방법 논문

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells(인간 만능줄기세포와 장 신경계 계통의 분화)

DOI:

10.3791/66133

⸱

2024년 5월 17일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 2Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco, 3Program in Craniofacial Biology, University of California, San Francisco

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 장 신경계(ENS) 계통을 추출하면 ENS 발병 및 질병을 연구하고 재생 의학에 사용할 수 있는 확장 가능한 세포 소스를 얻을 수 있습니다. 여기에서는 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 hPSC에서 장 뉴런을 유도하기 위한 자세한 in vitro 프로토콜이 제시됩니다.

초록

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인간의 장 신경계(ENS)는 신경전달물질의 다양성이 현저한 신경교세포와 신경세포의 대규모 네트워크입니다. ENS는 장 운동성, 효소 분비, 영양소 흡수를 조절하고 면역 체계 및 장내 마이크로바이옴과 상호 작용합니다. 결과적으로, ENS의 발달 및 후천적 결함은 많은 인간 질병의 원인이 되며 파킨슨병의 증상에 기여할 수 있습니다. 동물 모델 시스템의 한계와 일차 조직에 대한 접근은 인간 ENS 연구에서 중요한 실험적 과제를 제기합니다. 여기에서는 정의된 배양 조건을 사용하여 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 ENS 계통을 효과적으로 체 외 에서 유도하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 당사의 프로토콜은 15일 이내에 hPSC를 장 신경능선 세포로 직접 분화하는 것으로 시작하여 30일 이내에 다양한 하위 유형의 기능성 장 신경 세포를 생성합니다. 이 플랫폼은 개발 연구, 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 애플리케이션을 위한 확장 가능한 리소스를 제공합니다.

서론

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장 신경계(ENS)는 말초 신경계에서 가장 큰 구성 요소입니다. ENS는 위장관 내에 위치한 4억 개 이상의 뉴런을 포함하고 있으며 장의 거의 모든 기능을 제어합니다1. 장 신경병증의 ENS 발달 및 기능, 결함에 대한 분자적 이해를 위해서는 신뢰할 수 있고 확실한 장 신경 세포 공급원에 접근해야 합니다. 인간의 일차 조직에 대한 접근은 제한적이며, 동물 모델은 많은 장 신경병증에서 주요 질병 표현형을 요약하지 못합니다. 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 기술은 원하는 세포 유형, 특히 1차 공급원에서 분리하기 어려운 세포 유형을 무제한으로 제공하는 데 매우 유익한 것으로 입증되었습니다 2,3,4,5,6,7. 여기에서는 hPSC에서 ENS 배양을 얻기 위한 단계적이고 강력한 in vitro 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 이러한 확장 가능한 hPSC 유래 배양은 발달 연구, 질병 모델링 및 고처리량 약물 스크리닝을 위한 길을 열어주며 재생 의학을 위한 이식 가능한 세포를 제공할 수 있습니다.

장 뉴런 계통은 배아 발생 중 ENS 발달 경로를 따르는 신경 능선(NC) 세포에서 파생됩니다. 배아에서 NC 세포는 접히는 신경판의 가장자리를 따라 나타납니다. 그들은 증식, 이동 및 감각 뉴런, 슈반 세포, 멜라닌 세포, 두개안면 골격 및 장 뉴런 및 아교 세포8,9,10을 포함한 다양한 세포 유형을 생성합니다. 세포의 운명 결정은 NC 세포가 나오는 전방-후방 축을 따라 뚜렷한 영역, 즉 두개골 NC, 미주 NC, 몸통 NC 및 천골 NC에 따라 달라집니다. ENS는 미주신경 및 천골 NC 세포에서 발생하며, 전자는 장의 길이를 따라 광범위하게 이동하고 장을 식민지화하기 때문에 장 뉴런의 집단을 지배합니다11.

