Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

요약

우리는 mScarlet이라는 형광 단백질을 사용하여 Epon post-embedding correlative light and electron microscopy에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 형광과 미세구조를 동시에 유지할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 생물학적 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

초록

상관 광 및 전자 현미경(CLEM)은 형광 현미경(FM)이 제공하는 국소화 정보와 전자 현미경(EM)으로 획득한 세포 초미세 구조의 맥락을 결합한 포괄적인 현미경입니다. CLEM은 형광과 미세구조 사이의 절충안이며, 일반적으로 초미세구조는 형광을 손상시킵니다. 글리시딜 메타크릴레이트, HM20 또는 K4M과 같은 다른 친수성 임베딩 수지와 비교할 때 Epon은 미세구조 보존 및 절편 특성이 우수합니다. 이전에 우리는 mEosEM이 오스뮴 사산화물 고정 및 에폰 임베딩에서 살아남을 수 있음을 입증했습니다. mEosEM을 사용하여 형광과 초미세 구조를 동시에 유지하는 Epon 포스트 임베딩 CLEM을 처음으로 달성했습니다. 여기에서는 EM 샘플 준비, FM 이미징, EM 이미징 및 이미지 정렬에 대한 단계별 세부 정보를 제공합니다. 또한 EM 이미징 중에 FM 이미징으로 이미징된 동일한 세포를 식별하는 절차를 개선하고 FM과 EM 이미지 간의 정합을 자세히 설명합니다. 우리는 전통적인 EM 시설에서 이 새로운 프로토콜에 따라 상관 광 및 전자 현미경을 포함하는 Epon 포스트 임베딩을 쉽게 달성할 수 있다고 믿습니다.

서론

형광 현미경(FM)을 사용하여 표적 단백질의 국소화 및 분포를 얻을 수 있습니다. 그러나 표적 단백질을 둘러싼 컨텍스트가 손실되며, 이는 표적 단백질을 철저히 조사하는 데 매우 중요합니다. 전자 현미경(EM)은 이미징 해상도가 가장 높아 여러 세포 내 세부 정보를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 EM에는 표적 라벨링이 없습니다. FM으로 촬영한 형광 이미지를 EM으로 획득한 회색 이미지와 정확하게 병합함으로써 상관광 및 전자 현미경(CLEM)은 이 두 가지 이미징 모드 1,2,3,4에서 얻은 정보를 결합할 수 있습니다.

CLEM은 형광과 초미세구조¹ 사이의 절충안이다. 현재 형광 단백질과 기존 EM 시료 전처리 절차의 한계, 특히 오스믹산(OsO₄) 및 Epon과 같은 소수성 수지의 사용으로 인해 미세구조는 항상 형광⁵를 손상시킵니다. OsO₄ 는 EM 시료 전처리에 없어서는 안 될 시약으로, EM 이미지의 대비를 개선하는 데 사용됩니다. 다른 끼워넣는 수지와 비교해, EPON는 ultrastructure 보전과 단면도 재산에서 우량합니다⁵. 그러나 형광 단백질은 OsO₄ 및 Epon embedding⁶ 처리 후 형광 신호를 유지할 수 없습니다. 형광 단백질의 한계를 극복하기 위해 EM 시료 전처리 전에 FM 이미징을 수행하는 사전 임베딩 CLEM이 개발되었습니다⁶. 그러나 CLEM을 사전 임베딩하는 것의 단점은 FM과 EM 이미지 간의 부정확한 등록이다⁵.

반대로, 포스트 임베딩 CLEM 방법은 EM 샘플 준비 후 FM 이미징을 수행하며, 그 등록 정확도는 6-7nm ^5,6에 도달 할 수 있습니다. 형광 단백질의 형광을 유지하기 위해 매우 낮은 농도의 OsO₄ (0.001 %)³ 또는 고압 동결 (HPF) 및 동결 치환 (FS) EM 제조 방법 ^4,7이 사용되어 미세 구조 손상 또는 EM 이미지의 대비를 희생했습니다. mEos4b의 개발은 임베딩 수지⁵로 글리시딜 메타크릴레이트가 사용되지만, 포스트 임베딩 CLEM의 진행을 크게 촉진한다. OsO₄ 염색 및 Epon 임베딩에서 살아남을 수 있는 mEosEM의 개발로 Epon 포스트 임베딩 초고해상도 CLEM이 처음으로 달성되어 형광과 미세구조를 동시에 유지했습니다⁶. mEosEM 후, OsO₄ 염색 및 Epon 임베딩에서 살아남을 수 있는 여러 형광 단백질이 개발되었습니다 ^8,9,10,11. 이것은 CLEM의 개발을 크게 촉진합니다.

