이 프로토콜은 전체 토끼 눈의 고품질 냉동 절개를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 토끼 눈 절제술, 고정, 포매 및 절편 절차에 대해 자세히 설명하며, 이는 큰 눈에 면역조직화학을 활용하는 모든 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 토끼와 같은 대형 동물에서 고품질 망막 동결 절개를 얻는 방법을 설명합니다. 적출 후, 눈은 잠시 고정제에 담뱉니다. 그런 다음 각막과 홍채를 제거하고 눈을 하룻밤 동안 방치하여 4 °C에서 추가로 고정합니다. 고정 후 렌즈를 제거합니다. 그런 다음 눈을 빙결 금형에 넣고 매립 매체로 채웁니다. 수정체를 제거함으로써 매립 매체가 유리체에 더 잘 접근할 수 있고 망막 안정성이 향상됩니다. 중요한 것은 유리체 전체에 완전히 침투할 수 있도록 눈을 밤새 매립 배지에서 배양해야 한다는 것입니다. 하룻밤 동안 배양한 후 눈을 드라이아이스에 얼려 절편합니다. 면역조직화학(immunohistochemistry)에 사용하기 위해 전체 망막 절편을 얻을 수 있습니다. 표준 염색 프로토콜은 망막 조직 내 항원의 국소화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 준수하면 면역조직화학을 활용하는 모든 실험에 사용할 수 있는 고품질 망막 동결 절제술을 얻을 수 있습니다.
서론
망막은 눈 안에 있는 여러 층의 특수 세포로 구성되어 있으며, 이 세포들이 함께 작용하여 빛을 신경 신호로 변환합니다. 망막은 시력에 중요한 역할을 하기 때문에 망막의 구조와 기능을 이해하면 황반변성 및 당뇨병성 망막병증과 같은 시력 상실의 가장 흔한 원인에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
토끼는 다른 모델에 비해 몇 가지 이점을 제공하기 때문에 망막 연구에서 편리한 동물 모델 역할을 합니다. 토끼 눈은 해부학적으로 인간의 눈과 비교적 유사합니다 1,2. 예를 들어, 토끼는 수평 시각 줄무늬(horizontal visual streak)로 알려진 광수용체 밀도가 증가한 영역을 가지고 있으며, 이는 인간의 중심와(fovea)와 유사합니다. 설치류와 같이 일반적으로 사용되는 다른 동물 모델에는 해부학적 등가물이 없습니다. 또한 설치류와 비교했을 때 토끼의 망막 혈관 구조는 인간의 망막 혈관 구조와 상당히 유사합니다. 토끼 눈도 비교적 큽니다. 따라서 작은 눈에서는 어렵거나 불가능할 수 있는 유리체 또는 망막 내 약물 투여 또는 외과적 개입과 관련된 연구에 특히 적합합니다3.
면역조직화학(IHC)은 조직 내 항원의 국소화를 연구하는 데 널리 사용되는 기법으로, 망막 연구에서 광범위하게 응용되고 있습니다 4,5,6. 망막은 섬세한 구조이기 때문에 IHC를 통해 유용한 결과를 얻으려면 신중한 조직 처리가 필요합니다. 망막 박리 및 망막 파단 또는 접힘과 같은 기타 조직 아티팩트는 일반적으로 처리 중에 발생하며 결과 해석을 방해할 수 있습니다. 성공적인 처리는 조직 조작, 고정 유형 및 지속 시간, 매끼 배지 유형 및 절편 기술을 포함한 다양한 요인에 따라 달라집니다 7,8,9,10. 망막 연구에서 토끼를 동물 모델로 사용하는 이점에도 불구하고 토끼 망막의 성공적인 조직 처리를 설명하는 프로토콜은 거의 없습니다. 이 논문은 IHC에 사용하기 위해 전체 토끼 눈에서 고품질 망막 절편을 얻는 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.
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프로토콜
모든 절차는 University of Southern California의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행되었으며 이를 승인받았습니다. 생후 4개월에서 6개월 사이의 네덜란드 허리띠 토끼 14마리(n = 14)가 이 프로토콜의 개발에 사용되었습니다. 수컷과 암컷 동물이 모두 사용되었습니다. 모든 동물의 무게는 2.0kg에서 2.5kg 사이였습니다. 모든 동물들은 단독으로 수용되었다. 권장되는 재료 및 장비 목록은 재료 표에서 찾을 수 있습니다.
1. 준비
- 정착제 제제.