PSC로부터 NC 세포를 유도하는 것은 일반적으로 이중 SMAD 억제와 WNT 경로 활성화의 조합을 포함한다12,13. 최근까지 모든 NC 유도 프로토콜에는 배양 조건에서 혈청 및 기타 동물성 제품 첨가제가 포함되었습니다. 화학적으로 정의되지 않은 매체는 NC 유도의 재현성을 낮출 뿐만 아니라 기계론적 발달 연구에 도전합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 Barber 등(14)은 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 NC 유도 프로토콜을 개발했으며, 따라서 혈청 치환 인자(예: KSR)에 의존하는 대체 방법보다 유리했습니다(예: KSR)13,14. 이는 기저 배지 치환과 Fattahi 등이 hPSC에서 장내 NC 세포를 유도하기 위해 처음 제시한 프로토콜을 최적화하여 얻은 것입니다. 이 개선된 시스템은 여기에 제시된 hPSC 차별화 프로토콜의 기초입니다. 레티노산(RA) 외에도 BMP, FGF, WNT 및 TGFβ 신호 전달을 정밀하게 조절하여 15일 동안 장 신경능선(ENC) 세포를 유도하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF)로 세포를 처리하여 ENS 계통을 도출합니다. 모든 배지 조성은 화학적으로 정의되며 30-40일 이내에 강력한 장 신경 세포 배양을 생성합니다.

본 명세서에 기술된 단층 세포 배양 시스템 외에도, 자유-부유 배아체(15,16)를 사용하는 대안적인 NC 유도 접근법이 개발되었다. 이러한 배양에서 이동 세포는 미주 NC를 나타내는 부분 집합과 함께 NC 마커를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이러한 배양에서 장내 NC 전구체를 농축하기 위해 일차 장 조직과의 동반 배양이 사용되었습니다. 이 연구의 배지 구성에는 신경 성장 인자, NT3 및 뇌 유래 신경 영양 인자와 같은 다양한 요인의 조합이 포함되어 있습니다. 이 단계에서는 이러한 요인이 장 뉴런 전구체 헌신 정체성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 완전히 명확하지 않습니다. 단층과 배아체 기반 배양에서 장내 NC 유도를 효율적으로 비교하려면 더 많은 데이터가 필요합니다. 이러한 전략의 다양한 문화권 레이아웃을 감안할 때 각 방법의 사용을 고려하고 특정 응용 프로그램에 따라 최적화해야 합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 재현 가능하며 다른 hPSC(유도 및 배아) 라인 8,14,16을 사용하여 당사와 다른 사람들에 의해 성공적으로 테스트되었습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 미디어 준비

참고: 프로토콜 전체에서 언급된 농도는 미디어 구성 요소의 최종 농도입니다. 멸균 상태에서 모든 매체를 층류 후드에서 준비하고 어두운 곳에서 4°C에서 보관합니다. 2주 이내에 사용하십시오.

  1. hPSC 유지 배지: 기본 배지와 함께 피더가 없는 hPSC 유지 배지 보충제(20μL/mL)를 혼합합니다.
  2. 배지 A: 뼈 형태 유전 단백질 4(BMP4, 1ng/mL), SB431542(10μM) 및 CHIR99021(600nM)를 분화 기본 배지에 추가합니다.
  3. 배지 B: SB431542(10 μM) 및 CHIR99021(1.5 μM)를 분화 기본 매체에 추가합니다.
  4. 배지 C: SB431542(10 μM), CHIR99021(1.5 μM) 및 RA(1 μM)를 분화 베이스 배지에 추가합니다.
  5. 신경능선 완료(NCC) 배지: 신경기저 배지에 FGF2(10ng/mL), CHIR99021(3μM), N2 보충제(10μL/mL), B27 보충제(20μL/mL), L-글루타민 보충제(10μL/mL) 및 MEM NEAAs(10μL/mL)를 추가합니다.
  6. ENC 배지: GDNF(10ng/mL), 아스코르브산(100μM), N2 보충제(10μL/mL), B27 보충제(20μL/mL), L-글루타민 보충제(10μL/mL) 및 MEM NEAA(10μL/mL)를 신경기저 배지에 추가합니다.
  7. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1x: PBS에서 500mM EDTA(1000x)를 최종 농도 500μM로 희석합니다.
    참고: 달리 명시되지 않는 한 이 프로토콜 전체에서 Ca2+ 및 Mg2+ 무료 PBS를 사용하십시오.