Epon 포스트 임베딩 CLEM에는 세 가지 주요 측면이 있습니다. 첫 번째는 형광 단백질로, EM 시료 전처리 후 형광 신호를 유지해야 합니다. 우리의 경험에 따르면, mScarlet은 보고된 다른 형광 단백질보다 우수합니다. 두 번째는 EM 이미징에서 FM 이미징으로 이미징된 동일한 세포를 찾는 방법입니다. 이 문제를 해결하기 위해 표적 세포를 쉽게 찾을 수 있도록 이 단계의 절차를 개선합니다. 마지막은 FM 이미지를 EM 이미지와 정렬하는 방법입니다. 여기에서는 FM과 EM 이미지 간의 정합에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에서는 VGLUT2 뉴런에서 mScarlet을 발현하고 mScarlet이 Epon post-embedding CLEM을 사용하여 2차 리소좀을 표적으로 삼을 수 있음을 보여줍니다. 형광 및 미세 구조를 손상시키지 않고 Epon 포스트 임베딩 CLEM에 대한 단계별 세부 정보를 제공합니다.

프로토콜

축산 및 실험은 Fujian Medical University Medical Center의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 현재 프로토콜의 단계별 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 샘플 준비

1. 쥐의 뇌
   1. 형질전환 마우스( 재료 표 참조) 및 올리고뉴클레오티드 프라이머( 재료 표 참조)를 구입하여 이러한 마우스의 유전자형을 분석합니다.
   2. 이전에 발표된 프로토콜^12,13에 따라 두개골 금고에서 온전한 뇌를 관류하고 제거합니다.
   3. 4°C에서 밤새 10mL의 고정 용액( 재료 표 참조)을 사용하여 마우스 뇌를 고정합니다.
   4. 0.1M 인산염 완충액(PB)으로 3 x 10분 동안 고정 용액을 헹굽니다.
   5. 진동 마이크로톰을 사용하여 마우스 뇌를 500μm 두께의 섹션으로 자릅니다( 재료 표 참조).
   6. 형광 영역을 실체현미경을 사용하여 메스로 작은 블록으로 자릅니다( 재료 표 참조).
      알림: 작은 블록의 부피는 1mm³보다 크지 않아야 합니다.
2. 배양된 세포
   1. HeLa 세포를 6cm 세포 배양 접시에 파종하고 성장 배지(Dulbecco's modified Eagle medium [DMEM] 저포도당, 10% 소 태아 혈청 [FBS] 보충)에서 유지합니다.
   2. 다음 날, transfection kit의 지침서에 따라 DNA transfection 시약( 재료 표 참조)을 사용하여 mScarlet을 포함하는 plasmid를 세포에 transfection합니다.
   3. 형질주입 후 48시간 후에 형질주입된 세포를 트립시스화하고 원심분리하여 1,000× g의 세포 펠릿을 얻습니다. 세포 펠릿을 샘플 블록이라고 합니다.

2. EM 시료 전처리

1. 고정
   1. 밤새 4°C에서 정착 용액( 재료 표 참조)을 사용하여 샘플 블록을 고정합니다.
   2. 정착액을 제거하고 샘플 블록에서 0.1M PB로 3 x 10분 동안 정착액을 헹굽니다.
2. 오스뮴 테트라옥사이드(_OsO4) 염색
   1. OsO₄ 용액( 재료 표 참조)으로 샘플 블록을 4°C에서 1시간 동안 고정합니다.
   2. OsO₄ 용액을 제거하고 샘플 블록에서 ddH₄O로 OsO₄ 용액을 3 x 10분 동안 헹굽니다.
3. 우라닐 아세테이트(UA) 염색
   1. 4°C에서 1시간 동안 2% UA 용액( 재료 표 참조)을 사용하여 샘플 블록을 염색합니다.
   2. UA 용액을 제거하고 샘플 블록을 ddH₂O로 3 x 10분 동안 헹굽니다.
4. 그라디언트 탈수
   1. 10 분 동안 50 %, 10 분 동안 70 %, 10 분 동안 80 %, 10 분 동안 90 %, 10 % 에탄올에서 2 x 10 분과 같이 그래디언트 에탄올로 샘플 블록을 탈수합니다.
   2. 샘플 블록을 무수 아세톤으로 3 x 10분 동안 탈수합니다.
5. 수지 침투
   1. 그래디언트 수지로 샘플 블록에 침투( 재료 표 참조): 아세톤-수지 3:1 1시간 동안 1시간, 아세톤 대 수지 1:1 2시간, 아세톤 대 수지 1:3 3시간 동안 3.
   2. 3 x 12시간 동안 순수한 수지로 교체합니다.
6. 수지 임베딩
   1. 이쑤시개를 사용하여 샘플 블록을 캡슐에 옮깁니다( 재료 표 참조).
   2. 샘플 블록이 들어있는 캡슐에 순수 수지를 넣고 60 ° C의 오븐에서 14-16 시간 동안 수지를 중합시킵니다.