- 인산염 완충 식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다. 눈당 최소 50mL의 정착제가 필요합니다.
- 냉동 보호제 준비.
- PBS에서 30% 중량(w/v) 자당을 준비합니다. 자당이 완전히 녹을 수 있도록 최소 15분 동안 셰이커에 올려 놓습니다. 눈당 최소 50mL의 동결 보호제가 필요합니다.
- 해부 기구 준비.
- 집게 두 쌍, 구부러진 가위 한 쌍, 메스 칼날 한 쌍, 100mm 해부 접시를 모아 해부 현미경 근처에 놓습니다. 설정 예는 그림 1A에 나와 있습니다.
2. 초기 고정
- 경결막 적출11 후, 즉시 얼음 위의 PBS에 함유된 4% PFA 50mL 이상에 눈을 놓습니다. 눈이 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 눈의 바깥쪽에 기포가 쌓이면 가볍게 흔들어 제거하십시오.
3. 각막 및 홍채 제거
- 15분 후 PBS의 4% PFA에서 눈을 제거하고 해부 현미경 아래의 100mm 해부 접시에 넣습니다. 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 접시에 PBS를 채우십시오.
- 각막을 제거합니다.
- 먼저 수술용 칼날을 홍채 평면과 평행하게 변연 1mm 전방에 배치하여 실수로 아래 구조물에 구멍을 뚫는 것을 방지합니다(그림 1B).
- 초기 절개 부위에 곡선형 가위를 삽입하고 림버스에서 1mm를 유지하면서 원주종으로 계속 절단합니다. 절단하는 동안 겸자를 사용하여 눈을 안정시킵니다(그림 1C).
- 원주 절단이 완료되면 집게로 각막을 제거하고 실험실 물티슈로 과도한 PBS를 부드럽게 닦아냅니다. 각막을 실온(RT)의 30% 자당 용액에 넣고 동결 보호를 위해 또는 폐기합니다. 각막이 가라앉을 때 동결 보호가 완료되며, 일반적으로 1시간 미만이 소요됩니다.
- 홍채를 제거합니다.
- 홍채를 통해 구부러진 가위로 초기 절단을 시작하는 것으로 시작합니다. 각막 제거와 유사하게 원주방향으로 절단하여 홍채를 조직의 나머지 부분과 완전히 분리합니다(그림 1D).
- 원주 절단이 완료되면 집게로 홍채를 제거하고 실험실 물티슈로 과도한 PBS를 부드럽게 닦아냅니다. 동결 보호를 위해 RT에서 30% 자당 용액에 홍채를 넣거나 위와 같이 폐기합니다. 홍채가 가라앉으면 냉동 보호가 완료되며, 일반적으로 30분 미만이 소요됩니다.
4. 정착 완료
- 각막과 홍채를 제거한 후 PBS에서 갓 준비한 4% PFA 최소 50mL를 눈을 넣고 셰이커에 올려 부드럽게 저어줍니다. 교반 중에는 눈이 물에 잠겨 있는지 확인하십시오.
- 하룻밤 동안 4 °C에서 PBS의 4% PFA로 눈을 유지합니다.
참고: 4% PFA를 4°C에서 16시간에서 24시간 사이에 사용하면 IHC 염색이 우수하며, 고정 기간이 길어지면 비특이적 배경 염색 및 에피토프 마스킹이 증가합니다.
5. 렌즈 제거
- 다음 날 아침, PBS에서 4% PFA에서 눈을 제거하고 해부 현미경 아래의 100mm 해부 접시에 넣습니다. 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 접시에 PBS를 채우십시오.
- 렌즈를 제거합니다.
- 먼저 집게로 수정체 전방 캡슐을 조심스럽게 잡습니다.
알림: 집게로 렌즈를 강제로 밀거나 당기면 망막 박리가 발생할 수 있으므로 각별히 주의하십시오. - 칼날이 렌즈를 따라 뒤쪽으로 구부러진 상태에서 가위를 후방 챔버에 조심스럽게 삽입합니다. 구부러진 가위로 렌즈 구역을 통해 초기 절단을 만듭니다.
알림: 망막 박리가 발생할 수 있으므로 가위로 구멍을 세게 밀거나 당기지 않도록 각별히 주의하십시오(그림 1E). - 원주 패턴으로 렌즈 구역을 통해 계속해서 작은 절단을 만듭니다. 시계 시간당 3-5 컷을하십시오.
