방법 논문

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

DOI:

10.3791/66169

⸱

2024년 1월 5일

 , 
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

액체-액체 상 분리(LLPS)를 통해 형성된 생체 분자 응축물은 세포 조직과 증가하는 세포 기능에 중요한 것으로 간주되어 왔습니다. 살아있는 세포의 LLPS를 특성화하는 것도 중요한데, 비정상적인 응축은 암 및 신경퇴행성 질환을 포함한 수많은 질병과 관련이 있기 때문입니다. LLPS는 종종 본질적으로 무질서한 단백질 간의 선택적, 일시적 및 다가 상호 작용에 의해 주도됩니다. LLPS에 참여하는 단백질의 상호 작용 역학은 결합 체류 시간(RT), 즉 응축수 내에서 결합하는 데 소비하는 시간의 양으로 잘 요약됩니다. 여기에서는 응축수 내 특정 단백질의 평균 RT를 측정할 수 있는 살아있는 세포 단일 분자 이미징을 기반으로 하는 방법을 제시합니다. 개별 단백질 분자와 이들이 연관된 응축물을 동시에 시각화하고, 단일 입자 추적(SPT)을 사용하여 단일 분자 궤적을 표시한 다음, 단백질의 평균 RT를 추출하기 위해 단백질 액적 결합 모델에 궤적을 맞춥니다. 마지막으로, 이 단일 분자 이미징 방법을 적용하여 올리고머화 도메인에 융합 및 비융합될 때 LLPS 응축물에서 단백질의 평균 RT를 비교한 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜은 LLPS에 참여하는 모든 단백질의 상호 작용 역학을 측정하는 데 광범위하게 적용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

점점 더 많은 연구가 생체 분자 응축물이 세포 조직과 수많은 세포 기능(예: 전사 조절 1,2,3,4,5, DNA 손상 복구 6,7,8, 염색질 조직 9,10,11,12, X-염색체)에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다 불활화 13,14,15 및 세포 내 신호 16,17,18. 또한, 생체 분자 응축물의 조절 장애는 암(19,20,21) 및 신경퇴행성 질환(22,23,24,25,26)을 포함한 많은 질병과 관련이 있다. 응축수 형성은 종종 일시적, 선택적, 다가 단백질-단백질, 단백질-핵산 또는 핵산-핵산 상호작용에 의해 유발된다27. 특정 조건에서 이러한 상호 작용은 액체-액체 상 분리(LLPS)로 이어질 수 있으며, 이는 막이 없는 액적에서 특정 생체 분자를 국부적으로 농축하는 밀도 전이입니다. 이러한 다가 상호작용은 종종 단백질 1,28,29의 내재적 무질서 영역(IDR)에 의해 매개됩니다. 분자 수준에서 이러한 상호 작용의 생물물리학적 특성 분석은 응축수가 널리 퍼져 있다는 점을 감안할 때 수많은 건강하고 비정상적인 세포 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 공초점 형광 현미경 기반 기술(예: 광표백(FRAP)30,31,32 후 형광 복구)는 응축물과 주변 세포 환경 간의 분자 교환이 동적임을 정성적으로 보여주기 위해 널리 사용되어 왔지만, 응축수 내 특정 생체 분자의 상호 작용 역학을 정량화하는 것은 일반적으로 기존의 공초점 현미경 또는 단일 분자를 사용하여 불가능합니다 특별한 데이터 분석 방법이 없는 현미경 검사. 이 프로토콜에 기술된 단일 입자 추적(SPT) 기법은 살아있는 세포 단일 분자 현미경(33)을 기반으로 하며, 응축수 내의 특정 단백질 간의 상호 작용 역학을 정량화하는 독특하고 강력한 도구를 제공합니다. 이러한 측정을 위한 SPT의 판독값은 응축수에서 관심 단백질의 평균 체류 시간입니다.