3. 금 나노 입자로 커버 글라스 코팅

1. 커버글라스 청소
   1. 커버글라스를 세척용 버퍼( 재료 표 참조)로 142°C에서 2시간 동안 세척합니다.
   2. 세척 버퍼를 ddH 3 O로 10 x₂분 동안 헹굽니다.
   3. 커버글라스를 무수 에틸 알코올이 들어 있는 비커에 조심스럽게 옮기고 밤새 배양합니다.
   4. 커버글라스를 깨끗한 벤치에서 몇 분 동안 자연 건조시킵니다.
2. 커버글라스를 금 나노입자로 코팅합니다.
   1. 유리 시멘트를 사용하여 데스크탑 원심분리기( 재료 표 참조)의 회전 중앙에 유리 슬라이드를 고정합니다.
   2. 스티커 메모를 사용하여 유리 슬라이드 중앙에 커버글라스를 장착합니다.
   3. 커버글라스에 75μL의 1% 피올로포름( 재료 표 참조)을 추가합니다.
      참고 : Formvar ( 재료 표 참조)도 테스트했으며 잘 작동합니다.
   4. 1,360× g (그림 2A)에서 3분 동안 회전하여 커버글라스 표면에 얇은 피올로포름 층을 생성합니다.
   5. 커버글라스 표면을 250μL의 0.1% 폴리-L-라이신( 재료 표 참조)으로 실온에서 1시간 동안 배양합니다(그림 2B).
   6. ddH₂O로 헹구고 커버글라스를 몇 분 동안 자연 건조시킵니다.
   7. 80nm 금 나노 입자 ( 재료 표 참조)를 ddH₂O로 25 % (v / v, OD₆₀₀ = 0.07) ( 재료 표 참조)로 희석하고 15 분 동안 초음파 처리합니다.
   8. 뚜껑유리 표면을 희석된 금 나노입자로 실온에서 1시간 동안 배양합니다(그림 2C).
   9. ddH₂O로 헹구고 커버글라스를 몇 분 동안 자연 건조시킵니다.
      참고 : pioloform과 금 나노 입자로 코팅 된 후 2 주 후에 잘 작동합니다. 그러나 코팅 후 즉시 사용하는 것이 좋습니다.

4. 초박형 절편

1. 샘플 블록의 표면을 직각 사다리꼴로 자릅니다. 초박편절기(재료 표 참조)가 있는 다이아몬드 나이프(재료 표 참조)를 사용하여 100nm 두께로 단면을 절단합니다. 섹션 밴드에서 단일 섹션을 분리하고 단일 섹션을 수조에 띄웁니다.
2. ddH₂O 한 방울을 금 나노 입자로 코팅된 커버글라스의 중앙에 떨어뜨립니다. 샘플 루프를 사용하여 섹션을 선택하고 샘플 루프를 물방울 표면에 뒤집습니다. 샘플 루프를 제거하고 물방울 표면의 섹션을 남겨 둡니다.
3. 커버글라스를 몇 분 동안 자연 건조시킵니다. 마커 펜을 사용하여 커버글라스의 반대쪽 섹션 주위에 고리를 그립니다.

