Aplysia californica의 뉴런 성장 콘 운동성 및지도 고해상도 이미지를위한 최고의 아르 문화의 큰 성장 콘을 개발. 여기서 우리는 절개 및 Aplysia 가방 셀 뉴런의 도금뿐만 아니라 라이브 셀 이미징을위한 챔버를 설정을위한 프로토콜을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
의 연결을 성장 콘은 환경에서지도 신호를 감지하고 적절한 대상 세포쪽으로 방향 움직임에이 정보를 transduce 수 axons의 끝에 높은 운동성이있는 구조입니다. 완벽하게지도 정보가 기본 동적 cytoskeletal 네트워크에 세포 표면에서 전달하는 방법 이해하기 위해서, 하나는 높은 시간적 및 공간적 해상도에서 단백질 역학 라이브 셀 이미징에 적합한 모델 시스템이 필요합니다. 전형적인 척추 성장 콘은 양적 F - 굴지와 미세 소관의 역학을 분석하는 너무 작은 수 있습니다. 군소 Aplysia californica에서 뉴런은 뉴런 척추보다 5-10 배 큰 쉽게 실온에서 보관 수 있으며, 미세 조작 및 biophysical 측정을 매우 강력한 세포 수 있습니다. 그들의 성장 콘은 매우 세포질 지역과 잘 설명 cytoskeletal 시스템을 정의했습니다. 의 연결을 세포 기관은 성장 콘 운동성 및지도를 공부에 대한 프로브의 다양한 microinjected 수 있습니다. 현재의 프로토콜에서는 복부 신경절, 가방 셀 뉴런의 문화와 성장 콘 라이브 셀 이미징에 대한 이미징 챔버를 설정 해부를위한 절차를 설명합니다.
프로토콜
솔루션
- L15 - ASW의 세포 배양 매체 (일리터)
- L15 가루 1 봉지
- H 2 O ultrapure 800 ML을 추가
- NaCl 400 MM
- MgSO 4 27 MM
- MgCl 2 28 MM
- L - 글루타민 4 MM
- Gentamicin 50 μg / ML
- HEPES 5 MM
- 산도 7.9로 조정
- (precipitates 경우 스톱) 드롭 CaCl 2 9.3 MM을 들러 추가
- 1리터에 H 2 O ultrapure 추가
- osmometer (증기압, Wescor # 5520)와 osmolarity (950-1000 mmol / kg)를 확인
- 긍정적인 압력 여과 장치 (Millipore의 SVGV010RS 필터)를 사용하여 필터 0.22 μm의
- 최대 1 개월 4 ° C에 보관
- 폴리 - L - 라이신은 (70-150 KD) 200 살균 H 2 O ultrapure에 μg / ML 주식 ....
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토론
Aplysia 가방 세포 뉴런은 거의 비의 연결을 세포와 혈청의 연결이없는 세포 배양 시스템을 제공합니다. 이러한 뉴런 중요한 세포 생물 학적 질문 숫자를 해결하기 위해 적합한 매우 큰 성장 원뿔을 형성합니다. 가방 세포 뉴런 쉽게 몇 시간 동안 조작하고 실온에서 몇 군데하실 수 있습니다. 형광등을 사용하면 하나 양적 F - 굴지와 미세 소관의 중합 및 translocation 역학의 다양한 매개 변수를 분석할 수 현미경 (FSM)을 스페클. 최근 출시된 Aplysia 게놈 정보뿐만 아니라 개선 표현 기법과 함께 이러한 이미징 도구의 연결을 성장 콘 운동성 및지도 분자 및 세포 메커니즘을 공부하고 이러한 뉴런은 강력한 모델 시스템을합니다.
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감사의 글
우리는 해부 비디오 편집과 지원을위한 절차와 로드니 맥페일을 (생물 과학학과, 퍼듀 대학교) 촬영을 위해 라이언 마네리을 (오이스터캐쳐 프로덕션, LLC) 감사드립니다. 수터 실험실 연구는 DMS에 퍼듀 대학에서 NIH (R01 NS049233)와 빈들리 Bioscience 센터에서 기금에 의해 지원됩니다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| #1 유리 커버슬립 22x22 mm | 도구 | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 유리 커버슬립 22x22 mm | 도구 | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm 페트리 접시 | 도구 | Falcon BD | 353001 | |
| 배지 여과용 필터 | 도구 | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| 고진공 그리스 | 도구 | Dow Corning | 1597418 | |
| 삼투압 측정기 | 도구 | Wescor | 5520 | |
| 플라스틱 심 | 도구 | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| 염화 칼슘 | 시약 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicin | 시약 | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | 시약 | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 배지 | 시약 | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | 시약 | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| 염화 마그네슘 | 시약 | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| 황산 마그네슘 | 시약 | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | 시약 | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| 염화 나트륨 | 시약 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| 중성 프로테아제 (Dispase) | 시약 | Worthington Biochemical | LS02111 |
참고문헌
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P.
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