- 수정체가 조직의 나머지 부분과 분리되어 있는지 확인하려면 겸자로 수정체 전방 캡슐을 부드럽게 잡고 부드럽게 들어 올리십시오. 수정체가 즉시 들리지 않으면 망막 박리가 발생할 수 있으므로 더 당기려고 하지 마십시오. 대신, 나머지 렌즈 구역을 더 많이 자르고 다시 시도하십시오.
- 조직의 나머지 부분과 분리되면 냉동 보호를 위해 RT에서 30% 자당 용액에 렌즈를 넣거나 위와 같이 폐기합니다. 냉동 보호는 렌즈가 가라앉을 때 완료되며, 일반적으로 몇 시간이 걸립니다.
- 먼저 집게로 수정체 전방 캡슐을 조심스럽게 잡습니다.
- 동결 보호를 위해 4°C의 PBS에서 최소 50mL의 30% 자당에 눈을 놓습니다. 동결 보호는 눈이 가라앉을 때 완료되며 일반적으로 24-48시간이 걸립니다. 동결 보호를 신속하게 처리하려면 초기 자당 용액을 8-12시간 후에 새 자당 용액으로 교체하거나 RT에서 자당 용액에 눈을 유지하십시오.
6. 임베딩
- 동결 보호가 완료되면 30% 자당 용액에서 눈을 제거하고 절개 현미경 아래의 100mm 해부 접시에 넣습니다. 눈을 조심스럽게 뒤집어 아래를 향하게 하여 눈 안쪽에서 과도한 자당 용액을 제거합니다.
알림: 물티슈가 유리체에 달라붙어 망막 박리를 초래할 수 있으므로 실험실 물티슈로 눈 안쪽에서 과도한 용액을 제거하려고 하지 마십시오. - 눈을 아래로 향하게 하여 눈 바깥쪽의 과도한 자당 용액을 물티슈를 사용하여 부드럽게 닦아냅니다.
- 일회용 임베딩 금형에 최적의 절단 온도(OCT) 화합물을 0.5-1.0cm 깊이까지 채웁니다.
알림: 이 베이스는 눈이 금형 바닥에 닿지 않도록 하여 나중에 냉동 절제를 방해하지 않도록 합니다. - 일회용 임베딩 몰드에 눈을 위로 향하게 놓습니다. 눈 안쪽에 OCT를 천천히 채우고 눈 안에 거품이 생기지 않도록 각별히 주의합니다. 기포가 생기면 조심스럽게 제거하거나 집게를 사용하여 금형 가장자리로 밀어 넣습니다.
- 일회용 임베딩 금형에 OCT를 채우는 작업을 마칩니다. 눈이 OCT에 완전히 잠기고 금형의 내부 표면에 닿거나 공기에 노출되지 않도록 합니다. OCT의 눈을 포함하는 일회용 임베딩 몰드를 파라필름으로 감쌉니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 놓습니다.
참고: 우리의 경험에 비추어 볼 때, 잠복기가 짧다고 해서 OCT가 유리체에 완전히 침투할 수 있는 것은 아닙니다. 그 결과, 자당층이 망막과 OCT 사이에 남아 있는 경우가 많습니다. 이런 일이 발생하면 냉동 절제 중에 망막이 종종 분리되거나 완전히 찢어지는데, 이는 냉동 자당이 냉동 OCT보다 구조적 지지력이 떨어질 수 있어 고품질 절편을 얻기 어렵거나 불가능하게 만들기 때문입니다. - 다음날 아침, OCT의 안구를 포함하는 매립 금형을 절제 현미경 아래의 100mm 절개 접시에 넣습니다. 후방 히알로이드 막이 내부 망막에서 위쪽으로 들어 올려진 것처럼 보이는지 확인합니다.
알림: 이러한 위쪽 리프팅은 망막의 시야를 가려 방향을 결정하기 어렵게 만들 수 있습니다. - 눈의 방향을 더 잘 결정하기 위해 OCT에서 후방 히알로이드 막을 전방으로 조심스럽게 잡고 집게로 벗겨내어 밑에 있는 망막을 노출시키십시오.