5. 광학 현미경 이미징

1. 형광 회복
   참고: 워크플로는 그림 3A에 나와 있습니다.
   1. 10μL의 장착 버퍼( 재료 표 참조)를 커버 유리의 초박형 섹션에 추가합니다. 깨끗한 새 커버글라스를 장착 버퍼에 놓습니다.
      알림: 장착 버퍼의 핵심 구성 요소는 형광 단백질의 형광을 복구하는 데 사용되는 DABCO입니다. 이것은 형광 회수에 매우 중요합니다.
   2. 이 두 개의 커버글라스를 초박형 섹션과 함께 이미징 챔버에 넣습니다( 재료 표 참조). 그려진 고리가 있는 덮개 유리가 상단에 있는지 확인하십시오.
2. 내비게이션 맵을 수집합니다.
   1. 도립 형광 현미경의 명시야 이미징 모드에서 그려진 고리를 마커로 사용하여 단면을 찾습니다( 재료 표 참조). 섹션의 한쪽 모서리로 이동합니다. 백색광을 켜고 명시야 이미지를 촬영합니다.
   2. 백색광을 끕니다. 레이저(561nm)를 켜고 동일한 시야(FOV)의 형광 이미지를 촬영합니다.
   3. 레이저를 끕니다. 인접한 FOV로 이동하여 이 두 FOV가 10% 겹치도록 합니다. 두 번째 FOV의 명시야 이미지와 형광 이미지를 촬영합니다.
   4. 전체 섹션이 덮일 때까지 이 작업을 반복합니다. FOV를 스티칭하는 데 사용할 수 있는 이미징 경로를 기록합니다.
      알림: 이미지 품질을 높이려면 컨포칼 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.
3. 관심 있는 이미지 셀.
   1. 탐색 맵을 사용하여 관심 있는 셀을 쉽게 타겟팅할 수 있습니다. 레이저(561nm)를 켜고 관심 세포의 형광 이미지를 300프레임으로 촬영합니다. 레이저를 끕니다.
   2. 백색광을 켜고 순차적인 명시야 이미지(~100프레임)를 촬영합니다.
   3. 관심 있는 다른 셀로 이동합니다.

6. EM 이미징 준비

참고: 워크플로는 그림 3B에 나와 있습니다.

1. 초박형 섹션을 슬롯 그리드로 옮깁니다.
   1. 유리병에 ddH₂O를 채웁니다.
   2. 챔버에서 커버글라스를 제거하고 핀셋으로 두 개의 커버글라스를 분리합니다. Clamp 섹션이 있는 커버글라스를 세척하고 장착 버퍼를 씻어내고 자연 건조합니다.
   3. 단면 블레이드를 사용하여 초박형 섹션 주위에 #을 기록하고 #의 각 모서리에 10μL의 12% 불산(재료 표 참조)을 떨어뜨립니다. 커버글라스를 물에 천천히 넣으십시오.
      알림: 불산은 유리와 반응하여 커버 유리에서 피올로포름 필름을 더 쉽게 제거할 수 있습니다. 불화수소산은 독성이 있습니다. 장갑과 함께 화학 후드에 사용하십시오. 피부와의 접촉은 즉각적인 치료가 필요합니다.
   4. 피올로폼 필름과 초박형 부분을 함께 수면에 띄웁니다. 단면에 코팅되지 않은 슬롯 격자를 배치하여 격자 중앙의 단면을 캡처합니다.
   5. 유리 슬라이드를 파라필름으로 덮고( 재료 표 참조) 피올로폼 필름으로 그리드를 집습니다. 그리드를 실온에서 자연 건조합니다.
2. 단면 염색
   1. 2% UA와 Sato의 트리플 리드로 섹션을 더럽힙니다. 자세한 내용은 이전에 게시된 프로토콜²를 참조하십시오.

