우리는 mScarlet이라는 형광 단백질을 사용하여 Epon post-embedding correlative light and electron microscopy에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 형광과 미세구조를 동시에 유지할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 생물학적 응용 분야에 적용할 수 있습니다.
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방법 논문
Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
상관 광 및 전자 현미경(CLEM)은 형광 현미경(FM)이 제공하는 국소화 정보와 전자 현미경(EM)으로 획득한 세포 초미세 구조의 맥락을 결합한 포괄적인 현미경입니다. CLEM은 형광과 미세구조 사이의 절충안이며, 일반적으로 초미세구조는 형광을 손상시킵니다. 글리시딜 메타크릴레이트, HM20 또는 K4M과 같은 다른 친수성 임베딩 수지와 비교할 때 Epon은 미세구조 보존 및 절편 특성이 우수합니다. 이전에 우리는 mEosEM이 오스뮴 사산화물 고정 및 에폰 임베딩에서 살아남을 수 있음을 입증했습니다. mEosEM을 사용하여 형광과 초미세 구조를 동시에 유지하는 Epon 포스트 임베딩 CLEM을 처음으로 달성했습니다. 여기에서는 EM 샘플 준비, FM 이미징, EM 이미징 및 이미지 정렬에 대한 단계별 세부 정보를 제공합니다. 또한 EM 이미징 중에 FM 이미징으로 이미징된 동일한 세포를 식별하는 절차를 개선하고 FM과 EM 이미지 간의 정합을 자세히 설명합니다. 우리는 전통적인 EM 시설에서 이 새로운 프로토콜에 따라 상관 광 및 전자 현미경을 포함하는 Epon 포스트 임베딩을 쉽게 달성할 수 있다고 믿습니다.
서론
형광 현미경(FM)을 사용하여 표적 단백질의 국소화 및 분포를 얻을 수 있습니다. 그러나 표적 단백질을 둘러싼 컨텍스트가 손실되며, 이는 표적 단백질을 철저히 조사하는 데 매우 중요합니다. 전자 현미경(EM)은 이미징 해상도가 가장 높아 여러 세포 내 세부 정보를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 EM에는 표적 라벨링이 없습니다. FM으로 촬영한 형광 이미지를 EM으로 획득한 회색 이미지와 정확하게 병합함으로써 상관광 및 전자 현미경(CLEM)은 이 두 가지 이미징 모드 1,2,3,4에서 얻은 정보를 결합할 수 있습니다.
CLEM은 형광과 초미세구조1 사이의 절충안이다. 현재 형광 단백질과 기존 EM 시료 전처리 절차의 한계, 특히 오스믹산(OsO4) 및 Epon과 같은 소수성 수지의 사용으로 인해 미세구조는 항상 형광5를 손상시킵니다. OsO4 는 EM 시료 전처리에 없어서는 안 될 시약으로, ....
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프로토콜
축산 및 실험은 Fujian Medical University Medical Center의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 현재 프로토콜의 단계별 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 샘플 준비
- 쥐의 뇌
- 형질전환 마우스( 재료 표 참조) 및 올리고뉴클레오티드 프라이머( 재료 표 참조)를 구입하여 이러한 마우스의 유전자형을 분석합니다.
- 이전에 발표된 프로토콜12,13에 따라 두개골 금고에서 온전한 뇌를 관류하고 제거합니다.
- 4°C에서 밤새 10mL의 고정 용액( 재료 표 참조)을 사용하여 마우스 뇌를 고정합니다.
- 0.1M 인산염 완충액(PB)으로 3 x 10분 동안 고정 용액을 헹굽니다.
- 진동 마이크로톰을 사용하여 마우스 뇌를 500μm 두께의 섹션으로 자릅니다( 재료 표
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결과
이전 보고서에서는 mScarlet이 리소좀15를 표적으로 삼을 수 있음을 보여주었습니다. 이 프로토콜에서 mScarlet(rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA)을 발현하는 AAV를 입체적 계기를 사용하여 Vglut2-ires-cre 마우스 뇌의 M1(ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5)에 주입했습니다. 위에서 설명한 프로토콜에 따라 최종 상관 이미지가 그림 4A에 나와 있습니다. FM 이미지는 금 나노 입자(녹색 점)를 기준 마커로 사용하여 EM 이미지와 정확하게 정렬할 수 있습니다. EM 이미지(그림 4C,F)에서 볼 수 있듯이 mScarlet은 리소좀을 표적으로 하며 리소좀 내부의 내용물은 이질적이며, 이는 2차 리소좀의 전형적인 특성입니다.