2. 배양 플레이트의 코팅

  1. 기저막 매트릭스 코팅 플레이트: 50mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세게 피펫팅하여 50mL의 냉각된 DMEM:F12에 500μL의 동결 부분 표본을 빠르게 해동하고 희석합니다. 희석된 기저막 매트릭스 용액(웰 표면적의cm2 당 100μL)으로 웰을 코팅하고 37°C에서 밤새 배양합니다. 사용하기 전에 코팅 매체를 흡입하십시오. 기저막 매트릭스의 젤라틴화를 방지하려면 가능한 한 빨리 이 단계를 수행하고 차가운 DMEM:F12를 사용하여 동결된 부분 표본을 용해하십시오.
    알림: 기저막 매트릭스 온도는 응고를 방지하기 위해 해동(얼음 위) 및 분취(얼음 위의 튜브) 중에 차갑게 유지해야 합니다.
  2. PO/FN/라미닌 코팅 플레이트: 1000x 스톡을 희석하여 PBS에서 15μg/mL 폴리오르니틴(PO) 용액을 준비합니다. 웰 표면적의cm2 당 100μL의 PO/PBS 용액을 웰에 코팅하고 37°C에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날, PO/PBS를 흡인하고 2μg/mL의 피브로넥틴(FN) 및 2μg/mL의 라미닌을 함유한 갓 만든 FN/라미닌/PBS 용액으로 웰 표면적의cm2 당 100μL로 웰을 코팅합니다. 플레이트는 37°C에서 최소 2시간 배양 후 사용할 수 있습니다. 사용하기 전에 FN/라미닌/PBS를 흡입하십시오.

3. hPSC 문화 유지

알림: 모든 세포 배양 단계는 가습 인큐베이터에서 5% CO2 및 37°C입니다.

  1. hPSC 배양액에서 hPSC 배지를 흡인하고 콜로니가 ~80% 합류할 때까지 격일로 새 배지(웰 표면적의cm2 당 200μL)를 추가합니다.
  2. 통과시키기 위해 hPSC 배지를 흡인하고 웰 표면적의cm2 당 100μL의 PBS로 세포를 세척합니다.
    참고: 세포를 세척하기 위해 Ca2+ 및 Mg2+ 무료 PBS를 사용하는 것이 중요합니다.
  3. 500 μM EDTA(웰 표면적의cm2 당 100 μL)를 추가합니다. 접시의 뚜껑을 교체합니다. 도립 현미경을 통해 관찰하고 세포에서 콜로니 가장자리가 분리되었는지 모니터링합니다(2-4분).
  4. 5 또는 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 동일한 부피의 hPSC 배지를 각 웰에 주입하고 몇 차례 위아래로 피펫팅하여 세포를 기계적으로 수확합니다.
    참고: 최적의 EDTA 배양 시간은 iPSC 라인에 따라 다릅니다. 콜로니를 분리하기 위한 격렬한 피펫팅은 과도한 콜로니 해리와 세포 사멸로 이어질 수 있으므로 피하십시오. 분화 플레이트를 시작하기 위해 passaging을 할 때 EDTA로 세포를 1-2분 더 배양합니다.
  5. 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브에 옮깁니다. 세포를 회전시키고(2분, 290 x g, 20-25 °C) 상층액을 조심스럽게 버립니다.
  6. 적절한 부피의 hPSC 배지에 세포를 재현탁시키고 새로운 기저막 매트릭스 코팅판의 웰로 옮깁니다.
    참고: 정기적인 hPSC 유지 관리의 경우 1:18 - 1:24 통과 비율을 사용하십시오(1:18은 6-웰 플레이트의 단일 웰에서 분리된 셀의 1/3을 완전한 새 플레이트로 이전하는 것을 의미). 차별화 플레이트를 시작하려면 5:6 통과 비율을 따르십시오.
  7. 5% CO2 및 37°C에서 배양합니다.

4. 신경능선 유도

참고: 이 단계는 그림 1A에 개략적으로 표시되어 있습니다. 세포가 약 80% 합류할 때 NC 분화를 시작합니다. 이것은 세포가 5:6 비율로 통과할 때 1-2일 이내에 달성됩니다(위 참조). 만능 및 완전 미분화 hPSC 세포로 0일에 NC 분화를 시작합니다. 높은 효율성을 위해 콜로니 경계에는 최소한의 분화 세포가 있어야 합니다. 콜로니가 크거나 도립 현미경을 사용하여 모니터링할 때 콜로니의 중심이 두꺼워지거나 어두워지기 시작할 때 구별을 위한 통로 및 플레이트 hPSC. 밀도와 형태에 주의를 기울이는 것은 세포주에 따라 다를 수 있고 cm당 50,000-200,000까지 다양할 수 있기 때문에 도금된 세포의 수보다 더 신뢰할 수 있는 경향이 있습니다2.