7. 이미지 분석

1. 내비게이션 맵을 연결합니다.
   1. 원시 데이터의 위치를 찾습니다. ImageJ 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열어 내비게이션 맵을 연결합니다.
   2. Plugins(플러그인) | 스티칭 | 그리드/컬렉션 스티칭 | (유형) 그리드: 열별 뱀 | (주문) Up & Left (촬영 순서에 따라) | 슬라이스 크기 설정 | 데이터 경로 선택 | 파일 이름 설정 | 퓨전 표시를 선택합니다. 서로 다른 FOV의 여러 명시야 이미지로 구성된 내비게이션 맵인 결과를 관찰합니다.
   3. 동일한 방법을 사용하여 형광 내비게이션 맵을 연결합니다.
2. 명시야 이미지를 형광 이미지와 병합합니다.
   1. ImageJ 소프트웨어에서 File(파일) | 가져오기 | Image Sequence : 관심 세포의 순차적 명시야 이미지를 가져옵니다.
   2. 이미지 | 스택 | Z 투영 | Sum Slices(슬라이스 합계)는 순차적 명시야 이미지의 SIP(Sum Intensity Projection) 이미지를 가져옵니다.
   3. Edit( 편집) | 금 나노 입자의 신호가 밝은 흰색 점이 되도록 명시야의 SIP 이미지를 반전시키려면 반전합니다.
   4. ImageJ에서 File(파일) | 가져오기 | 이미지 시퀀스 - 순차적인 FM 이미지를 가져옵니다.
   5. 이미지 | 스택 | Z 투영 | Sum Slices를 사용하여 순차 FM 이미지의 SIP 이미지를 가져옵니다.
   6. 이미지 | 색상 | 채널 병합 - SIP 명시야 이미지를 SIP FM 이미지와 합성 이미지로 병합합니다.
   7. 금 나노 입자는 녹색이고 형광 단백질은 빨간색입니다. 이미지 | 유형 | RGB 색상 합성 이미지의 형식을 RGB로 변환합니다.

8. EM 이미징

1. 그리드를 s에 놓습니다.amp그리드의 단면을 위로 유지하면서 홀드.
2. 내비게이션 맵을 사용하여 초박형 섹션의 오른쪽 사다리꼴의 서로 다른 4개 모서리까지 4개의 상대 거리를 통해 전자 현미경 아래에서 해당 셀의 위치를 대략적으로 식별합니다.
3. 금 나노 입자를 사용하여 세포를 확인합니다.
4. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 다양한 배율(4,200x, 6,000x 또는 8,200x)로 EM 이미지를 촬영합니다( 재료 표 참조).

9. EM 이미지에 FM 이미지 등록

1. 정합 소프트웨어를 엽니다( 자료 표 참조). 검색 창에 easyCLEMv0¹⁴를 입력합니다. easyCLEMv0을 클릭하여 easyCLEMv0을 엽니다. Image/Sequence(이미지/시퀀스) | EM 이미지와 합성 이미지를 소프트웨어 패널로 가져오려면 엽니다.
2. EasyCLEMv0 창에서 2D(x,y,[T])를 클릭하여 정렬 모드로 비강성(2D 또는 3D)을 선택합니다.
3. EasyCLEMv0 창에서 변환 및 크기 조정(FM 가능)할 이미지 선택 오른쪽에 있는 드롭다운 상자를 클릭하여 합성(RGB)color.tif을 선택합니다. 그런 다음 수정되지 않을 이미지 선택(EM일 수 있음) 오른쪽에 있는 드롭다운 상자를 클릭하여 EMimage. tif 선택합니다.
4. 시작을 클릭하여 등록을 시작합니다.
5. EMimage. tif라는 EM 이미지 창에서 하나의 금 나노 입자를 클릭하여 금 나노 입자에 포인트 1을 놓습니다. Composite (RGB)color.tif라는 FM 이미지 창에서 해당 금 나노 입자를 클릭하여 금 나노 입자에 포인트 1을 놓습니다.
6. Update Transformation을 클릭하여 금 나노 입자의 EM 신호로 LM 신호를 확인합니다.
7. EMimage. tif라는 EM 이미지 창에서 위의 작업을 반복하고 LM 신호를 동일한 금 나노 입자의 EM 신호와 하나씩 일치시킵니다.
8. 중지를 클릭하여 등록을 마칩니다.
9. 이미지 정렬 후 오버레이된 이미지(Overlayed image)를 클릭하고 이미지/시퀀스(Image/Sequence) | 다른 이름으로 저장 을 클릭하여 4개의 채널 이미지(빨강, 녹색, 파랑, 회색)가 포함된 이미지 스택을 내보냅니다.
10. ImageJ를 열고 File(파일) | 오버레이된 이미지를 가져오려면 엽니다. 이미지 | 스택 | 이미지에 스택을 쌓아 오버레이된 이미지를 4개의 채널 이미지로 분리합니다.
11. 이미지 | 색상 | 채널 병합 - 세 채널(빨강, 녹색 및 회색)의 이미지를 합성 이미지로 병합합니다.
12. 이미지 | 유형 | RGB 색상 합성 이미지를 CLEM 이미지로 변환합니다.