프로토콜은 데이터 수집과 데이터 분석의 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 이미징 데이터 수집의 첫 번째 단계는 HaloTag34에 융합된 관심 단백질을 세포에서 발현하는 것입니다. 이를 통해 2개의 형광단으로 관심 단백질을 표지할 수 있으며, 여기서 대부분의 단백질 분자는 비광활성성 형광단(예: JFX549 Halo ligand35)으로 표지되고 그 중 작은 부분은 스펙트럼적으로 구별되고 광활성화 가능한 형광단(예: PA-JF646 Halo ligand36)으로 표지됩니다). 이를 통해 셀의 모든 응축수 위치를 동시에 획득하고 응축물에 결합 및 결합 해제하는 관심 단백질의 단일 분자 동영상을 획득할 수 있습니다. 한편, 동일한 유형의 세포는 착색질에 크게 움직이지 않는 히스톤인 Halo-tagged H2B를 안정적으로 발현하도록 변형됩니다. 그런 다음 세포를 PA-JF646 Halo 리간드로 염색하여 H2B의 단일 분자 이미징을 가능하게 합니다. 아래에서 자세히 논의되겠지만, 이 실험은 관심 단백질의 상호 작용 역학을 정밀하게 정량화할 수 있도록 광표백의 기여를 설명합니다. 그런 다음 이미징 실험을 위한 세포를 깨끗한 커버슬립에서 배양하고 HaloTag 리간드로 염색한 다음 살아있는 세포 이미징 챔버에 조립해야 합니다. 거기에서 샘플은 2채널 이미징 및 단일 분자 검출이 가능한 전반사 형광(TIRF) 현미경의 고도로 기울어진 적층 광학 시트(HILO) 조명 아래에서 이미지화됩니다. 그런 다음 방출은 두 대의 카메라로 나뉘는데, 하나는 응축수 위치를 추적하고 다른 하나는 단일 분자를 추적합니다. 획득은 자유확산 단백질을 흐리게 하고 세포(37) 내의 안정한 구조에 결합하기 때문에 이동성이 적은 단백질만을 포획하기 위해 긴 통합 시간(수백 ms 정도)으로 수행된다.

데이터 분석의 첫 번째 단계는 확립된 단일 입자 추적(SPT) 알고리즘(38,39)을 사용하여 영화의 각 프레임에서 개별 단백질 분자를 국소화하고 검출 가능한 수명 동안 각 분자에 대한 궤적으로 국소화를 조립하는 것입니다. 그런 다음 궤적은 궤적 전체에 걸친 분자의 국소화를 해당 시간1에서 모든 응축수의 국소화와 비교하여 응축수 내부의 분자를 나타내는 분자와 응축수 외부의 분자를 나타내는 궤적으로 분류됩니다.

다음으로, 생존 곡선(1 - CDF)은 모든 응축수 내 궤적의 길이를 사용하여 생성됩니다. 분자의 겉보기 평균 체류 시간은 생존 곡선을 단백질 결합의 다음 2 성분 지수 모델에 적합시킴으로써 추출됩니다.

figure-introduction-1,

A는 비특이적으로 결합된 분자의 분율로, kobs,ns 및 kobs,s 는 각각 비특이적으로 결합된 분자 및 특이적으로 결합된 분자의 관찰된 해리 속도입니다. 여기서부터는 kobs,s 만 고려됩니다. 단백질 해리, ktrue, s와 형광단의 광표백, kpb의 역학은 kobs, s 에 다음과 같이 기여합니다.

figure-introduction-2;

따라서, 단백질 해리의 효과를 분리하기 위해, 앞서 언급한 세포주에서 H2B-Halo의 특정 해리 속도를 측정한다.

figure-introduction-3

H2B는 염색질에 안정적으로 통합되고 단일 분자 영화 획득의 시간 척도에서 최소한의 해리를 경험하는 단백질입니다37. 특정 해리 속도는 PA-JF646 Halo 리간드의 광표백 속도와 같습니다.

figure-introduction-4.

관심있는 단백질의 평균 응축수 체류 시간, figure-introduction-5, 그 때

figure-introduction-6.

Irgen-Gioro et al.40 의 대표적인 결과가 나타나며, 이 프로토콜은 올리고머화 도메인을 IDR에 융합하면 응축수에서 IDR의 체류 시간이 길어진다는 것을 입증하기 위해 적용되었습니다. 이 결과는 추가된 올리고머화 도메인이 LLPS를 구동하는 IDR의 동형 상호작용을 안정화시킨다는 것을 시사한다. 원칙적으로, 약간 수정된 프로토콜을 사용하는 동일한 방법을 적용하여 모든 유형의 응축물 형성에 관여하는 모든 단백질의 동형 또는 이형 상호 작용을 특성화할 수 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포 내 단백질 라벨링

  1. 원하는 세포주에서 HaloTag에 융합된 관심 단백질을 발현합니다.
  2. 트랜스포손(transposon) 또는 바이러스 형질도입(viral transduction)을 사용하여 1.1과 동일한 유형의 세포에서 Halo-tagged H2B를 안정적으로 발현합니다.