  1. 0일차에 hPSC 유지 배지를 1ng/mL BMP4, 10μM SB431542, 600nM CHIR99021(웰 표면적cm2 당 배지 200μL)를 포함하는 배지 A로 교체합니다.
  2. 2일째에는 셀이 100% 합류해야 합니다. 사용한 배지 A를 부드럽게 흡인하고 10μM SB431542, 1.5μM CHIR99021(웰 표면적의cm2 당 배지 200μL)를 포함하는 배지 B를 공급합니다.
    참고: NC 유도 중에 배양액이 성장함에 따라 세포가 기본 단층에서 분리될 수 있습니다. 오래된 매체를 부드럽게 제거하고 웰 측면에 새 매체를 추가하여 과도한 세포 손실을 방지하십시오.
  3. 4일째에 배지 B(웰 표면적의cm2 당 배지 200μL)로 셀을 다시 공급합니다.
  4. 6일째에 매체 B를 10μM SB431542, 1.5μM CHIR99021 및 1μM 레티노산(웰 표면적cm2 당 배지 400μL)을 포함하는 매체 C로 교체합니다.
  5. 8일째와 10일째에는 6일째로 먹이십시오.

5. ENC 스페로이드 형성

참고: 이 단계는 그림 1B에 개략적으로 표시되어 있습니다.

  1. 12일째에 배지 C를 부드럽게 흡인하고 웰 표면적의cm2 당 100μL의 PBS로 세포를 세척합니다. 동일한 부피의 세포 분리 용액을 추가하고 5%CO2 및 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 10ng/mL FGF2, 3μM CHIR99021, 10μL/mL N2 보충제, 20μL/mL B27 보충제, 10μL/mL L-글루타민 보충제 및 10μL/mL MEM NEAA를 포함하는 동일한 부피의 NCC 배지를 추가하여 세포 분리 용액을 희석합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액을 수확하고 15mL 코니컬 튜브에 추가합니다.
  3. 세포를 회전시키고(2분, 290 x g, 20-25 °C) 상층액을 조심스럽게 버립니다.
  4. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 12mL(전체 6웰 플레이트의 경우)의 NCC 배지를 추가하고 기계적으로 위아래로 1-2회 피펫팅하여 세포를 완전히 재현탁합니다. 셀 현탁액을 초저 부착 플레이트로 옮깁니다.
    참고: 약 10cm2의 ENC 단층 셀이 2mL의 NCC 배지에 재현탁되고 초저 부착 플레이트의 1웰로 옮겨집니다. 이는 전체 6웰 NC 인덕션 플레이트를 전체 6웰 초저 부착 플레이트로 옮기는 것과 같습니다.
  5. 14일째에는 작은 스페로이드가 각 웰의 중앙에 모일 때까지 플레이트를 부드럽게 소용돌이칩니다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 느린 원을 그리며 각 웰의 둘레 주위에서 사용된 NCC 배지를 흡입합니다. 자유롭게 떠다니는 스페로이드를 제거하지 마십시오.
  6. 세포에 원래 부피의 NCC 배지를 공급합니다.

6. EN 감응작용

참고: 이 단계는 그림 1B에 개략적으로 표시되어 있습니다.

