1단계에서 입구를 통해 미세집자를 삽입하고 아주 작은 저항이라도 간이나 혈관에 대한 잠재적인 근접성을 암시하므로 손을 천천히 움직입니다.
3. 저항이 느껴지면 미세집게를 약간 조정하여 우측 내측엽(RML)의 Glisson 캡슐 표면을 통해 앞으로 이동합니다(그림 3C).
4. 준비된 8-0을 활용 LLL의 문맥을 묶고 내 인생 가지를 사랑하는 실크 봉합사. 간 중앙엽 내에서 눈에 띄는 허혈성 경계를 찾는 반면, 좌엽은 문맥 가지의 결찰에 따라 창백한 것으로 가정합니다.

5. 문맥 가지의 미상적 가지의 해부

1. 미상엽을 절개하고 면봉을 사용하여 주문맥과 미상엽 사이의 잠재적인 공간을 채웁니다.
2. 미상엽의 복막을 벗겨내어 엽의 문맥 가지를 시각화합니다.
3. 미상맥 가지를 결찰하기 위해 묶는 대신 Stitch-up 봉합사를 사용하여 바늘 경로가 문맥의 미상적 가지를 적절하게 감싸도록 합니다.
   참고: 문맥의 미상맥 가지를 결찰하는 것이 어려운 이유는 미상엽 문맥이 간 조직을 캡슐화하고 주 문맥에 가깝기 때문입니다. 바늘 침투 깊이는 1mm가 권장됩니다.

6. 간 절개 및 담낭 절제술

1. 중간 간엽에서 뚜렷한 경계선을 관찰하고 이 선을 따라 횡단을 수행합니다(그림 2B).
2. 전기소작 펜을 사용하여 경계선을 따라 0.5mm의 미리 절단된 선을 만듭니다.
3. 마이크로 집게와 전기 소작 펜을 사용하여 간 조직을 자르고 면봉을 사용하여 출혈을 멈춥니다.
   참고: 횡단의 어려움은 깊이를 마스터하는 것입니다. 목표는 간을 대정맥에 최대한 가깝게 분할하는 것입니다. 수술 중 출혈은 피하기 어려우며 절개의 깊이를 마스터하기 위해 반복적인 연습이 필요합니다. 뜨거운 연소, 면봉 및 젤라틴 스폰지를 사용하여 지혈을 도울 수 있습니다.
4. 담낭을 마지막으로 제거하면 전체 작업 중에 좋은 당김 지점을 제공할 수 있습니다.
5. 면봉을 사용하여 지혈을 위해 통제된 압력을 가하고 출혈이 지속되면 하대정맥이 손상되어 봉합사 복원 효과가 좋지 않습니다. 망설임 없이 동물을 안락사시키십시오.

7. 수술의 마지막 단계

1. 봉합하기 전에 소장을 복강 내에 꼼꼼하게 배치하십시오.
2. 6-0 흡수성 봉합사를 사용하여 복막과 복벽을 단단히 닫고 4-0 흡수성 봉합사로 피부를 단단히 닫습니다.
3. 최적의 청결을 보장하기 위해 피부 표면을 다시 소독하십시오.
4. 절개 부위에 식염수 1mL와 펜타닐 0.02mg/kg, 멜록시캠 4mg/kg을 투여하여 수술 후 통증을 완화하고 추가적인 수술 중 체액 손실을 해결합니다.
5. 동물을 따뜻한 표면에 놓아 자연적으로 깨어날 수 있도록 하고 사지에 혈액 공급을 모니터링합니다. 그 후, 의식을 회복할 때까지 계속 관찰할 수 있도록 개별적으로 케이지에 수용하십시오.
6. 회복 시 4mg/kg의 용량으로 메데토미딘을 피하 주사하고 수술 후 24시간 동안 계속합니다.

8. 간 재생 및 간 기능의 수술 중 측정

1. 쥐를 안락사시키고 수술 후 1일, 2일, 3일, 7일 간격으로 간과 혈액 샘플을 채취합니다.
2. HE 염색 및 간 기능 검사를 수행하고 혈청 염증 마커를 검사하여 모델 구성의 영향에 대한 추가 검증을 제공합니다.
3. 수술 후 1주일 동안 마우스의 체중 및 FLR/BW(체중) 비율의 일일 변화를 문서화합니다.

결과

PVL(프로토콜 단계 2,3,4 및 5)과 대조적으로, ALPPS(단계 2,3,4,5 및 6) 외과적 개입을 받은 마우스는 세포 증식에 대한 높은 경향을 보여주었습니다. 그림 2 는 ALPPS와 PVL의 주요 차이점인 간 절개 중 시야와 함께 문맥 결찰 후 중간 간엽의 허혈성 경계를 나타냅니다. 특히, 간 조직 내 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터류킨, 간성장인자(HGF)를 포함한 염증 매개체의 수치가 PVL 그룹에서 관찰된 수치를 능가합니다. 이는 그림 4C 에서 볼 수 있듯이 ALPPS 그룹은 PVL 그룹보다 IL-6 수치가 높았으며, 이는 염증이 빠른 간 재생에 관여할 수 있음을 시사합니다. 이러한 연구 결과를 더욱 입증하기 위해, 간 대 체중 비율과 수술 후 2일 후 간 조직 내에서 세포 증식의 널리 알려진 지표인 ki67의 발현 수준에 대한 비교 분석이 수행되었습니다. 그림 ...

토론

이 연구는 문맥의 부분 결찰과 정중 간엽의 분열을 포함하는 마우스에서 ALPPS 수술의 초기 단계에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 ALPPS 절차를 밀접하게 모방하며, 마우스 간의 독특한 소엽 구조와 정중엽에 이중 문맥 정맥 공급을 통해 수술 후 뚜렷한 혈류를 보장합니다¹¹. ALPPS 절차는 두 가지 뚜렷한 수술 단계로 구성되어 있다는 점은 주목할 만합니다. 이 연구에서는 PVL+T로 표시된 문맥 분지 결찰 및 간 절제술과 관련된 초기 단계를 독점적으로 제시하며, 특히 부분 간엽 절제술과 관련된 두 번째 단계는 본 연구에서 실행되지 않습니다. 설명의 균일성을 유지하기 위해 ALPPS를 PVL+T와 동등한 것으로 간주합니다. 이전의 연구는 주로 쥐 모델에 초점을 맞추었지만, 취리히 대학의 연구팀은 쥐에 특화된 ALPPS 프로토콜¹²에 대해 독특하게 보고했다. 그러나 생쥐...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5% 포도당 주사(500mL)	Shapuaisi 제약(http://www.zjspas.com/)	H20003666	효율적이고 저렴하며 접근하기 쉬운
마취기	RWD(www.rwdls.com)	R500	저렴한 가격과 귀중한 품질. 초보자
작업에 적합합니다 C57 BL/6	The Jackson Lab	22349-2023	균주의 안정성
이소플루란	KCSW (kcsw.szqisoubao.com)	H19980141	내구성, 비용 효율적인
meloxicam	Boehringer-Ingelheim	H20020217	내구성 및 효율적인
마이크로펜치	60018920		내구성 및 효율성
microinstrument	CH microsurgical instrument 공장	HC-A804-1	내구성, 비용 효율적인
젖산 나트륨 ringer	Shapuaisi 제약 (http://www.zjspas.com/)	H20193277	효율적이고 저렴하며 접근하기 쉬운
봉합사 라인	CH microsurgical instrument 공장	6-0/8-0	고성능 가격 비율
국소 항체	chenxin 약리학 ( www.cisen-pharma.com)	H20020217	절개 감염을 효과적으로 방지