참고: 때때로 히알로이드관이 보일 수 있으며, 이는 시신경두에 부착되며 시신경두가 망막의 상부에 위치하기 때문에 방향 지시 목적으로 사용할 수 있습니다(그림 2A). OCT는 이미 유리체에 침투하여 내부 망막을 둘러싸고 있고 남아 있는 막은 동결 절제에 영향을 미치지 않으므로 후방 히알로이드 막을 완전히 제거할 필요는 없습니다(그림 2B). 후방 히알로이드 막은 필요한 경우 방향을 위해서만 제거해야 합니다. 방향을 결정하기 위한 다른 옵션에는 적출 전에 봉합사 또는 다른 유형의 표시를 배치하는 것이 포함됩니다. - 0.5-1.0cm 깊이로 채워진 새 OCT가 있는 새 임베딩 금형으로 눈을 옮긴 다음 6.3-6.5단계와 같이 새 OCT로 채워 최종 임베딩 매체에 밤새 쌓였을 수 있는 파편 및/또는 기타 결함이 없는지 확인합니다. 가능하면 눈 안쪽에서도 물티슈로 OCT를 부드럽게 제거하되 필수는 아닙니다.
- 방향을 잡기 위해 금형에 레이블을 지정합니다(그림 2C). 크라이오 몰드에서 눈이 위를 향하도록 눈의 방향을 맞추면 OCT가 내부 망막의 내벽을 이루게 됩니다. 시신경두에 부착된 히알로이드관(hyaloid canal)은 눈의 윗부분을 결정하는 중요한 이정표입니다(그림 2A).
- OCT의 눈을 포함하는 라벨이 붙은 임베딩 몰드를 드라이 아이스 위에 놓습니다. 눈이 임베딩 몰드의 내부 표면에 닿거나 공기에 노출되지 않도록 하십시오. 동결 공정의 속도를 높이기 위해 금형이 드라이아이스에 직접 닿는지 확인합니다(그림 2D).
- 내장된 눈을 -80°C 냉동고로 옮기거나 절단을 위해 저온 유지 장치로 직접 옮깁니다(그림 2E).
7. 냉동 절개
- 눈의 윗부분이 위쪽을 향하고 눈의 아래쪽 부분이 아래쪽을 향하도록 블록을 장착하고 나머지 각막과 홍채는 오른쪽( 그림 2E 참조) 또는 왼쪽(표시되지 않음)을 향하게 합니다. 또는 원하는 대로 다른 방향으로 블록을 장착합니다. 필요한 경우 금형의 각 측면을 한 번에 하나씩 조심스럽게 분리하고 블록에 직접 표시하여 눈의 방향을 잃지 않도록 금형을 부수고 블록을 동원합니다.
- 블록이 30-60분 동안 저온 유지 장치 내의 온도와 평형을 이루도록 합니다. -20 °C가 좋은 시작점입니다.
- 장착이 완료되면 일반적으로 눈의 수직 축과 평행한 원하는 각도로 새 칼날을 놓습니다.
- 원하는 대로 단면 두께를 설정합니다: 10-20μm 두께의 단면이 좋은 시작점입니다. 14μm 두께의 단면의 예가 그림 3A-C에 나와 있습니다.
- 느리고 통제된 방식으로 블록을 통해 단면을 만들기 시작합니다. 날이 눈의 수직 축과 평행하게 블록을 절단하고 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 블레이드가 블록과 접촉하는 각도를 조정하거나 스테이지 그에 따라 방향을 조정합니다.
- 블록을 절단하는 동안 브러시로 단면이 구겨지거나 말리지 않도록 하십시오. 단면을 빠르게 뒤집고 장모 브러시로 아래쪽으로 부드러운 압력을 가하여 단면을 평평하게 하고 주름이나 말리를 최소화합니다. 단면을 조작하는 데 도움이 되도록 끝이 뾰족한 별도의 브러시를 만듭니다.
- 슬라이드를 섹션 쪽으로 아래쪽으로 천천히 움직여 섹션을 충전된 유리 슬라이드에 부착합니다. 섹션 위로 유리 슬라이드를 부드럽게 굴려 부착 중에 섹션이 자체적으로 접히거나 뒤틀리는 것을 방지하십시오.
알림: 슬라이드를 섹션 바로 위로 가져가거나 섹션에 대고 누르면 섹션이 손상되거나 왜곡될 수 있으므로 슬라이드를 섹션 바로 위에 올려 놓지 마십시오. - -80 °C 냉동고로 옮기거나 표준 면역형광 프로토콜로 직접 진행하기 전에 슬라이드를 밤새 건조시키십시오.
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결과
조직 처리 후, 표준 면역 형광 프로토콜을 사용하여 망막 내의 여러 생물학적 과정을 조사할 수 있습니다. 그림 3A-C는 컨포칼 현미경으로 얻은 망막 절편의 대표적인 형광 이미지를 보여줍니다. 망막 절편은 이전에 설명된 프로토콜12에 따라 면역염색하였다.