2. 커버슬립의 준비

  1. 세포 배양에 커버슬립을 사용하기 전에 커버슬립을 청소하여 자가형광 오염 물질을 제거하십시오.
    1. 직경 25mm, #1.5 커버슬립을 세라믹 염색 랙에 장착하고 폴리프로필렌 용기에 넣습니다.
    2. 커버슬립을 KOH의 1M 용액에 완전히 담그고 1시간 동안 초음파 처리합니다.
    3. 커버슬립을 이중 증류수(ddH2O)로 세 번 헹굽니다.
    4. 커버슬립을 100% 에탄올에 완전히 담그고 1시간 동안 초음파 처리합니다.
    5. 커버슬립을 ddH2O로 희석한 20% 에탄올에 완전히 담그고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.

3. 현미경 검사를 위한 세포 준비

알림: 세포의 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 이 섹션의 단계를 수행하십시오.

  1. 청소된 커버슬립에 셀을 플레이트합니다. Halo-tagged 단백질이 일시적으로 발현되는 경우 이미징 2일 전에 수행합니다. Halo-tagged 단백질이 안정적으로 또는 내인성으로 발현되는 경우 이미징 1일 전에 수행합니다.
    1. 멸균 겸자를 사용하여 커버슬립을 6웰 플레이트(세포 샘플당 커버슬립/웰 1개)에 넣고 잔류 에탄올이 증발하도록 합니다.
    2. 이미징 시점까지 70%의 밀도를 달성하기 위해 적절한 수의 세포로 각 웰을 플레이트합니다. 동일한 표적 밀도를 가진 H2B-Halo를 안정적으로 발현하는 세포로 추가 웰을 도금합니다.
    3. 관심 있는 Halo-tagged 단백질을 일시적으로 발현하는 경우에만 이 단계를 따르십시오. 37 °C 및 5 % CO 2 에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 적절한 transfection 시약을 사용하고 제조업체의 지침에 따라 tagged 단백질을 인코딩하는 plasmid로 세포를 transfection합니다.
    4. 37 °C 및 5 % CO 2 에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다.
  2. 관심 있는 Halo-tagged 단백질을 발현하는 세포를 non-photoactivaable Halo 리간드(예: JFX549)와 photoactivatable Halo 리간드(예: PA-JF646)로 염색합니다. 광활성화 가능한 Halo 리간드만으로 H2B-Halo를 발현하는 염색 세포.
    참고: 여기에 나열된 Halo 리간드의 농도는 시작점으로 사용해야 합니다. 최적의 농도는 관심 단백질의 발현 수준과 응축수 내 국소 농도에 따라 달라집니다.
    1. 관심 있는 Halo-tagged 단백질을 발현하는 각 세포 샘플에 대해 100nM JFX549 Halo 리간드35 및 20nM PA-JF646 Halo 리간드36 을 500μL의 적절한 세포 배지에 희석합니다. H2B-Halo를 발현하는 각 샘플에 대해 500μL의 적절한 세포 배지에 20nM PA-JF646 Halo 리간드만 희석합니다.
    2. 각 웰에 대해 기존 배지를 흡인하고, 1x PBS 2mL를 추가한 다음, PBS를 흡입하고(프로토콜의 나머지 부분에서는 이를 "헹굼"이라고 함) 적절한 Halo 리간드가 포함된 배지로 교체합니다.
    3. 37 °C 및 5 % CO2 에서 1 시간 동안 배양합니다.
    4. PBS로 4번 헹구고 Halo 리간드가 포함되지 않은 새 배지로 교체합니다.
    5. 37 °C 및 5 % CO2에서 15 분 동안 배양합니다.
    6. 3.2.4 및 3.2.5 단계를 세 번 반복합니다(총 4번의 헹굼-배양 주기).
    7. 멸균 겸자를 사용하여 세포가 있는 커버슬립을 현미경 스테이지와 호환되는 세포 배양 커버슬립 챔버로 옮깁니다.
    8. 페놀 적색이 없는 배지를 챔버에 추가하고 이미징을 진행합니다. 즉시 이미징되지 않고 필요할 때까지 37°C 및 5%CO2 에서 샘플을 배양합니다.

4. 단일 분자 이미징

참고: H2B와 관심 단백질의 체류 시간을 측정하는 독립적인 실험은 통계적으로 유의미한 결과를 생성하기 위해 수일(≥3)일에 걸쳐 수행되어야 합니다. 현미경에서 세포 샘플을 이미징하기 전에 0.1μm 염색 마이크로스피어(Table of Materials) 또는 유사한 보정 표준을 사용하여 두 카메라를 정렬합니다.