  1. 15일째에 사용한 것과 동일한 기술을 적용하여 배지를 부드럽게 제거하고 PBS로 스페로이드를 세척합니다. 스페로이드를 피하면서 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다.
  2. 세포 분리 용액 (웰 표면적의 cm2 당 100 μL)을 추가하고 5 % CO2 및 37 ° C에서 30 분 동안 배양 하여 스페로이드를 단일 세포로 해리시킵니다.
  3. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 동일한 부피의 ENC 배지(10ng/mL GDNF, 100μM 아스코르브산, 10μL/mL N2 보충제, 20μL/mL B27 보충제, 10μL/mL L-글루타민 보충제 및 신경기저 배지에 10μL/mL MEM NEAA 포함)를 각 웰에 추가하고 나머지 스페로이드를 2-3차례의 기계적 피펫팅으로 분해합니다. 세포를 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
    알림: 강제 피펫팅 또는 팁 개구부가 작은 피펫 사용으로 인해 발생할 수 있는 과도한 전단 응력과 세포 사멸을 피하십시오.
  4. 세포를 회전시키고(2분, 290 x g, 20-25 °C) 상층액을 조심스럽게 버립니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 5~10mL의 ENC 배지를 추가하고 1-2회 위아래로 피펫팅하여 세포를 완전히 재현탁합니다.
  5. trypan blue와 혈구계와 같은 세포 계수 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 농도를 계수합니다.
    주의: 트리판 블루는 발암 의심 물질입니다. 주의해서 다루고 적절하게 폐기하십시오.
  6. mL당 약 ~ 1,000,000개의 세포의 밀도에서 표면적의cm2 당 약 300,000-400,000개의 생존 가능한 세포를 도금하는 것을 목표로 하는 충분한 양의 ENC 배지를 추가합니다. 플레이트의 웰에서 FN/라미닌/PBS 용액을 흡입합니다.
    참고: 이 단계는 프로토콜의 최종 재도금 단계를 표시하므로 EN 배양에 대해 계획된 분석에 따라 플레이트 형식을 선택하십시오. 장 뉴런 전구 세포는 15일에 동결될 수 있습니다. 세포 분리 용액으로 구체를 해리한 후 10% DMSO 또는 Stem-cellbanker와 같은 동결 매체에서 약 5 x 106 cells/mL에서 전구체를 재현탁시킵니다. 필요한 경우 5μM Y-27632 ROCK 억제제를 사용하여 따뜻한 ENC 매체에서 해동합니다. 원하는 플레이트 형식의 플레이트 셀. 몇 시간 후에 미디어를 새 ENC로 교체합니다.
  7. 세포를 PO/FN/라미닌 코팅된 웰에 부드럽게 추가합니다. 특히 384웰 플레이트와 같이 웰 크기가 더 작은 플레이트를 사용할 때 PO/FN/라미닌 코팅에 셀이 부착되는 것을 방지하는 셀 현탁액 아래에 기포가 갇히지 않도록 하십시오. 이것은 세포 사멸로 이어질 수 있습니다.
  8. 30-40일까지 ENC 배지 (웰 표면적 cm2 당 200 μL)로 격일로 셀을 공급 한 후 공급 빈도를 줄이지만 (일주일에 한 번 또는 두 번으로) 공급 부피를 두 배로 늘립니다 (웰 표면적의 cm2 당 400 μL의 매체까지).
    참고: 배지를 과도하게 제거하고 추가하면 웰 표면에서 신경 세포 배양이 분리되는 것을 촉진할 수 있으므로 이는 중요합니다. 특히 장기 배양에서 박리를 전향적으로 예방하려면 일주일에 한 번 ENC에 FN(2μg/mL) 및 라미닌(2μg/mL)을 보충하십시오.

결과

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이 프로토콜은 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 hPSC에서 장 신경능선 및 장 뉴런을 유도하는 방법을 제공합니다(그림 1A-B). 고품질 뉴런을 생성하는 것은 효율적인 장 신경능선 유도 단계에 달려 있습니다. 이것은 그림 1C에서 볼 수 있듯이 약 0.1 - 0.4 mm 크기의 매끄러운 표면으로 둥글게 보여야 하는 자유 부동 구의 형태를 확인하여 육안으로 평가할 수 있습니다. 이러한 스페로이드는 또한 그림 1D에서 볼 수 있듯이 신경능선 마커 SRY-Box 전사 인자 10(SOX10)17,18을 발현해야 합니다. 장 뉴런 유도 단계에서는 빠르면 25-30일째에 신경돌기가 보일 수 있습니다(그림 1E). 그러나 이는 원치 않는 중간엽 세포 오염을 포함하는 더 낮은 효율성으로 분화에서 지연될 수 있습니다. 인간의 장 신경계는 서로 다른 신경 전달 물질을 발현하는 다양한 신경 세포의 집합체입니다. 이러한 이질성은 제공된 시험관 내 프로토콜에서 재현되며, 주요 마커의 발현은 이전에 설명된 프로토콜 13,14,19,20,21에 따라 면역형광 이미징 및 유세포 분석과 같은 세포 염색 방법으로 평가할 수 있습니다(그림 1F,G).