그림 3A-C에 나타난 대표적인 망막 절편은 시신경 머리 근처에 있으며 망막 혈관의 축에 직교하여 향하고 있습니다(즉, 이 절편은 주변 망막, 망막 혈관, 수초 신경 섬유 및 수평 시야 줄무늬를 포함함). Sox2+ 핵은 신경 섬유층과 내부 핵층 내에서 볼 수 있습니다. RPE65 염색은 광수용체층에 인접한 망막 색소 상피(RPE) 세포의 연...
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토론
위의 프로토콜을 구현하기 전에 우리는 IHC를 위해 토끼 눈의 조직 처리에 지속적으로 어려움을 겪었습니다. 우리는 생쥐와 같은 작은 동물의 눈에서 몇 가지 프로토콜을 적용했지만 이러한 프로토콜이 부적절한 고정과 조직 절개의 어려움으로 이어진다는 것을 발견했습니다. 토끼 망막의 일관되고 고품질의 절편을 가능하게 하는 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다.
한 가지 고려 사항은 설치류와 같이 일반적으로 사용되는 다른 동물 모델에 비해 토끼 지구의 크기가 크다는 것입니다. 토끼 눈은 인간의 눈과 크기가 비슷하기 때문에 인간에게 일반적으로 수행되는 안구 절차를 활용하는 중개 연구를 쉽게 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 유리체내 주입, 레이저 광응고술, 유리체 절제술 및 망막 박리 수술과 같은 망막 및/또는 유리체를 포함하는 시술은 모두 토끼에서 안전하고 쉽게 수행될 수 있다 13,14,15....
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
기술 자문을 제공해 주신 Rosanna Calderon, Dominic Shayler, Rosa Sierra에게 감사드립니다. 이 연구는 USC 켁 의과대학 안과에 대한 무제한적인 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 실명 방지 연구(AN), NIH K08EY030924(AN), 안과를 위한 실험적 치료법의 Las Madrinas Endowment(AN), 실명 예방 경력 개발상(AN), Knights Templar Eye Foundation Endowment(AN), Edward N. and Della L. Thome Memorial Foundation (AN, KG)이 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100mm 배양 접시 | Corning | 353025 | 해부에 사용(1.3, 3, 5단계) |
| 50mL 튜브 | Genesee Scientific | 28-106 | 고정 및 동결 보호용(1단계) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | 동결 절제용(7단계) |
| 곡선 가위 | Fine Science Tools | 91500-09 | 해부에 사용(1.3, 3, 5단계) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | 차단 완충액에 1:1,000 희석 |
| 해부 현미경 | Zeiss | Stemi 2000-C | 박리에 사용(1.3, 3, 5단계) |
| 당나귀 안티 염소 488 | Fisher Scientific | A-11055 | 차단 버퍼에 1:1,000 희석 |
| 당나귀 안티 마우스 555 | Fisher Scientific | A-31570 | 차단 버퍼 |
| 에 1:1,000 희석집게 | Fine Science Tools | 91150-20 | 해부에 사용 (단계 1.3, 3 및 5) |
| 유리 슬라이드 커버 | VWR | 48404-453 | 냉동 절편 (단계 7) |
| 염소 anti-SOX2 | R & D Systems | AF2018 | 차단 버퍼에 1:100 희석 |
| 저온 유지 장치 블레이드 Leica | Microsystems Inc. | 14035838926 | 냉동 절제(7단계) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | 과도한 PBS 또는 OCT를 닦아내는 데 사용(3단계 및 6단계) |
| 마우스 anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | 차단 완충액에 1:100 희석 |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | 동결 방지제에 사용(1.2단계) |
| 파라포름알데히드 20% 용액 | 전자 현미경 Sciences | 15713 | 조직 고정제로 사용(1.1단계에서 4%로 희석) |
| Peel-A-Away 일회용 임베딩 몰드(22x22x20mm 깊이) | Polysciences, Inc. | 18646A | 임베딩 몰드로 사용(6단계) |
| 인산염 완충 식염수, 1x | Corning | 21-030-CV | 고정액(1.1단계) 및 동결방지제(1.2단계) 제조에 사용메 |
| 날 번호 15 | Feather | 08-916-5D | 해부에 사용(1.3, 3, 5단계) |
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | 동결절편용(7단계) |
| Tissue-Tek O.C.T. 컴파운드 | Sakura | 4583 | 임베딩 미디어로 사용(6단계) |
참고문헌
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- Sorden, S. D., et al. Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies. Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).
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