  1. 현미경을 준비합니다.
    1. 현미경과 현미경을 제어하는 컴퓨터를 켭니다.
    2. 현미경에서 살아있는 세포 배양 구성 요소(히터 및 CO2)를 켜고 37°C 및 5% CO2로 설정합니다. 시스템이 평형을 이룰 때까지 기다립니다.
    3. 현미경의 100x TIRF 오일 이멀젼 대물렌즈에 적절한 오일 한 방울을 떨어뜨리고 세포 샘플을 현미경 스테이지에 로드합니다.
  2. 영상화할 세포를 식별합니다.
    1. 명시야 조명 아래에서 세포 샘플을 이미지화하고 세포에 초점이 맞춰질 때까지 z 위치를 조정합니다.
    2. 건강한 세포의 형태학적 특성을 나타내는 세포를 식별합니다.
    3. 표적 세포핵만 캡처하도록 시야(FOV)를 자릅니다.
    4. 레이저 조명을 사용하고 단일 분자의 최적 신호 대 잡음비를 갖는 HILO 조명41 이 달성될 때까지 TIRF 각도를 조정합니다.
  3. 살아있는 세포의 H2B-Halo를 이미지화합니다.
    참고: 이 섹션에 사용된 레이저 출력은 이 실험에만 해당되며 ex로 포함되어 있습니다.amp르. 토론에 나열된 기준에 따라 적절한 레이저 출력을 선택해야 합니다.
    1. 다음과 같이 획득 구성을 설정합니다. 노출 시간을 500ms로 설정합니다. 각 500ms 노출 동안 PA-JF646 표지된 H2B-Halo 분자를 9.1mW, 640nm 빔으로 여기시킵니다. 프레임 사이의 데드 타임(여기에 사용된 이미징 시스템에서는 158.01μs) 동안 111μW, 405nm 빔으로 분자를 광활성화합니다.
    2. 이 설정에서 2000프레임을 연속으로 캡처합니다. 광활성화 분자의 수가 충분하지 않을 때 획득 과정에서 405nm 빔의 출력을 점진적으로 증가시킵니다.
  4. 살아있는 세포에서 관심 있는 Halo-tagged 단백질을 이미지화합니다.
    1. 장역 통과 이색성 미러를 사용하여 PA-JF646을 감지하는 카메라와 JFX549를 감지하는 카메라 간에 방출 파장을 분할합니다. 카메라 앞에 적절한 방출 필터를 사용하십시오.
    2. 4.3.1에 설명된 것과 동일한 획득 구성을 다음 수정과 함께 사용합니다. JFX549 채널을 추가하여 시간 경과에 따른 Halo-tagged 단백질 응축물의 위치를 추적합니다. 10초마다 PA-JF646 채널의 획득을 유지하면서 JFX549 채널에서 하나의 프레임(500ms, 2.1mW, 561nm 여기)을 획득합니다. 이로 인해 PA-JF646 채널로 블리드스루가 발생하며, 이는 획득 후 데이터 분석에서 처리됩니다.
    3. 이 설정에서 2000프레임을 연속으로 캡처합니다. 광활성화 분자의 수가 충분하지 않을 때 획득 과정에서 405nm 빔의 출력을 점진적으로 증가시킵니다.

5. 단일 분자 이미징 데이터 분석

참고: 섹션 5 전체에서 사용된 매개변수는 이 실험에만 해당되며 예제로 포함되어 있습니다. 토론에 나열된 기준에 따라 적절한 매개 변수를 선택해야 합니다.