결과

이전 보고서에서는 mScarlet이 리소좀¹⁵를 표적으로 삼을 수 있음을 보여주었습니다. 이 프로토콜에서 mScarlet(rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA)을 발현하는 AAV를 입체적 계기를 사용하여 Vglut2-ires-cre 마우스 뇌의 M1(ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5)에 주입했습니다. 위에서 설명한 프로토콜에 따라 최종 상관 이미지가 그림 4A에 나와 있습니다. FM 이미지는 금 나노 입자(녹색 점)를 기준 마커로 사용하여 EM 이미지와 정확하게 정렬할 수 있습니다. EM 이미지(그림 4C,F)에서 볼 수 있듯이 mScarlet은 리소좀을 표적으로 하며 리소좀 내부의 내용물은 이질적이며, 이는 2차 리소좀의 전형적인 특성입니다.

그림 1: 상관 빛과 전자 현미경의 개략도. (A) 쥐의 뇌 준비. 아데노(Adeno) 관련 바이러스를 쥐의 뇌에 주입하였다. 30일 후, EM 샘플 준비를 위해 쥐 뇌 절편의 형광 영역을 작은 블록으로 절단했습니다. (B) EM 샘플 준비. (C) 다이아몬드 나이프를 사용한 초박형 단면과 커버글라스의 개략도. (D) FM 이미징 및 TEM 이미징. 약어: EM = 전자 현미경; FM = 형광 현미경; TEM = 투과 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 금 나노 입자로 커버글라스 코팅. (A) 원심분리를 통해 피올로포름으로 커버글라스를 덮습니다. (B) 커버글라스 표면을 폴리-L-라이신으로 배양합니다. (C) 희석된 금 나노입자로 커버글라스 표면을 배양한다. (D) 코팅된 커버글라스의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: FM 이미징 및 EM 이미징을 위한 준비 일정. (A) FM 이미징 준비의 작업 흐름은 (i) 초박형 섹션 퍼내기, (ii) 공기 건조, (iii) 버퍼를 추가한 후 두 번째 커버글라스 배치, (iv) 챔버에 두 커버글라스 고정, FM 이미징의 5단계로 구성됩니다. (B) EM 이미징 준비의 워크플로우는 (i) 두 개의 커버글라스 분리, (ii) 초박형 섹션 플로팅, (iii) 초박형 섹션 퍼내기, (iv) 초박형 섹션을 슬롯 그리드로 이동, (v) EM 이미징의 5단계로 구성됩니다. 약어: EM = 전자 현미경; FM = 형광 현미경; TEM = 투과 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: mScarlet의 대표적인 CLEM 이미지. (A) 전체 뉴런의 CLEM 이미지. (나,E) 삽입의 CLEM 이미지입니다. (씨,에프) 삽입의 EM 이미지입니다. (디,지) 삽입물의 형광 이미지입니다. 녹색 점은 금 나노 입자를 나타냅니다. 스케일 바 = 5 μm (A), 1 μm (삽입 이미지). 약어: EM = 전자 현미경; FM = 형광 현미경; CLEM = 상관 빛과 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 제시된 프로토콜은 광학 현미경(LM)에서 얻은 표적 단백질의 국소화 정보와 전자 현미경(^EM)에서 표적 단백질을 둘러싼 컨텍스트를 결합할 수 있는 다목적 이미징 방법입니다6. 현재 형광 단백질의 한계로 인해 널리 사용되는 방법은 상관 광 및 전자 현미경(CLEM)을 사전 임베딩하는 것인데, 이는 EM 시료 전처리 전에 LM 이미징이 수행됨을 의미합니다. 거의 모든 기존 형광 단백질은 사전 임베딩 CLEM에서 검사할 수 있습니다. 그러나 불가피한 왜곡과 수축으로 인해 최종 이미지의 정확한 정렬은 불가능합니다⁶. 따라서 CLEM을 사전 임베딩하여 제공되는 정보는 EM 이미징에서 LM에 의해 이미징된 동일한 세포의 미세구조를 확인하는 것입니다.