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그림 1: hPSC에서 인간 ENC 세포 및 장 뉴런 아형 유도. (A) hPSC에서 장 신경능선(ENC) 유도. hPSC에서 ENC 세포를 유도하기 위한 매체 조성을 보여주는 프로토콜(0-12일). (B) ENC 스페로이드 형성 및 ENC의 장 뉴런 유도. ENC 스페로이드 형성을 위한 매체 조성을 보여주는 프로토콜(12-15일). 그 후, 장 뉴런을 생성하고 GDNF와 AA를 함유한 배지로 처리하여 성숙시킵니다. (C) 프로토콜의 서로 다른 시점에서 차별화된 hPSC의 대표적인 위상차 이미지. 척도 막대: 1000 μM. (D) 14일째에 H9 iPSC 유래 ENC 스페로이드를 발현하는 SOX10::GFP. 척도 막대: 1000 μm. (E) 33일째 뉴런의 위상 수축 이미지. 척도 막대: 400 μm. (F-G) 40일차 뉴런의 신경전달물질 마커의 면역형광 이미징(F) 및 유세포분석(G). 눈금자: 50 μm. 약어: BMP4 = 재조합 인간 BMP4 단백질; RA = 레티노산; FGF2 = 재조합 인간 FGF 기본; GDNF = 재조합 인간 신경교세포주 유래 신경영양인자; AA = 아스코르브산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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여기에 설명된 분화 프로토콜은 30-40일 이내에 hPSC에서 장 뉴런을 얻고(그림 1E) 더 오래된 배양에서 신경교세포, GFAP 및 SOX10을 발현하는 장내 신경교세포를 얻기 위한 강력한 시험관 내 방법을 제공합니다(> 55일)13,14,19,22. 이러한 뉴런과 신경교세포는 hPSC를 미주신경 및 장 신경능선 세포로 단계적으로 분화한 후 장 뉴런 및 신경교세포 전구세포로 유도됩니다13,14. 신경능선 세포는 신경능선 마커, 전사 인자 AP-2 알파 및 베타, TFAP2A 및 TFAP2B를 각각발현합니다 21. 우리는 이전에 CD49가 hPSC-유래 신경능선 세포(neural crest cell)14의 효율성을 나타내는 마커로 사용될 수 있음을 보여주었다. 이 방법의 효율성과 성공 여부는 여러 요인의 조합에 달려 있습니다. 첫째, 멸균 상태에서 모든 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 마이코플라스마 오염에 대한 hPSC 배양액 검사는 줄기세포 성장에 악영향을 미칠 수 있고 육안으로 검출할 수 없기 때문에 중요합니다. 둘째, 균일하고 적절하게 코팅된 플레이트를 사용하면 웰 표면에서 NC 배양물 및 오래된 뉴런이 고르지 않게 성장하고 분리될 가능성이 줄어듭니다. 셋째, 분화의 효율성을 높이려면 만능 및 완전 미분화 hPSC 세포로 시작하는 것이 필수적입니다. hPSC 콜로니는 콜로니 경계에서 최소한의 분화 세포를 가져야 합니다. hPSC는 콜로니가 크거나 위상차 현미경을 통해 관찰된 것처럼 콜로니의 중심이 두꺼워지거나 어두워지기 시작할 때 분화를 위해 통과시키거나 도금해야 합니다. 원치 않는 분화 세포(일반적으로 중간엽 세포)는 전반적인 분화 효율을 떨어뜨릴 뿐만 아니라 배양액이 오래됨에 따라 웰 표면에서 뉴런이 분리되는 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 처음 15일 동안 ENC 배양을 주의 깊게 모니터링하는 것이 좋습니다. 효율적인 분화 조건에서 어두운 디스크가 배양 표면에 나타납니다 ~ 6 일째, 이는 12-15 일에 효율적인 스페로이드 형성을 나타냅니다. 또한 회전 타원체 단계(12-15일)에서 자유롭게 떠다니는 구는 매끄러운 표면을 가져야 합니다(그림 1D). 12-15일째에 3D 스페로이드 단계를 유지하는 것은 일반적으로 ENS 계통으로의 배양물 다운스트림 분화를 위해 ENC의 순도를 개선하기에 충분합니다. 그러나 초기에 순수한 ENC 전구 세포 집단이 필요한 연구의 경우 CD49D를 사용하는 FACS가 권장됩니다. CD49D는 SOX10:hPSC 유래 NC 계통에 대한 특정 표면 마커이며 세포주13,14에서 성공적으로 사용되었습니다. FACS를 사용한 CD49D+ 세포 분리에 대한 자세한 내용과 게이팅 전략에 대한 권장 사항은 Barber et al, Figure 2D, Box1 및 Supplementary Figure 6,14의 논문을 참조하십시오. 넷째, 효율성을 극대화하기 위해 hPSC 배양이 단층이고 ~80% 합류할 때 차별화를 시작해야 합니다. 이는 2일차에 완전히 융합된 문화를 갖는 것을 의미합니다. 밀도가 낮으면 효율성에 부정적인 영향을 미치며 매우 조밀한 배양은 세포 사멸률이 더 높은 경향이 있으며 잠재적으로 원치 않는 분화된 세포의 출현으로 이어질 수 있습니다.