  1. 처리를 위해 원시 이미징 데이터를 준비합니다.
    1. 관심 단백질 데이터의 경우 ImageJ 또는 유사한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 원시 이미징 데이터 파일의 각 채널을 독립적인 .tif 파일로 변환합니다. H2B 데이터의 경우 동일한 방식으로 원시 이미징 데이터 파일의 단일 채널을 .tif 파일로 변환합니다.
      참고: 사용 중인 획득 소프트웨어에 따라 10초마다 하나의 응축수 추적 프레임만 촬영되므로 응축수 동영상에 빈 프레임이 있을 수 있습니다. 빈 프레임은 가장 최근의 응축수 프레임으로 채워야 합니다(일부 수집 소프트웨어는 자동으로 이 작업을 수행함). 또한 응축수 추적 프레임 동안 응축수(JFX549) 채널에서 단일 분자(PA-JF646) 채널로 상당한 블리드스루가 있는 경우 해당 단일 분자 프레임을 가장 최근의 단일 분자 프레임으로 교체해야 합니다.
    2. 위와 같은 이유로 두 동영상 중 하나에서 교체해야 하는 프레임이 있는 경우 Chong et al.1에서 사용할 수 있는 ImageJ 매크로인 pretracking_comb.txt를 수정하고 실행한 다음 프롬프트에 따라 해당 동영상의 최신 프레임으로 교체합니다.
  2. SPT 소프트웨어, 예를 들어, Teves et al.42에서 입수할 수 있는 MTT 알고리즘(38)의 GUI 구현인 SLIMfast39를 사용하여 단일 입자 궤적을 생성한다.
    1. Load > Imagestack을 클릭하여 SLIMfast에서 단일 분자 동영상이 포함된 5.1.2의 파일을 로드합니다.
    2. 매개변수를 설정합니다(현지화 오류율: 10-6; 디플레이션 루프: 3) OPT > 시트: 현지화를 클릭하여 현지화를 위해.
    3. 매개변수를 설정합니다(피크 방출: 664nm; 지연 시간: 500 ms) OPT > Sheet: Acquisition을 클릭하여 수집합니다.
    4. 단일 프레임에서 모든 분자의 국소화를 시각화하여 선택한 파라미터가 적절한지 확인합니다(TEST LOC). 적절하지 않은 경우 5.2.2 및 5.2.3 단계에서 매개 변수를 수정하고 이 단계를 반복합니다.
    5. 모든 프레임에 있는 모든 분자의 국소화를 포함하는 파일을 생성합니다(LOC ALL).
    6. Load > Particle Data(파티클 데이터 로드) > SLIMfast를 클릭하여 SLIMfast의 5.2.5에서 파일을 로드합니다.
    7. 파라미터 설정(최대 예상 확산 계수: 0.1μm2/s; 최대 참가자 수: 5) OPT > 시트: 추적을 클릭하여 궤적 생성.
    8. 모든 분자의 궤적을 포함하는 파일(GEN TRAJ)을 생성합니다.
  3. Drosopoulos et al.43에서 사용할 수 있는 evalSPT39를 사용하여 tmin, 2.5초보다 짧은 궤적을 필터링하여 인위적으로 짧은 궤적을 생성하는 추적 오류를 설명합니다.
    1. 5.2.8의 파일을 evalSPT로 로드합니다(+ 5.2.8의 파일 > OK>).
    2. 매개변수를 설정합니다(최소: 5프레임; max: 5.2.8)의 최대 궤적 길이)를 사용하여 2.5초보다 짧은 궤적을 필터링합니다.
    3. 필터링된 모든 궤적이 포함된 파일을 생성합니다(EXPORT DATA).
  4. 관심 단백질의 궤적에 대해서만 이 단계를 따르십시오. 궤적을 응축수 내부와 응축수 외부로 분류한 다음 평균 응축수 내 체류 시간을 추출합니다.
    참고: 이 섹션의 모든 코드는 Chong et al.1에서 확인할 수 있습니다.
    1. JFX549 채널에서 획득한 동영상의 모든 프레임을 임계값으로 설정하여 ImageJ 매크로, 핵 및 클러스터 mask_v2.txt 실행하고 프롬프트에 따라 응축수 위치를 강조 표시하는 시간 진화 바이너리 마스크로 채워진 타임랩스 동영상을 생성합니다.
    2. 5.3.3에서 생성된 단일 분자 궤적을 다시 포맷합니다. MATLAB 스크립트 ConvertASCII_SlowTracking_css3.m을 사용하고 필요에 따라 파일 이름, 경로, 파라미터를 조정합니다. (매개변수: 노출, 0.5초; 해상도, 0.16μm/픽셀).
    3. MATLAB 스크립트 categorization_v4.m을 사용하여 주어진 분자가 응축수 F에서 소비하는 수명의 비율을 기준으로 궤적을 정렬하고 필요에 따라 파일 이름과 경로를 조정합니다.
    4. 응축수 궤적만 사용하여 진행하십시오.
  5. kobs, s, kpb를 추출하고 수정된 평균 체류 시간 figure-protocol-1을 계산합니다.
    1. MATLAB 스크립트 PLOT_ResidenceHist_css.m을 사용하고 필요에 따라 파일 이름, 경로, 파라미터를 조정하여 관심 궤적의 응축수 내 단백질에서 kobs,s를 추출합니다.
      (매개변수: 노출, 0.5초; StartFrameForFit, 5 프레임).
    2. MATLAB 스크립트 PLOT_ResidenceHist_css.m을 사용하고 필요에 따라 파일 이름, 경로, 파라미터를 조정하여 H2B 궤적에서 kpb를 추출합니다.
      (매개변수: 노출, 0.5초; StartFrameForFit, 5 프레임).
    3. 응축수에 특이적으로 결합된 관심 단백질의 수정된 평균 체류 시간을 다음과 같이 계산합니다. figure-protocol-2
      figure-protocol-3
      참고: 이동 입자를 흐리게 할 수 있을 만큼 충분히 긴 다양한 노출 시간(예: 300ms 및 800ms)이 여전히 관심 단백질의 평균 체류 시간이 동일한지 확인하기 위해 제어를 수행해야 합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 Irgen-Gioro et al.40의 대표적인 결과를 제시하며, 이 SPT 프로토콜을 사용하여 각각의 자체 조립된 LLPS 응축물에서 두 단백질의 상호 작용 역학을 비교했습니다. TAF15(TATA-box binding protein associated factor 15)는 인간 세포에서 과발현 시 LLPS를 겪을 수 있는 IDR을 함유하고 있습니다. TAF15(IDR)를 24-서브유닛 올리고머를 형성하는 FTH1(페리틴 중쇄 1)에 융합하면 LLPS를 구동하는 보다 안정적인 동형 단백질-단백질 상호작용이 발생할 것이라는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 테스트하기 위해 U2OS 세포에서 Halo-TAF15(IDR) 또는 TAF15(IDR)-Halo-FTH1 융합을 일시적으로 발현하고 위의 프로토콜에 따라 각 단백질의 2색 단일 분자 이미징을 수행했습니다. TAF15(IDR)-Halo-FTH1 동영상의 대표 프레임이 그림 1A에 나와 있습니다. PA-JF646 채널에서 검출된 분자는 국소화되었고, 이러한 국소화는 궤적으로 조립되었습니다. 그런 다음 결과 궤적을 응축수 위치를 강조하는 바이너리 마스크와 비교하여 응축수 내 및 응축수 외부 모집단 간에 분류했습니다(그림 1B). 가시성을 높이기 위해 궤적의 작은 부분만 표시하지만 응축물에 결합된 분자의 궤적과 응축수 외부에 결합된 분자의 궤적 사이에는 명확한 차이가 있습니다. 다음으로, 응축수 내 궤적 길이의 생존 곡선을 2성분 지수 모델에 맞췄습니다(그림 1C). 마지막으로, 광표백에 대한 보정 후 평균 체류 시간을 추출하고 두 단백질에 대해 표시했습니다(그림 1D). LLPS 응축수에서 Halo-TAF15(IDR)의 평균 체류 시간은 10.23초 ± 1.10초인 반면 TAF15(IDR)-Halo-FTH1의 체류 시간은 64.15초 ± 11.65초였습니다. 이 결과는 TAF15(IDR)에 올리고머화 도메인을 추가하면 실제로 단백질-축합물 결합이 안정화됨을 시사합니다.