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토론
여기에 제시된 프로토콜은 광학 현미경(LM)에서 얻은 표적 단백질의 국소화 정보와 전자 현미경(EM)에서 표적 단백질을 둘러싼 컨텍스트를 결합할 수 있는 다목적 이미징 방법입니다6. 현재 형광 단백질의 한계로 인해 널리 사용되는 방법은 상관 광 및 전자 현미경(CLEM)을 사전 임베딩하는 것인데, 이는 EM 시료 전처리 전에 LM 이미징이 수행됨을 의미합니다. 거의 모든 기존 형광 단백질은 사전 임베딩 CLEM에서 검사할 수 있습니다. 그러나 불가피한 왜곡과 수축으로 인해 최종 이미지의 정확한 정렬은 불가능합니다6. 따라서 CLEM을 사전 임베딩하여 제공되는 정보는 EM 이미징에서 LM에 의해 이미징된 동일한 세포의 미세구조를 확인하는 것입니다.
본 연구에서 제공하는 방법은 EM 시료 전처리 후 LM 이미징을 수행하는 CLEM 후임베딩(post-embedding)이다. EM 시료 전처리에서 화학.......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 중국 국립 자연 과학 재단 (32201235 to Zhifei Fu), 중국 푸젠 성 자연 과학 재단 (2022J01287 to Zhifei Fu), 중국 푸젠 의과 대학 고급 인재 연구 재단 (XRCZX2021013 Zhifei Fu), 중국 푸젠 성 금융 특수 과학 재단 (22SCZZX002 to Zhifei Fu), 비인간 영장류에 대한 생식력 조절 기술 평가의 NHC 핵심 연구소 및 푸젠 산부인과 및 아동 건강 병원 설립(2022-NHP-04 to Zhifei Fu). EM 샘플 준비 및 EM 이미징을 지원해 주신 Fujian Medical University 공공 기술 서비스 센터의 Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin, Yan Hu에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 M 인산염 완충액 (PB) | NaH2PO4 < / sub> · 2H2O + Na2 < / sub>HPO4 < / sub> · 12H 2 < / sub>O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25 % 글루 타르 알데히드 (GA) | Alfa Aesar | A17876 | 유해 화학 |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| 아세톤 | SCR | 10000418 | |
| 수산화암모늄 | J& K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| 커버 글라스 | 50 mL 수산화암모늄, 50 mL 과산화수소, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | 유해 화학물질 |
| DDSA | SPI 회사 | GS02827 | 유해 화학물질 |
| 데스크탑 원심분리기 | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| 다이아몬드 나이프 | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI 회사 | GS02823 | 유해 화학물질 |
| DNA 트랜스펙션 시약 | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 트랜스펙션 키트 |
| Epon 812 | 유해 화학 물질 | ||
| 에탄올 | SCR | GS02659 | |
| 피지 이미지 J | 국립 보건 | ||
| 고칠 용액 | 4 % PFA + 0.25 % GA + 0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| 글리세롤 | SCR | 10010618 | |
| 금 나노 입자 | Corpuscular | 790120-010 | |
| 그라디언트 수지 | 아세톤 대 수지 3 : 1, 1 : 1, 1 : 3 | ||
| 불화 수소산 | SCR | 10011118 | |
| 과산화 | 수소SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 | ||
| 플러그인 이미징 챔버 | Thermo Fisher | A7816 | |
| 대형 젤라틴 캡슐 | 전자 현미경 과학 | 70117 | |
| 마운팅 버퍼 | Mowiol 4-88, 글리세롤, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI 회사 | GS02828 | 유해 화학 물질 |
| 올리고뉴클레오티드 프라이머 | Takara Biomedical Technology (베이징) | 3개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 Vglut2-ires-Cre 및 야생형을 동시에 검출했습니다. 프라이머 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, 및 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3,는 Vglut2-ires-Cre를 탐지하는 것을 목표로 했습니다. 프라이머 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, 및 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3,는 야생형을 탐지하는 것을 목표로 합니다. | |
| 진동 마이크로톰 | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | 유해 화학물질 |
| OsO4 용액 | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6· 3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine; | 시그마 | 25986-63-0 | |
| 칼륨 페로시안화물 (K4Fe (CN)6· 3H2O) | SCR | 10016818 | |
| 메스 블레이드 | Merck | S2771 | |
| 메스 핸들 | Merck | S2896-1EA | |
| 실체현미경 | OLYMPUS | MVX10 | |
| 형질전환 마우스 | Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre 마우스(균주: 129S6/SvEvTac)는 표준 조건(25°C; C, 12시간의 라이트/다크 사이클, 물과 음식이 임시로 주어집니다. 수컷과 암컷 마우스는 2&ndash에서 사용되었습니다. 생후 3개월, 체중 범위 20-30g. | |
| 투과전자현미경 (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | 수용액 | ||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | 유해 화학물질 |
참고문헌
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolu....
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재인쇄 및 허가