15일째에 세포를 다시 도금하는 것은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 이것은 단층 신경 세포 배양을 위한 마지막 세포 전달 단계이므로 계획된 분석에 따라 플레이트 레이아웃을 선택해야 합니다. 각 웰로 전달된 세포의 수는 뉴런 다양성과 웰 표면에 붙어 있는 오래된 뉴런에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 일반적으로,cm2 당 250,000-350,000 셀의 범위의 셀 밀도(96-웰 플레이트의 웰당 약 75,000-100,000 셀 또는 24-웰 플레이트의 웰당 500,000-700,000)가 바람직하다. 30-40일째부터 시작하여 특히 더 긴 뉴런 배양을 위해 계획된 세포의 경우 뉴런의 분리를 전향적으로 방지하기 위해 피브로넥틴과 라미닌을 영양 배지에 추가하는 것을 고려할 수 있습니다(일주일에 한 번 이하). 이 시점에서 수유 빈도를 5-7일에 한 번으로 줄이고 신선한 배지를 추가하기 전에 각 우물에 약간의 매체를 남겨 두는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 신경 돌기에 불필요한 물리적 스트레스가 가해질 가능성이 줄어듭니다. 매체의 증발을 고려할 때(특히 플레이트 경계에 있는 웰의 경우) 75μL를 제거하고 각 웰에 100μL의 새 배지를 추가할 수 있습니다. 경험에 비추어 볼 때, 폴리머 커버슬립 바닥 이미징 플레이트에서 자란 배양물은 더 오래 살면서 웰 표면에 부착된 상태로 유지되는 경향이 있습니다. 따라서 다른 세포 유형과의 공동 배양과 같이 매우 오래된 신경 세포 배양이 필요한 실험의 경우 폴리머 커버슬립 바닥 이미징 플레이트를 고려하는 것이 권장됩니다. 공기 건조된 PO/FN/라미닌 코팅 플레이트는 여전히 효율적인 차별화를 제공할 수 있지만 이 프로토콜의 목적을 위해 체계적으로 테스트되지 않았습니다. 따라서 갓 코팅된 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 Barber et al14에 의해 이전에 발표된 프로토콜을 기반으로 합니다. 혈청 치환 인자(예: KSR)13,14를 포함하는 배지를 사용하는 이전 ENC 유도 방법과 비교하여 현재 프로토콜 배지 조건은 화학적으로 정의되어 있습니다. 이는 보다 일관된 분화에 유리하며 배양 조건을 조작하여 보다 정확한 개발 연구를 가능하게 합니다. 이 강력한 프로토콜은 H9, UCSF4 및 WTC11과 같이 테스트된 독립적인 유도 및 배아 줄기 세포주에서 장 신경 세포의 배양을 재현성 있게 생성합니다. 제시된 프로토콜의 강력한 측면은 인간 ENS에서 발견되는 것과 유사한 다양한 ENS 신경 아형을 생성할 수 있는 능력입니다. 예를 들어, 다양한 ENS 신경화학적 정체성에 대한 특정 마커의 발현은 유세포 분석 및 형광 이미징을 통해 확인할 수 있습니다(그림 1F,G). 산화질소 합성효소 1(NOS1)에 양성인 hPSC 유래 장 신경 집단의 일반적인 범위는 5%-20%입니다. 콜린 O- 아세틸 전이 효소 (CHAT)는 40 % -60 %입니다; 감마 아미노뷰티르산(GABA)은 15%-30%이고 세로토닌(5-HT)은 15%-30%입니다. 그러나 이러한 아형 간의 체외 구조적 및 기능적 연결성이 생체 내 세포 네트워크를 정확하게 모델링하는 정도에 대해서는 추가 연구가 필요합니다. 또한 개별 아형의 전사 프로파일링을 확장하기 위한 단일 세포 분석은 in vivo 및 in vitro 세포 정체성을 더 잘 비교하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 개발 및 분자 연구뿐만 아니라 약물 발견 및 재생 의학을 위한 특정 아형을 풍부하게 하기 위한 향후 프로토콜 최적화에도 도움이 될 것입니다.