figure-results-1
그림 1: SPT 기반 분석법은 응축수에서 단백질의 체류 시간 차이를 해결합니다. A. 아니요. TAF15(IDR)-Halo-FTH1의 2색 단분자 동영상의 대표 프레임. 응축물의 위치를 시각화하기 위해 더 높은 농도의 비광활성화성 염료(100nM JFX549, 노란색)와 개별 단백질을 시각화하기 위해 더 낮은 농도의 광활성성 염료(20nM PA-JF646, 자홍색)의 조합으로 단백질을 라벨링하여 SPT를 가능하게 했습니다. Halo-TAF15(IDR)의 경우 동일한 이미징 조건의 동영상을 획득하고 H2B-Halo의 경우 단일 채널 PA-JF646 동영상을 획득했습니다. 흰색 점선은 핵의 윤곽을 나타냅니다. B. 응축수 위치(회색)와 궤적(다색)의 이진 마스크를 오버레이하는 대표적인 병합 이미지입니다. C. TAF15(IDR)-Halo-FTH1의 대표 생존 곡선은 2성분 지수 모델에 장착되었습니다. D. Halo-TAF15의 평균 체류 시간은 각각의 응축수에서 TAF15(IDR)-Halo-FTH1의 체류 시간보다 현저히 짧았습니다. 각 단백질에 대한 값은 3일에 걸쳐 수행된 독립적인 실험에서 측정된 20개 세포의 평균을 구했습니다. 오차는 평균의 표준 오차로 전파되었으며 별표는 두 단백질의 체류 시간에 유의한 차이를 나타냅니다(p<0.05, Wilcoxon rank-sum test). 이 그림은 Irgen-Gioro et al.40의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 프로토콜은 Irgen-Gioro et al.40에서 조사된 것과 같은 시스템을 위해 설계되었습니다. 응용 분야에 따라 프로토콜의 일부 구성 요소(예: 형광 표지 세포주 생성 방법, 형광 표지 시스템 및 사용되는 커버슬립 스타일)를 수정할 수 있습니다. 세포에서 단백질의 Halo-tagging은 주어진 실험에 더 적합한 전략에 따라 두 가지 전략을 사용하여 수행할 수 있습니다. 1) 외인성 발현: 관심 단백질을 HaloTag에 융합하고 transfection을 사용하여 일시적으로 또는 transposon 또는 viral transduction을 사용하여 안정적으로 표적 세포주에서 융합을 발현합니다. 2) 게놈 편집: CRISPR44와 같은 게놈 편집 기술을 사용하여 표적 세포주에서 관심 있는 내인성 단백질을 암호화하는 유전자 자리에서 HaloTag를 노크합니다. 각각의 장점과 단점은 다른 곳에서 논의되지만(45), 간단히 말해서, 외인성 발현 전략은 시간이 덜 걸리지만 종종 비생리학적인 광범위한 발현 수준을 갖는 세포의 집단을 생산한다. 게놈 편집 전략은 훨씬 더 오래 걸리지만 내인성으로 발현된 관심 단백질을 기본 발현 수준으로 라벨링합니다.