본 연구에서 제공하는 방법은 EM 시료 전처리 후 LM 이미징을 수행하는 CLEM 후임베딩(post-embedding)이다. EM 시료 전처리에서 화학적 고정으로 인한 수축은 최종 이미지의 정확한 정렬에 영향을 미치지 않습니다. 또한 LM 이미징과 EM 이미징이 모두 동일한 섹션에서 수행되고 금 나노 입자의 도움으로 수행되기 때문에 최종 이미지 정렬이 매우 정확할 수 있습니다. 포스트 임베딩 CLEM을 사용하려면 형광 단백질이 기존 EM 시료 전처리 후에도 형광 신호를 유지해야 합니다. 이전에 우리는 epon을 임베디드 수지⁸로 사용하여 형광 신호를 유지할 수 있는 mEosEM이라는 최초의 형광 단백질을 보고했습니다. 임베딩 수지로 다른 수지와 비교하여 Epon은 우수한 미세 구조 보존 및 절편 특성을 가지고 있습니다. mEosEM에 이어 mKate2^11,16, mCherry2^10,17, mWasabi^10,18, CoGFPv0^10,19, mEosEM-E⁸, mScarlet ^8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H ^8,20 및 HfYFP⁹와 같은 다른 내성 Epon-embedding 형광 단백질이 보고되었습니다.

우리의 경험에 따르면 mScarlet은 다른 형광 단백질보다 우수합니다. 고정 용액은 형광 단백질의 형광에 영향을 줄 수 있습니다. 일반적으로 파라포름알데히드(PFA)의 고정 진행 속도는 글루타르알데히드(GA)보다 훨씬 느립니다. 반대로, PFA는 더 큰 GA보다 더 빨리 샘플을 관통합니다. PFA와 GA의 혼합물은 품질을 유지할 수 있을 만큼 빠르게 시료를 고정하는 것과 산화와 같은 시료 손상이 발생하지 않을 만큼 천천히 고정하는 것 사이의 균형을 제공합니다. GA 농도가 높을수록 더 높은 자가형광이 생성됩니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 수지 블록에서 mScarlet의 형광은 중합 후 6개월 후에 검출할 수 있습니다. 그러나 중합 직후 CLEM 이미징을 수행하는 것이 좋습니다.

CLEM 포스트 임베딩의 또 다른 핵심 요소는 LM 이미지를 EM 이미지에 정확하게 등록하는 방법입니다. 이전에 보고된 방법 ^6,21을 기반으로 프로토콜을 일부 수정했습니다. 첫 번째는 EM 이미징에서 LM으로 이미징된 동일한 세포를 찾는 방법입니다. 우리는 DIC와 형광 이미징 모드를 사용하여 전체 초박형 섹션의 탐색 맵을 스티칭하기 위해 다양한 FOV를 사용했습니다. 내비게이션 맵을 사용하면 관심 있는 세포를 쉽게 식별할 수 있습니다. 또 다른 개선 사항은 정확한 이미지 정렬입니다. 이전에는 형광 이미징 모드에서 형광 신호를 사용하고 금 나노 입자의 EM 이미징 모드에서 높은 전자 대비 신호를 기준 정렬 마커로 사용했습니다⁶. 그러나, mScarlet을 사용하는 경우, mScarlet의 형광 신호는 금 나노 입자의 형광 신호보다 훨씬 높았으며, 금 나노 입자의 형광 신호를 검출하는 것이 어려웠다. 이 문제를 해결하기 위해 형광 신호 대신 금 나노 입자의 명시야 신호를 정합에 사용했습니다. 이 수정된 프로토콜에 따라 사후 임베딩 CLEM을 쉽게 수행할 수 있었습니다.

그러나 현재 프로토콜에는 사용하기 전에 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 과발현 시스템에서 잘 작동하지만, 표적 단백질이 그들의 본래 프로모터 아래에 있는 경우 형광은 매우 희미하다(²²). 또 다른 한계는 mScarlet이 EM 시료 전처리 후 충분한 형광 신호를 유지할 수 있고 포유류 세포에서 잘 작동하는 최고의 형광 단백질(당사의 경험에 따르면)이지만, mScarlet을 뉴런에서 형광 태그로 사용할 때 문제가 될 수 있으며, 이는 표적 단백질의 잘못된 위치로 이어질 수 있다는 것이다¹⁵. 이러한 경우 뉴런에서 잘 작동하는 mScarlet의 돌연변이인 oScarlet¹⁵를 사용하는 것이 좋습니다.