다른 신경 세포를 포함하는 배양과 더 오래된 배양에서 신경 교세포를 포함함에도 불구하고 이 프로토콜은 근육 세포, 상피 세포 및 면역 세포와 같은 ENS의 생체 내 틈새에서 자연적으로 발견되는 다른 세포 유형을 생성하지 않습니다. 건강 및 질병의 맥락에서 이러한 세포 유형과의 ENS 상호 작용을 연구하려면 공동 배양 및 장 오가노이드 시스템을 최적화하기 위한 투자가 필요합니다. 전반적으로, in vitro 에서 hPSC에서 ENS의 다양한 하위 유형을 생성하는 강력한 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 확장 가능한 배양은 약물 요법을 개발하고 장 신경병증 치료를 위한 이식 가능한 세포를 제공하는 것을 목표로 하는 인간 ENS의 발달 연구, 독성학 테스트 및 질병 모델링 실험에 적합합니다.

공개 사항

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저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research 및 Sandler Foundation의 보조금, March of Dimes 보조금 번호 1-FY18-394 및 1DP2NS116769-01, F.F.에 NIH Director's New Innovator Award(DP2NS116769), F.F.에 대한 National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases(R01DK121169)의 보조금으로 지원되었으며, H.M.은 Larry L. Hillblom Foundation 박사후 연구원의 지원을 받습니다. NIH T32-DK007418 펠로우십 및 UCSF 획기적인 생물 의학 연구를 위한 프로그램, 독립적인 박사후 연구원.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아스코르브산Sigma-AldrichA5960
B27 보충제(무혈청, 비타민 A 제외)Gibco12587-010
기저막 매트릭스, GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R& D systems314-BP
세포 배양 원심분리기Eppendorf, 모델 번호 5810R02262501
세포 분리 솔루션, AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
Conical tubesUSA scientific1475-0511, 1500-1211
분화 기본 배지, Essential 6Life 기술A1516401
DMEM/F-12 글루타민 없음Life Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
피더가 없는 hPSC 유지 관리 매체, 필수 8 플렉스 매체 키트Life TechnologiesA2858501
FGF2R& D systems233-FB/CF
피브로넥틴코닝356008
GDNFPeprotech450-10
혈구계Hausser Scientific1475
인간 만능 줄기세포, H9 ESCWiCellRRID: 습도
인큐베이터Thermo Fisher ScientificHerralcell 150i
도립 현미경Thermo Fisher ScientificEVOS FL
층류 후드Thermo Fisher Scientific1300 시리즈 클래스 II, 유형 A2
LamininCultrex3400-010
L-글루타민 보충제, GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
멀티웰 플레이트, FalconBD353934, 353075
N-2 SupplementCTSA1370701
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
PBS(Ca 및 Mg free)Life Technologies10010023
피펫 필러EppendorfZ768715-1EA
피펫 팁USA scientific1111-2830
피펫Fisherbrand13-678-11E, 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
폴리머 커버슬립 바닥 이미징 플레이트, ibidiibidi81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542R& D 시스템1614
Trypan 블루 스테인, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250-061
초저 부착 플레이트Fisher Scientific07-200-601
Y-27632 디하이드로클로라이드R& D 시스템1254
, 온도 및 CO2를 조절하는 CVCL_1240

참고문헌

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