또한 이 프로토콜은 HaloTag의 사용을 특별히 요구하지 않습니다. 오히려, 세포에서 동일한 단백질의 동시 단일 분자 및 앙상블 라벨링을 가능하게 하는 모든 태그와 호환됩니다. 따라서 프로토콜은 SNAP-tag46과 같은 다른 자체 라벨링 태그와 함께 사용하도록 수정할 수 있습니다. 마지막으로, MatTek 접시(MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C)와 같은 세포 배양을 위한 사전 세척된 상업용 유리 바닥 접시는 현미경 대물렌즈 및 이멀젼 오일과 호환되는 경우 커버슬립 챔버 대신 사용할 수 있습니다. 그러나 커버슬립은 사용 직전에 더 철저히 청소할 수 있으므로 바람직합니다.

프로토콜에 대한 위의 수정은 선택 사항이지만 HaloTag 리간드의 농도, 레이저 출력, 국소화 및 추적 매개변수, tmin과 같이 최적화해야 하는 실험 및 분석 매개변수가 있습니다. 광활성화가 불가능한 HaloTag 리간드의 농도는 응축수가 마스크 생성이 가능할 정도로 조밀하게 표지되도록 선택해야 합니다. 광활성화 가능한 HaloTag 리간드의 농도와 광활성화 레이저 출력은 단백질 분자가 양질의 단일 입자 궤적을 생성할 수 있을 만큼 충분히 희박하게 표지되고 광활성화되도록 선택해야 하며, 각 프레임의 국소화가 과도하면 궤적 생성이 부정확해집니다. 대표 결과에 나타난 실험의 경우, 일반적으로 프레임당 현지화 횟수가 5회 미만이었습니다. 여기 레이저 출력은 빠른 광표백을 최소화할 수 있을 만큼 낮게 유지되어야 하지만 단일 분자를 정밀하게 국소화할 수 있을 만큼 높아야 합니다. 단일 분자 국소화 및 추적 매개변수는 여기의 밀도와 관심 단백질의 예상 확산 역학에 따라 조정해야 합니다. 마지막으로, 의 figure-discussion-1 값은 tmin 범위(0초에서 시작하여 노출 시간 단위로 증가함)에서 계산되어야 합니다. 의 figure-discussion-2 값은 tmin의 일부 임계값 이상으로 수렴해야 하며, 이 tmin 은 5.3단계에서 사용해야 합니다.

여기에 설명된 방법은 기존 기술로는 접근할 수 없는 정밀도로 응축수 내 단백질의 상호 작용 역학을 정량화합니다. 또한 최소한의 샘플 교란으로 살아있는 세포에서 그렇게 할 수 있습니다. 이는 이들의 응축수 형성을 포함한 IDR의 상호작용 거동이 그들의 국부적 환경(40)에 크게 의존하기 때문에 매우 중요하다.

Irgen-Gioro et al.40의 대표적인 결과는 자체 조립된 LLPS 응축물에 결합하는 단백질의 체류 시간을 추출하는 이 방법의 능력을 보여줍니다. 중요한 것은 이 방법이 동형 또는 이형 상호 작용을 통해 모든 유형의 응축물에 결합하는 모든 단백질로 쉽게 확장될 수 있다는 것입니다. 또한, LLPS를 거치는 단백질의 상호 작용 역학을 측정하는 데 국한되지 않습니다. 유잉 육종(Ewing Sarcoma)을 유발하는 것으로 알려진 융합 종양 단백질 EWS::FLI1은 전사 활성화 및 종양 변환 기능에 필수적인 역할을 하는 국소 고농도 허브를 형성하는 것으로 나타났습니다 1,2. 이러한 허브의 형성은 EWS::FLI1의 일시적, 선택적, 다가 IDR-IDR 상호 작용에 의해 주도되지만, 지금까지 LLPS 응축수 1,2가 진짜라는 설득력 있는 증거는 아직 없습니다. 그렇다 하더라도, 여기에 제시된 방법을 사용하여 허브에서 EWS::FLI1의 평균 체류 시간을 측정하고 특정 잔기의 돌연변이와 IDR의 결실이 허브1에 대한 EWS::FLI1의 결합을 크게 불안정하게 만든다는 것을 보여주었습니다.