이 수정된 프로토콜의 잠재적 응용 분야는 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다. 첫 번째는 세포 내 수준으로 확대하는 것인데, 이는 세포 내 맥락에서 표적 단백질을 연구하는 것을 의미합니다. 이전에 발표된 보고서에서 우리는 γ-헤르페스 바이러스에 감염되는 동안 세포질 비리온 조립 구획(cVAC)의 형성을 조사하기 위해 post-embedding CLEM을 사용했습니다²³. 향후 응용 분야에서, 포스트 임베딩 CLEM은 전자 단층 촬영과 결합되어 표적 단백질의 3D 분포를 얻고 3D 구조를 기본적으로 해결할 수 있습니다²⁴. 두 번째 유형의 잠재적 응용 분야는 신경 회로를 그리고 분석하는 데 사용할 수 있는 세포 수준으로 축소하는 것입니다. 고해상도 기능으로 인해 EM은 미세한 뇌 연결을 매핑하는 효과적인 수단이 되었습니다. 그러나 EM은 뉴런의 정체를 정확하게 제공할 수 없기 때문에 뉴런 회로에 대한 심층 분석이 제한됩니다. Epon post-embedding CLEM은 미세 구조를 손상시키지 않으면서 뉴런의 정체성을 뉴런 회로로 가져올 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 M 인산염 완충액 (PB)			NaH2PO4 < / sub> · 2H2O + Na2 < / sub>HPO4 < / sub> · 12H 2 < / sub>O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)	Shanghai yuanye Bio-Technology	R26284
25 % 글루 타르 알데히드 (GA)	Alfa Aesar	A17876	유해 화학
Abbelight 3D	Nanolnsights
아세톤	SCR	10000418
수산화암모늄	J& K Scientific	335213
BioPhotometer D30	eppendorf
커버 글라스			50 mL 수산화암모늄, 50 mL 과산화수소, 250 mL H2O
Coverglass	Warner	64-0715
DABCO	Sigma	290734	유해 화학물질
DDSA	SPI 회사	GS02827	유해 화학물질
데스크탑 원심분리기	WIGGENS	MINICEN 10E
다이아몬드 나이프	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI 회사	GS02823	유해 화학물질
DNA 트랜스펙션 시약	Thermo Fisher	2696953	Lipofectamine 3000 트랜스펙션 키트
Epon 812		유해 화학 물질
에탄올	SCR	GS02659
피지 이미지 J	국립 보건
고칠 용액			4 % PFA + 0.25 % GA + 0.02 M PB
Formvar	Sigma	9823
글리세롤	SCR	10010618
금 나노 입자	Corpuscular	790120-010
그라디언트 수지			아세톤 대 수지 3 : 1, 1 : 1, 1 : 3
불화 수소산	SCR	10011118
과산화	수소SCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)			Easy CLEMv0
플러그인 이미징 챔버	Thermo Fisher	A7816
대형 젤라틴 캡슐	전자 현미경 과학	70117
마운팅 버퍼			Mowiol 4-88, 글리세롤, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO4  ž12H2O	SCR	10020318
NaH2PO4  ž2H2O	SCR	20040718
NMA	SPI 회사	GS02828	유해 화학 물질
올리고뉴클레오티드 프라이머	Takara Biomedical Technology (베이징)		3개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 Vglut2-ires-Cre 및 야생형을 동시에 검출했습니다. 프라이머 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, 및 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3,는 Vglut2-ires-Cre를 탐지하는 것을 목표로 했습니다. 프라이머  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, 및 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3,는 야생형을 탐지하는 것을 목표로 합니다.
진동 마이크로톰	Leica	VT1000S
Osmium tetroxide	SCR	L01210302	유해 화학물질
OsO4 용액			1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6· 3H2O
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehyde (PFA)	SCR	80096618	Hazardous chemical
Perfusion buffer			4% PFA+0.1 M PB
Pioloform	Sigma	63148-65-2	Hazardous chemical
Poly-L-lysine;	시그마	25986-63-0
칼륨 페로시안화물 (K4Fe (CN)6· 3H2O)	SCR	10016818
메스 블레이드	Merck	S2771
메스 핸들	Merck	S2896-1EA
실체현미경	OLYMPUS	MVX10
형질전환 마우스	Jackson Laboratory		Vglut2-ires-Cre 마우스(균주: 129S6/SvEvTac)는 표준 조건(25°C; C, 12시간의 라이트/다크 사이클, 물과 음식이 임시로 주어집니다. 수컷과 암컷 마우스는 2&ndash에서 사용되었습니다. 생후 3개월, 체중 범위 20-30g.
투과전자현미경 (TEM)	FEI		TECNAL G2
UA solution (2% UA)			수용액
Ultramicrotome	Leica	EM UC6
Uranyl acetate (UA)	TED PELLA	19481	유해 화학물질