응축수 내 단백질의 결합 역학을 특성화하는 데 있어 이 방법의 다양성에도 불구하고, 특정 상황에서 단백질 결합을 위한 모델을 선택할 때 주의를 기울여야 합니다. 현존하는 생화학적 데이터는 2-성분 지수 분포가 종종 많은 시스템(1,37,40,42)에 적합한 모델이라는 생각을 지지하지만, 동일한 분포는 또한 3-성분 지수 47,48,49 및 멱법칙 분포(50)와 같은 대안 모델인 다른 시스템에서는 단백질 결합의 부적절한 표현으로 나타났다 실험 관측치와 더 잘 일치합니다. 부정확한 결론을 내리지 않으려면 모델을 신중하게 선택하고 동기를 부여하고, 적합도가 모델 사용을 지원하는지 확인하고, 결과를 신중하게 해석해야 합니다.

공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 대학원 연구 펠로우십(Graduate Research Fellowship)의 지원을 받았습니다. DGE-1745301(S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award(S.C.), Searle Scholar Award(S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant(S.C.), Merkin Innovation Seed Grant(S.C.), Mallinckrodt Research Grant(S.C.) 및 Margaret E. Early Medical Research Trust 2024 보조금(SC). 사우스캐롤라이나주는 또한 NIH/NCI의 지원을 받고 있습니다 P30CA016042.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1 & 마이크로; m TetraSpeck 미세구InvitrogenT7279단일 분자 이미징
25mm 직경, #1.5 CoverslipsMarienfeld Superior111650커버 슬립
593/40nm 대역 통과 필터준비 SemrockFF01-593/40-25단일 분자 이미징
676/37nm 대역 통과 필터SemrockFF01-676/37-25단일 분자 이미징
6-Well TC PlateGenesee25-105MP현미경 검사용 세포 준비
세포주: U-2 OSATCCHTB-96세포 내 단백질 라벨링
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		단일 분자 이미징 데이터 분석: Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957커버슬립 준비
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research Campus현미경 검사를 위한 세포 준비
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022세포 내 단백질 라벨링: 사용된 성장 배지: 5% 소 태아 혈청, 1% 펜스트렙이 포함된 DMEM
Eclipse Ti2-E 도립 현미경Nikon단일 분자 이미징
에탄올 200 ProofLab AlleyEAP200-1GAL커버슬립
evalSPT분석 준비: Drosopoulos et al., 2020
Fetal bovine serumCytivaSH30396.03세포 내 단백질 라벨링: 사용된 성장 배지: 5% 소 태아 혈청, 1% 펜스트렙
피지를 사용한 DMEM단일 분자 이미징 데이터 분석
Ikon Ultra CCD 카메라AndorX-13723단일분자 이미징
롱패스 이색성 빔스플리터SemrockDi02-R635-25x36단일분자 이미징: 적색/근적외선 빔스플리터
LUN-F 레이저 유닛니콘단일분자 이미징: 405/488/561/640
MatTek 유리 바닥 접시MatTekP35G-1.5-20-C현미경 검사용 세포 준비: 35mm, 세포 배양을 위한 #1.5 커버슬립 접시.
NIS-ElementsNikon단일 분자 이미징: 현미경 수집 소프트웨어
핵 및 클러스터 mask_v2.txt단일 분자 이미징 데이터 분석: Chong et al., 2018
Penicillin-StreptomycinGibco15-140-122세포 내 단백질 라벨링: 사용된 성장 배지: 5% 소 태아 혈청, 1% 펜스트렙
인산염 완충 식염수가함유된 DMEMThermo Fisher Scientific18912014세포 내 단백질 라벨링
광활성제 Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research Campus현미경 PLOT_ResidenceHist_css.m
단일 분자 이미징 데이터 분석: Available in Chong et al., 2018
Potassium HydroxideMallinckrodt Chemicals6984-06Preparation of the Cells 커버슬립
pretracking_comb.txt단일 분자 이미징 데이터 분석: 사용 가능: Chong et al., 2018
SLIMfastAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation systemTokai HitSingle-molecule imaging: 라이브 셀 이미징
TwinCam 이중 방출 이미지 스플리터Cairn Research단일 분자 이미징
초음파 세척기Branson5800커버 슬립 준비
을 위한 세포 준비

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